枸杞多糖在制备降低反刍动物瘤胃产气量的饲料添加剂中的用途的制作方法

本发明涉及一种枸杞多糖在制备降低反刍动物瘤胃产气量的饲料添加剂中的用途。

背景技术：

反刍是指牛羊等反刍动物采食经过一段时间后将胃中半消化的食物返回嘴里再次咀嚼的过程。反刍动物是具有反刍现象的动物，通常是一些食草动物，因为粗饲料中的植物纤维比较难消化，所以需要通过反刍来促进粗饲料的消化。多数反刍动物的胃包括4部分，分别为瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃。其中，瘤胃是牛羊等反刍动物的第一胃，反刍动物采食的饲料首先进入瘤胃，在瘤胃内饲料经过瘤胃液的亲润、切断、物理混合以及瘤胃微生物发酵的过程，饲料中的大分子被降解为小分子物质，被动物吸收利用或排除体外。瘤胃中包含大量的微生物，包括细菌、真菌、原虫和古菌。这些微生物产生的酶能够有效降解反刍动物采食的粗饲料等难于降解的成分，而瘤胃本身是不会产生此类降解酶。瘤胃内食物在被微生物分解的过程中，会产生一定的气体。

瘤胃中微生物发酵产生的气体通过食管向外排出的过程，称为嗳气。牛每小时约嗳气17-20次。嗳气的次数决定于气体产生的速度。正常情况下瘤胃中所产生的气体和通过嗳气等所排出的气体之间维持相对平衡。如产生的气体过多，不能及时排出，可形成瘤胃急性胀气。瘤胃胀气是反刍动物采食了大量易发酵的牧草、饲料等，在瘤胃微生物的作用下过度发酵，产生大量的气体，以致于瘤胃和网胃迅速扩张而引起的疾病。瘤胃嗳气排出的气体以甲烷和二氧化碳为主，二者均为温室气体，可导致全球气候变暖等一系列问题。同时，反刍动物排出甲烷气体也是一种能量浪费。因此，有效降低反刍动物气体排放和降低瘤胃胀气发病对动物健康和高效生产具有重要作用。

目前，对于反刍动物的瘤胃调控的添加剂研究较多的是植物或植物提取物等。例如，单宁酸、皂苷、类黄酮和其他的植物次级代谢物已经被证明能提高瘤胃发酵。单宁和皂素可以有益调节瘤胃发酵，减少瘤胃中蛋白质的降解，防止瘤胃胀气，抑制产甲烷菌并提高共轭亚油酸浓度。功能性多糖添加在动物饲粮中可提高动物的免疫力和改善单胃动物的生产性能，且不良反应小，是一种较为理想的饲料添加剂。功能性多糖普遍存在于自然界中，它在植物体内起着支持组织和贮存养料的作用。近年来随着许多功能性多糖生物活性的发现，其在动物生产中的应用研究日益受到人们的重视。

枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharide)是从枸杞中提取得到的一种水溶性多糖，由各种单糖通过糖苷键相连接，是枸杞的有效成分之一，枸杞的药理和保健作用与枸杞多糖的含量有很大关系。枸杞多糖是植物多糖中少有的含蛋白质多糖，其可提高机体免疫力，增强造血功能，保肝降压，增强细胞活性，且无任何毒副作用，在食品和医药领域具有广阔的应用前景。但目前还未见关于枸杞多糖在调节反刍动物瘤胃发酵中降低产气量应用的相关报道。

技术实现要素：

针对现有技术，本发明提供一种枸杞多糖在制备反刍动物瘤胃饲料添加剂中的用途，经研究发现，反刍动物经食用枸杞多糖后，能够显著降低瘤胃内的总产气量。

本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个发明目的是提供一种枸杞多糖在制备降低反刍动物瘤胃产气量的饲料添加剂中的应用。

进一步的，所述反刍动物为牛或羊。经过研究，本发明首次发现，在反刍动物(特别是牛或羊)的饲料中加入一定量的枸杞多糖，对反刍动物的瘤胃微生物发酵具有良好的调节作用，可调控瘤胃微生物区系、种属结构及其发酵模式，从而能够抑制原虫和甲烷菌，降低反刍动物瘤胃产气量，同时还可以提高反刍动物饲料中干物质和粗蛋白的降解率及饲料中能量的利用效率。

更进一步的，所述反刍动物为奶畜(奶牛或奶山羊)。从综合效果来讲，最佳的，所述奶畜为泌乳高峰期的奶牛或奶山羊。泌乳高峰期是奶畜一生中最重要的时期，密切关系到奶畜的泌乳与繁殖性能，奶畜在此阶段的激素水平、瘤胃功能、能量的代谢以及免疫力都发生了一系列巨大的变化。奶畜在泌乳高峰期时为保证较高的奶产量和乳品质，需要大量且快速的提高饲料采食量，且采食的饲料中富含易于发酵的碳水化合物等成分，极易造成奶畜的瘤胃胀气。反刍动物的能量代谢不同于其他动物，主要靠瘤胃微生物产生的乙酸、丙酸等挥发性脂肪酸供能，丙酸可通过糖异生转化为葡萄糖，葡萄糖是反刍动物最重要的能量供给形式。因此，瘤胃健康及高效发酵对奶畜健康及高效生产具有重要作用。经过试验发现，添加枸杞多糖可显著降低泌乳高峰期的奶牛或奶山羊中瘤胃中气体生成及排放，降低嗳气发病率，并在不影响瘤胃功能的情况下可提高动物能量平衡。

上述应用中，所述枸杞多糖是通过下述方法制备得到的：

(1)将枸杞原料干燥，粉碎，经超临界co2萃取，萃取压力为25-30mpa，co2流量为28-32l/h，萃取时间为2-3h，夹带剂为90-95％(体积分数)乙醇，夹带剂用量为枸杞原料(干燥后)重量的5-8％，经萃取后的物料即为脱脂后的枸杞颗粒；

(2)向脱脂后的枸杞颗粒加入8-12倍重量的水，超声提取，超声提取功率为300-400w，超声时间为20-40min，得超声提取液；

(3)向超声提取液中加入体积分数为70-80％的乙醇溶液进行醇析，将醇析后的析出液浓缩、干燥，即得枸杞多糖。

优选的，步骤(1)中，超临界co2萃取，萃取压力为25mpa，co2流量为30l/h，萃取时间为2.5h，夹带剂的用量为枸杞原料重量的6％。本发明在提取枸杞多糖时，采用超临界co2萃取技术对枸杞进行脱脂，可以脱除枸杞中的脂类、胶类、色素等脂溶性物质，提高了枸杞多糖的溶解性和分散性，降低了其溶出阻力，多糖与水的接触面积及亲和力大幅度增加，从而提高了枸杞多糖的提取率。

本发明还对超临界co2萃取的萃取条件进行了优化，采用本发明的萃取条件，可以提高对枸杞中油脂的脱除效率，进而提高枸杞多糖的提取率，改善枸杞多糖的风味和品质。

优选的，步骤(2)中，超声提取的功率为350w，超声时间为25min。本发明对脱脂后的枸杞颗粒采用超声提取，并对超声提取工艺条件进行了优化，其工艺流程简单，工序少，提取时间短，节约资源，生产成本较低，而且多枸杞多糖的提取率高。

优选的，步骤(3)中，乙醇溶液的加入量为超声提取液的2-4倍体积，醇析时间为2-4h，醇析温度为2-4℃。

与其他提取方法制备得到的枸杞粗多糖，本发明的提取方法得到的枸杞多糖提取物，在作为降低反刍动物瘤胃产气量的饲料添加剂时，效果显著突出。而对于产生这种效果的原因是，将超临界co2萃取方法和超声提取方法相结合，加大了传质效率，有助于溶质的扩散，使得枸杞多糖有效成分得到最大程度的释放而其分子结构不被破坏。故该提取方法得到的枸杞多糖提取物的多糖有效含量较高，在作为降低反刍动物瘤胃产气量的饲料添加剂时，效果显著突出。

枸杞多糖的添加浓度非常重要，因为高浓度的枸杞多糖可能会抑制瘤胃的正常发酵。优选的，在反刍动物的饲料中添加0.1-0.5％(w/w)的枸杞多糖(即枸杞多糖的质量为饲料质量的0.1-0.5％)，能降低瘤胃中甲烷气体的产量，防止瘤胃胀气。

基于枸杞多糖能够降低反刍动物瘤胃产气量的特点，经过研究发现，本发明的第二个目的是提供一种枸杞多糖在制备预防或辅助治疗反刍动物瘤胃胀气药物中的应用。

上述技术方案中具有如下有益效果：

(1)本发明首次发现枸杞多糖能够在制备降低反刍动物瘤胃产气量的饲料添加剂中进行应用，在反刍动物的饲料中添加0.1-0.5％的枸杞多糖，能显著降低瘤胃中甲烷气体的产量，防止瘤胃胀气。同时，枸杞多糖还可提高反刍动物饲料中干物质和粗蛋白的降解率，有效提高饲料的利用率。

(2)本发明研究了枸杞多糖的提取方法对反刍动物瘤胃产气量的影响。研究发现，采用本发明超临界co2萃取方法和超声提取方法相结合的方法，在作为降低反刍动物瘤胃产气量的饲料添加剂时，效果显著突出。

(3)经本发明的研究发现，在反刍动物中尤其是对泌乳高峰期的奶牛或奶山羊的综合效果最佳，添加枸杞多糖可显著降低气体的生成，并在不影响瘤胃功能的情况下可提高动物能量平衡。故从经济成本和饲喂效果来看，本发明的枸杞多糖更加适用于泌乳高峰期的奶牛或奶山羊。

附图说明

图1是功能性多糖对48h产气量影响的柱状图。

图2是功能性多糖对24h干物质降解率影响的柱状图。

图3是功能性多糖对48h干物质降解率影响的柱状图。

图4是功能性多糖对24h粗蛋白降解率影响的柱状图。

图5是功能性多糖对48h粗蛋白降解率影响的柱状图。

图6是枸杞多糖对不同生长阶段的奶牛36h产气量影响的柱状图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。

实施例1枸杞多糖的制备

(1)将枸杞原料干燥，粉碎，过70目筛，经超临界co2萃取，萃取压力为28mpa，co2流量为30l/h，萃取时间为2.5h，夹带剂为90％(体积分数)乙醇，夹带剂用量为枸杞原料(干燥后)重量的8％，经萃取后的物料即为脱脂后的枸杞颗粒；

(2)向脱脂后的枸杞颗粒加入10倍重量的水，超声提取，超声提取功率为320w，超声时间为30min，得超声提取液；

(3)向超声提取液中加入体积分数为70％的乙醇溶液进行醇析，乙醇溶液的加入量为超声提取液的3倍体积，醇析时间为3h，醇析温度为3℃，将醇析后的析出液浓缩、干燥，即得枸杞多糖，经检测，枸杞多糖提取物的得率为5.56％，采用苯酚-硫酸比色法检测枸杞多糖提取物中的枸杞多糖的含量为91.72％。

多糖提取物得率(％)＝枸杞粗多糖质量(g)÷干燥后的枸杞原料质量(g)×100％。

实施例2枸杞多糖的制备

(1)将枸杞原料干燥，粉碎，过80目筛，经超临界co2萃取，萃取压力为30mpa，co2流量为28l/h，萃取时间为3h，夹带剂为95％(体积分数)乙醇，夹带剂用量为枸杞原料(干燥后)重量的5％，经萃取后的物料即为脱脂后的枸杞颗粒；

(2)向脱脂后的枸杞颗粒加入12倍重量的水，超声提取，超声提取功率为400w，超声时间为20min，得超声提取液；

(3)向超声提取液中加入体积分数为75％的乙醇溶液进行醇析，乙醇溶液的加入量为超声提取液的2倍体积，醇析时间为2.5h，醇析温度为4℃，将醇析后的析出液浓缩、干燥，即得枸杞多糖，经检测，枸杞多糖提取物的得率为5.60％，采用苯酚-硫酸比色法检测枸杞多糖提取物中的枸杞多糖的含量为93.11％。

实施例3枸杞多糖的制备

(1)将枸杞原料干燥，粉碎，过80目筛，经超临界co2萃取，萃取压力为25mpa，co2流量为32l/h，萃取时间为2h，夹带剂为90％(体积分数)乙醇，夹带剂用量为枸杞原料(干燥后)重量的6％，经萃取后的物料即为脱脂后的枸杞颗粒；

(2)向脱脂后的枸杞颗粒加入8倍重量的水，超声提取，超声提取功率为350w，超声时间为25min，得超声提取液；

(3)向超声提取液中加入体积分数为80％的乙醇溶液进行醇析，乙醇溶液的加入量为超声提取液的3倍体积，醇析时间为2h，醇析温度为2℃，将醇析后的析出液浓缩、干燥，即得枸杞多糖，经检测，枸杞多糖提取物的得率为5.39％，采用苯酚-硫酸比色法检测枸杞多糖提取物中的枸杞多糖的含量为92.18％。

对比例1枸杞多糖的制备

称取24g干枸杞，粉碎后放入800ml烧杯中，加入500ml蒸馏水，热水提取1.5h。过滤，加入1/4体积的三氯甲烷-正丁醇(体积比为5：1)，剧烈震荡20min，3000rpm离心25min，弃去中间变性蛋白和氯仿层，留用上清液。上清液于85℃水浴搅拌浓缩至50ml。在搅拌状态下，将浓缩液加入3倍体积90％乙醇中，室温静置1h，3000rpm离心10min，固形物用90％乙醇洗涤，3000rpm离心10min，然后再用无水乙醇洗涤，3000rpm离心10min，真空干燥，得到1.44g枸杞粗多糖提取物，枸杞多糖提取物的得率为6％，采用苯酚-硫酸比色法检测枸杞多糖提取物中的枸杞多糖的含量为50.98％。

实验例1枸杞多糖对反刍动物瘤胃产气量的影响

(1)试验动物及饲养管理

选择8只健康泌乳期奶牛为试验动物。基础日粮组成(以风干样计)为：日粮精粗质量比为40：60，粗饲料中青贮玉米和苜蓿按照质量比1：1提供，精料补充料包括58％玉米、18.3％小麦麸、23％大豆粕、小苏打0.7％(w/w)。每天早上9：00和下午5：30定量饲喂，充足自由饮水。

(2)试验样品

向精粗质量比为40：60的日粮中添加0.1％(w/w)的实施例1制备的枸杞多糖1、对比例1制备的枸杞多糖2、葡萄糖、黄芪多糖、低聚木糖、低聚果糖和壳聚糖，以不添加多糖作为空白对照。

(3)试验方法

采用反刍动物体外发酵技术研究添加不同种类的多糖对瘤胃发酵产气量的影响。

晨饲前，应用口腔套管从8头奶牛瘤胃的上中下3个不同位点采集瘤胃液，经4层纱布过滤后按照1：2的体积比例接种到含有底物(基础日粮)和磷酸缓冲液的发酵瓶中，并向发酵瓶中持续注入co2调节ph至6.8。

分别向发酵瓶中添加枸杞多糖提取物(实施例1制备)、枸杞多糖提取物(对比例1制备)、葡萄糖、黄芪多糖、低聚木糖、低聚果糖和壳聚糖后加塞密封。通过气路导管将发酵瓶与体外发酵产气自动记录装置连通，并由装置实时自动记录发酵产气量，发酵瓶在39℃下持续培养48h，记录发酵产量。

(2)试验结果

枸杞多糖对反刍动物瘤胃产气量的影响结果见图1，由图1可得，黄芪多糖能够显著降低反刍动物瘤胃产气量，与其他功能性多糖具有差异显著性；实施例1的方法得到的枸杞多糖提取物与对比例1相比，降低产气量显著突出，说明不同方法制备得到的枸杞多糖效果上具有一定的差异；也说明了本发明在专门制备降低反刍动物瘤胃产气量的饲料添加剂时，应选择本发明实施例1中的提取方法更为合适，可有效缓解泌乳期奶牛的瘤胃胀气。

另外，本发明还测了ph、乙酸、丙酸、乙丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和总挥发性脂肪酸(tvfa)等参数，检测结果具体如下表1：

表1功能性多糖对瘤胃ph和vfa的影响

由表1可知，不同种类的功能性多糖对瘤胃中的各气体浓度的影响各不相同，与其他种类的功能性多糖相比，采用本发明的枸杞多糖能有效调控反刍动物瘤胃的功能，提高微生物活性和挥发酸产量，这有利于泌乳期奶牛体重的增加，在不影响瘤胃功能的情况下可提高动物能量平衡。

综上，从图1和表1来看，与其他功能性多糖相比，枸杞多糖在降低反刍动物瘤胃产气量的效果上显著突出。

实验例2研究枸杞多糖对饲料干物质和粗蛋白降解率的影响

枸杞多糖对饲料干物质和粗蛋白降解率的调控

(1)试验动物及饲养管理

选择8只安装有永久性瘤胃瘘管的健康西农萨能奶山羊为试验动物。基础日粮组成(以风干样计)为：日粮精粗质量比为40：60，粗饲料中青贮玉米和苜蓿按照质量比1：1提供，精料补充料包括58％玉米、18.3％小麦麸、23％大豆粕、小苏打0.7％(w/w)。每天早上9：00和下午5：30定量饲喂，充足自由饮水。

(2)试验样品

向精粗质量比为40：60的日粮中添加0.1％的实施例1制备的枸杞多糖、葡萄糖、黄芪多糖、灵芝多糖、低聚木糖、低聚果糖和壳聚糖，以不添加多糖作为空白对照。

(3)试验方法

选择孔径为300目的尼龙布，制成8×12cm的尼龙袋，分别称取试验样品7.5g(精粗比为40：60的tmr日粮)放入尼龙袋中，用橡皮筋扎好，然后将尼龙袋固定在一根长20cm的半软尼龙管的一端，在晨饲前1h放入瘤胃内，培养时间分别为24h和48h，连续取样、放样，在规定时间内取出尼龙袋，并用大量的水清洗，直至水澄清为止。然后将洗干净的尼龙袋65℃烘干至恒重。将尼龙袋中的降解样倒出后，洗净，同样65℃烘干至恒重，测定降解前后饲料原料的干物质和粗蛋白的降解率，测定方法参考《饲料质量与安全检测技术》。

(4)试验结果

不同种类的功能性多糖对饲料原料干物质的降解率结果分别见图2和图3；不同种类的功能性多糖对饲料原料的粗蛋白降解率结果见图4和图5。

由图2～5可得，不同种类的功能性多糖对反刍动物饲料原料中的干物质和粗蛋白的降解效果差别较大。与其他的功能性多糖相比，在饲料中添加本发明制备的黄芪多糖，在48h内饲料的粗蛋白的降解效果明显优于其他种类的功能性多糖。

实验例3枸杞多糖对不同生长阶段奶牛瘤胃产气量的影响

(1)试验动物及饲养管理

选择不同生长阶段(每阶段3只)健康奶牛为试验动物，不同生长时期是指：小育成牛阶段(6-12个月龄)、大育成牛阶段(12月龄-配孕)、妊娠期、围产期(产前3周和产后3周)、泌乳高峰期(自分娩后至200天)、干乳期(自停奶日期至分娩日期之前)。

基础日粮组成(以风干样计)为：日粮精粗质量比为40：60，粗饲料中青贮玉米和苜蓿按照质量比1：1提供，精料补充料包括58％玉米、18.3％小麦麸、23％大豆粕、小苏打0.7％(w/w)。每天早上9：00和下午5：30定量饲喂，充足自由饮水。

(2)试验样品

向精粗质量比为40：60的日粮中添加0.1％的实施例1制备的枸杞多糖，以不添加多糖作为空白对照。

(3)试验方法

采用反刍动物体外发酵技术研究添加枸杞多糖对不同生长阶段的奶牛瘤胃发酵产气量的影响。每个生长时期的试验重复三次。

晨饲前，从试验奶牛瘤胃的上中下3个不同位点采集瘤胃液，经4层纱布过滤后按照1：2的体积比例接种到含有底物(基础日粮)和磷酸缓冲液的发酵瓶中，每个发酵瓶中含有5g底物，并向发酵瓶中持续注入co2调节ph至6.8。

分别向发酵瓶中添加枸杞多糖(实施例1制备)加塞密封。通过气路导管将发酵瓶与体外发酵产气自动记录装置连通，并由装置实时自动记录发酵产气量，发酵瓶在39℃下持续培养36h，记录发酵产量。

(4)试验结果

枸杞多糖对反刍动物瘤胃产气量的影响结果见图6，由图6可得，黄芪多糖对各个生长阶段的奶牛瘤胃的产气量的影响差别较大，经过试验验证，黄芪多糖能够显著降低泌乳高峰期奶牛瘤胃产气量，与其他生长阶段的奶牛瘤胃的产气量相比具有差异显著性。

实验例4应用

本发明经过大量的应用实践得到：黄芪多糖能够显著降低泌乳高峰期奶牛瘤胃产气量，与其他生长阶段的奶牛瘤胃的产气量相比具有差异显著性，具有统计学意义。以下是其中的一个应用案例。

瘤胃膨胀治疗的关键就在于排出已产生的气体和制止瘤胃内容物持续大量的发酵产气。

2015年7月某养殖小区一头泌乳奶牛，上午采食大量的精料，下午出现腹部鼓胀。经检测发现患牛营养良好，t38.5℃，p80次/分，r38次/分，嗳气及反刍较弱，瘤胃蠕动音减弱。选用实施例1中的枸杞多糖5g/kg(每千克常规药物加入5g枸杞多糖)和常规的药物配方(松节油50-60ml、鱼石脂20-30g、酒精100-150ml)，服用量为服用1次，患牛投服后，6min后开始嗳气，15min后胃蠕动音增强，腹围逐渐缩小，经35min腹胀基本消失，其症状也逐渐好转，2小时后出现反刍，并不再复发。

常规方法的药物配方加入枸杞多糖后对泌乳奶牛瘤胃膨胀的治疗效果优异，能够缩短治愈时间。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。