一种梨果皮组织多糖中单糖含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种糖含量测定方法，具体涉及以一种梨果皮组织多糖中单糖含量的测定方法。
【背景技术】
[0002]目前，测定植物多糖中单糖组分的方法技术主要集中在当归、仙人掌、枸杞、银耳以及龙眼果肉部分，关于果皮组织多糖中单糖含量的测定方法却很少。而且这些方法所需样品量多，步骤繁琐且所需样品原材料多，而获取梨幼果期所产生的果皮样品费时、费工，对想要探索多糖中不同单糖组分在梨不同时期果皮中变化规律、果皮结构和功能中的作用带来了困难。
[0003]梨是我国第三大水果产业，为消费者最喜欢的水果之一。梨果皮多糖中单糖组分含量测定不仅有助于果皮结构的研宄，也为分析果皮中营养成分及价值提供理论依据。目前，测定样品多糖中单糖组分需要试材较多，如果样品较少，导致提取粗多糖的量较少而无法进行后续工作。因此，开发出一种高效、精确和需样量少测定梨果皮多糖中单糖组分的方法变得尤为重要。
【发明内容】
[0004]本发明利用高效液相色谱法，测出梨果皮多糖中不同单糖组分的含量，该方法不仅有效提高多糖中单糖组分含量提取率，而且准确度高、重复性好。
[0005]本发明一方面涉及一种梨果皮组织多糖中单糖含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0006]I)称取定量果皮，用石油醚提取，过滤，收集滤渣，残渣用去离子水热提取，上清液减压浓缩至初始体积的1/3，加入无水乙醇，混匀，静置24h，离心得沉淀；沉淀配成水溶液，加入Sevage试剂震荡，离心，经真空冷冻干燥，得样品I ;
[0007]2)将样品I溶于纯水中，过0.45 μ m膜，取滤液置于安瓿瓶中，加入三氟乙酸，充队后封管，100-120°C条件下反应0.5-5h，冷却至室温，减压蒸干后向安瓿瓶中加入甲醇再次蒸干，重复操作2-5次，用纯水复溶，过0.45 μ m膜，得样品II备用；
[0008]3)取样品II，置于容器中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液，混匀后反应，反应结束后试管冷却至室温，用HCl中和反应体系，加入氯仿充分震荡，静置，弃去下层有机相，重复2-5次，加水稀释后过0.45 μ m滤膜后进行HPLC分析。
[0009]优选地，所述测定方法还包括标准溶液配制步骤，具体为分别配制葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、甘露糖6种单糖标准品组成的标准储备液，4°C条件下保存备用，标准品工作液由储备液进一步稀释得到6个浓度，过0.45 μ m膜后进行HPLC分析。
[0010]优选地，所述测定方法中，HPLC的分析条件为流动相为20mmol/L磷酸盐缓冲液-乙腈，优选地，其体积比为83: 17 ;优选地，流速为lmL/min，检测波长245nm，柱温30°C，进样量20yL，检测时间:30min。
[0011]优选地，所述梨是‘砀山酥梨’(绿皮梨)及其褐皮芽变‘锈酥’(褐皮梨)。
[0012]优选地，所述步骤I)中，石油醚提取的温度为70°C ;所述步骤I)中，热提取的温度为80°C ；
[0013]优选地，所述步骤I)为，称取定量果皮，用4-8倍体积的石油醚70°C提取l_4h，过滤，收集滤渣，残渣用8-12倍体积的去离子水进行热提取2-5次，水浴温度80°C，每次提取时间l_4h，提取液离心、合并上清液，置旋转蒸发仪40-60°C减压浓缩至初始体积的1/3，加入2-5倍浓缩液体积的无水乙醇，混匀，静置24h，离心得沉淀，沉淀配成5 %的水溶液，加入1/3体积的Sevage试剂，震荡25min,离心，经真空冷冻干燥，得样品I。
[0014]最优选地，所述步骤I)为，称取定量果皮，用6倍体积的石油醚70°C提取2h，过滤，收集滤渣，残渣用10倍体积的去离子水进行热提取3次，水浴温度80°C，每次提取时间2h,提取液离心、合并上清液，置旋转蒸发仪50°C减压浓缩至初始体积的1/3，加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，混匀，静置24h，离心得沉淀，沉淀配成5%的水溶液，加入1/3体积的Sevage试剂，震荡25min,离心，经真空冷冻干燥，得样品I。
[0015]优选地所述的步骤2)为，将粗多糖样品溶于纯水中，过0.45 μ m膜，取滤液置于安瓿瓶中，加入4mol/L三氟乙酸，充队后封管，110°C条件下反应2h，冷却至室温，减压蒸干后向安瓿瓶中加入甲醇再次蒸干，重复操作3次，用纯水复溶，过0.45 μπι膜，得样品II备用。
[0016]优选地，所述的步骤3)为，取样品II，置于5mL具塞试管中，加入0.3mol/L NaOH溶液，0.5mol/L PMP甲醇溶液，混匀后70°C水浴反应2h，反应结束后试管冷却至室温，用0.3mol/L HCl中和反应体系，加入氯仿充分震荡，静置，弃去下层有机相，重复3次，加水稀释后过0.45 μ m滤膜后进行HPLC分析。
[0017]本发明的有益效果
[0018](I)本发明在处理样品时米用石油酿先提取，米用液氣研磨，米用Sevage试剂进行后处理，用冷冻干燥处理样品，有效的保持原材料的成分且提取效率高。
[0019](2)本发明在采用TFA强酸性处理后利用甲醇溶解蒸干，用PMP处理后各种单糖成分具有紫外吸收，得以检测且以上试剂用量检测时峰形较好，采用柱温30°C，流动相为磷酸缓冲溶液(PH = 6.8)-乙腈(体积比为83: 17)，流速为lml/min，检测波长为245nm，进样量为20 μ L，对单糖达到了较好的分离结果，使最终检测结果准确率高。
【附图说明】
[0020]图1不同多糖中不同单糖的出峰时间；
[0021]图2，即，2A-2F不同时期‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮多糖中各单糖组分含量；
【具体实施方式】
[0022]实施例1
[0023]I仪器与样品
[0024]1.1 仪器:安捷伦 1260 HPLC system (Agilent Technologies, USA)。色谱柱:ZORBAX SB-C18 column(4.6m*150mm*5μm, Agilent, USA)。
[0025]样品:‘砀山酥梨’(绿皮梨)及其褐皮芽变‘锈酥’(褐皮梨)花后25d、50d、75d、100d、125d 和 150d 的果皮。
[0026]2方法与结果
[0027]2.1称取不同时期梨皮2g，用6倍体积的石油醚70°C提取2h，过滤，收集滤渣，残渣用10倍体积的去离子水进行热提取3次，水浴温度80°C，每次提取时间2h。提取液离心、合并3次上清液，置旋转蒸发仪50°C减压浓缩至初始体积的1/3，加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，混匀，静置24h，离心得沉淀。沉淀配成5%的水溶液，加入1/3的Sevage试剂(氯仿:正丁醇=4:1)震荡25min，离心，经真空冷冻干燥