本发明属于植物提取多糖的方法技术领域，具体涉及川贝母多糖的提取与分离纯化工艺。
背景技术：
川贝母为百合科贝母属植物，多年生草本，分布于四川、云南和四川等地。川贝母有润肺止咳的功效，目前，川贝母主要集中在其生物碱的研究，对川贝母多糖的提取与药理研究较少。
目前，川贝母多糖的提取与分离方法有热水浸提、乙醇提取，超声波提取和索式提取等方法。但这些常规方法提取率都偏低(2％左右)、纯度不高(80％左右)。
所以研究一种高效的川贝母多糖的提取与分离纯化技术对于川贝母产业的发展是至关重要的。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种川贝母多糖的提取与分离纯化工艺，所述工艺利用超临界CO2萃取技术提取川贝母多糖后，蛋白酶K处理除蛋白，CPC季铵盐沉淀，再经过离子交换层析进一步纯化。该法提取率及纯度高，可克服常规方法存在的提取率偏低、纯度不高等缺点。
为实现上述发明目的，具体提供了如下的技术方案：
川贝母多糖的提取与分离纯化工艺，包括如下步骤：
(1)川贝母多糖粗品的提取
(1.1)萃取：取川贝母鳞茎，烘干并粉碎至粒径小于60目，将粉碎后的川贝母鳞茎放至超临界CO2萃取釜中，封釜，排除空气，通入携带剂进行萃取得提取液，萃取温度为47.3℃，萃取压力为23.7MPa，萃取二氧化碳流量为20-28L/h，携带剂为蒸馏水，用量为390ml/kg，萃取2.5h；
(1.2)脱色：将步骤(1.1)所得提取液用1mol/L NaOH调至pH 7.8，并加入硅藻土加热煮沸5min脱色，减压过滤得滤液，所加入硅藻土与提取液的质量比为1.5％；
(1.3)浓缩干燥：将步骤(1.2)所得滤液于75℃水浴条件才减压浓缩至原体积的30％，再加入4倍体积的95wt％乙醇，搅拌，在3000r/min条件下离心10min得沉淀I，沉淀I分别用无水乙醇和乙醚洗涤，真空干燥得川贝母多糖粗品；
(2)川贝母多糖粗品的纯化
(2.1)除蛋白：以质量体积比1％取莼菜多糖粗品及蒸馏水并混合均匀，3000r/min离心10min除去不溶物，取上清液加入1/5体积的氯仿和戊醇混合液，3000r/min离心10min得上层清液I，所述混合液中氯仿和戊醇的体积比为5:1；
(2.2)纯化：向上层清液I加十六烷基氯化吡啶至沉淀完全，静置5h，3000r/min离心10min得沉淀II，沉淀II用70℃热水洗涤三次，然后向沉淀II加入2mol/L的NaCl溶液在60℃温度条件下解离4h，并在3000r/min离心10min得上层清液II；
(2.3)离子交换层析进一步纯化：将上层清液II通过DEAE-Sephadex柱吸附，冰水洗至澄清，用0.1mol/LNaCl洗脱，流速为0.2ml/min，收集洗脱液；
(2.4)透析、浓缩、干燥：将步骤(2.3)所得洗脱液使用蒸馏水透析18h，将所得透析液在75℃水浴条件下减压浓缩至原体积的30％，再加入4倍体积的95wt％乙醇，搅拌，3000r/min离心10min得沉淀III，沉淀III分别用无水乙醇和乙醚洗涤，真空干燥，得精制川贝母多糖。
优选的，步骤(2.2)所述十六烷基氯化吡啶质量分数为2％。
本发明的有益效果在于：
1)本发明采用超临界CO2萃取新技术，克服了常规方法存在的提取率偏低、纯度不高等缺点；
2).季铵盐十六烷基氯化吡啶能与贝母多糖在低离子强度的水溶液中沉淀出来，当高离子强度时，沉淀又可以溶解、解离、释放，纯化效果好；
3)利用DEAE-Sephadex离子交换层析，进一步去除一些不带电和带正电荷的杂质，分离纯化效果更好。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
以下实施例所用试剂及器材：超临界萃取系统(美国STF-100)、透析袋(Sigma)、DEAE-Sephadex离子交换树脂(上海恒信化学试剂有限公司)、常规化学试剂均购自北京鼎国生物技术有限公司。
实施例1
(1)川贝母多糖粗品的提取
(1.1)萃取：取川贝母鳞茎，烘干并粉碎至粒径小于60目，将粉碎后的川贝母鳞茎放至超临界CO2萃取釜中，封釜，排除空气，通入携带剂进行萃取得提取液，萃取温度为47.3℃，萃取压力为23.7MPa，萃取二氧化碳流量为20-28L/h，携带剂为蒸馏水，用量为390ml/kg，萃取2.5h；
(1.2)脱色：将步骤(1.1)所得提取液用1mol/L NaOH调至pH 7.8，并加入硅藻土加热煮沸5min脱色，减压过滤得滤液，所加入硅藻土与提取液的质量比为1.5％；
(1.3)浓缩干燥：将步骤(1.2)所得滤液于75℃水浴条件才减压浓缩至原体积的30％，再加入4倍体积的95wt％乙醇，搅拌，在3000r/min条件下离心10min得沉淀I，沉淀I分别用无水乙醇和乙醚洗涤，真空干燥得川贝母多糖粗品；
(2)川贝母多糖粗品的纯化
(2.1)除蛋白：以质量体积比1％取莼菜多糖粗品及蒸馏水并混合均匀，3000r/min离心10min除去不溶物，取上清液加入1/5体积的氯仿和戊醇混合液，3000r/min离心10min得上层清液I，所述混合液中氯仿和戊醇的体积比为5:1；
(2.2)纯化：向上层清液I加质量分数为2％的十六烷基氯化吡啶至沉淀完全，静置5h，3000r/min离心10min得沉淀II，沉淀II用70℃热水洗涤三次，然后向沉淀II加入2mol/L的NaCl溶液在60℃温度条件下解离4h，并在3000r/min离心10min得上层清液II；
(2.3)离子交换层析进一步纯化：将上层清液II通过DEAE-Sephadex柱吸附，冰水洗至澄清，用0.1mol/LNaCl洗脱，流速为0.2ml/min，收集洗脱液；
(2.4)透析、浓缩、干燥：将步骤(2.3)所得洗脱液使用蒸馏水透析18h，将所得透析液在75℃水浴条件下减压浓缩至原体积的30％，再加入4倍体积的95wt％乙醇，搅拌，3000r/min离心10min得沉淀III，沉淀III分别用无水乙醇和乙醚洗涤，真空干燥，得精制川贝母多糖。
多糖含量的测定
多糖含量采用硫酸-苯酚法进行检测。多糖在浓硫酸的作用下，脱水生成糖醛及其衍生物，与苯酚结合后产生黄色物质，该物质在490nm有最大吸光值，吸光值的大小与多糖含量呈正比。
(1)葡萄糖标准曲线的制作：
称取一定量的葡萄糖于105℃烘干至恒重后，准确称取0.100g，纯水定容至100mL，即得葡萄糖标准储备液。分别准确吸取0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL储备液，分别置于100mL容量瓶以纯水定容，配制成0，20，40，60，80，100μg/mL待测液。准确吸取1.0mL待测液于试管中，依次加入1mL 6％苯酚，5mL浓硫酸，混匀，室温静置30min。另取一只试管，准确吸取1.0mL纯水，依次加入1mL6％苯酚，5mL浓硫酸，混匀，室温静置30min，作为空白对照。490nm处测吸光值，以吸光度对葡萄糖浓度进行回归，得到回归方程y＝0.0111x-0.0098，R2＝0.9661。式中：y为在波长490nm处的吸光值，x为葡萄糖的浓度.(μg/mL)。
以总糖浸出率来评价多糖得率，总糖含量按以下公式计算：
总糖含量％＝(m’×V×N)/(Vs×m×106)×100％，式中：
m’：标准曲线上查得的葡萄糖含量，μg；
V：样液体积，mL；
N：稀释倍数；
Vs：测定时吸取样液的体积，mL；
m：样品的质量，g。
将川贝母多糖提取液定容至250mL容量瓶，准确吸取1.0mL于10mL容量瓶中，以纯水定容。混匀后准确吸取1.0mL待测液于试管中，依次加入1mL新鲜配制的6％苯酚，5mL浓硫酸混匀，室温静置30min。另取一只试管，准确吸取1.0mL纯水，依次加入1mL6％苯酚，5ml浓硫酸，混匀，室温静置30min，作为空白对照，于490nm处测定吸光值。
经含量测定，川贝母多糖提取率达到80％，纯度达到90.8％。
本发明采用超临界CO2萃取新技术，克服了常规方法存在的提取率偏低、纯度不高等缺点；季铵盐十六烷基氯化吡啶能与贝母多糖在低离子强度的水溶液中沉淀出来，当高离子强度时，沉淀又可以溶解、解离、释放，纯化效果好；利用DEAE-Sephadex离子交换层析，进一步去除一些不带电和带正电荷的杂质，分离纯化效果更好。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。