专利名称：一种海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种大分子化合物的测定方法，特别是涉及一种海参 及海参制品中海参多糖含量的测定方法。
背景技术：
海参多糖是海参中一种重要的活性成分。海参中多糖类化合物结 构复杂，且因海参种类和生长环境的不同而有差别。不同种类海参中
的多糖结构不同，而同种海参中海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)和海 参硫酸软骨素(SC-CHS)的含量也不尽相同。另外，海参中还含有大 量的蛋白质、多糖、脂肪、微量元素等复杂成分，这必然会给海参中 总多糖的测定带来很多困难。
目前已有关于海参中多糖含量测定方法的报道，如申请号为 200410036250.7的"测定海参多糖含量的方法"，该方法对干海参样 品经碱溶，超声提取，二次醇沉等步骤，最后将样品干燥至恒重后测 得多糖含量，但该方法对目标测定物的选择性不强，样品中的杂质如 盐、微量元素、蛋白质等成分易引起较大的测定误差，且不适合海参 制品中海参多糖含量的测定；申请号为200410048001的"测定卢荟多 糖的新方竭"采用了分光光度法测定芦荟多糖，具有较好的重复性和 精密度，然而因为海参多糖中含有葡萄糖醛酸和氨基糖，在该方法中 不显色，所以也不适合海参多糖含量的测定；近年来以高效液相为基 础的海参多糖的定量方法发展较快，如申请号为200410052907.9的 "一种多糖定量检测方法与系统"，该方法灵敏准确，但对设备要求较 高，而且该方法通常适用于以中性糖含量为主的多糖，海参多糖中的 含有较高含量的糖醛酸和氨基糖，用该方法不能够柱后显色。另外， 海参多糖中两种糖的种间差异大，无法确定具体以何种多糖作为标准 品进行分光光度或者液相色谱测定。随着人们生活水平的提高，与海 参相关的食品、保健品和药品日益成为市场消费的热点和主流。海参 多糖作为主要的活性成分，其含量对其食用及药用价值影响很大，是 不可或缺的海参营养评价指标。因此迫切需要建立一种简便可信的海 参多糖测定方法。而市面上目前的海参制品品种复杂，因此采用简单 的分光光度法或称重法很难满足以海参多糖为评价指标建立海参制品 质量标准的要求。 发明内容本发明目的在于提供一种海参及海参制品中海参多糖含量的测定 方法，它无需复杂的前处理，取样少、简便、灵敏、快速、准确，能 满足以海参多糖为评价指标建立海参制品质量标准的要求。
一种海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法，其特征在于 (l)取海参或海参制品，用蛋白酶于缓冲业液中酶解，将酶解液离心， 取上清液用2-5倍体积的乙醇使海参多糖沉淀，离心，所得沉淀用水
溶解后定容至l-100ml; (2)取O.l-lml所得水溶液，加入等体积 0.5-6mol/L的三氟乙酸水溶液，氮气封管，在100-120。C下水解1-12h; 将所得水解液吹干和/或加碱中和，用水定容至0.1-10ml，过滤，作为 供试液；(3)精确称取岩藻糖标准品，配成浓度为0.01mmol/L-lmmol/L 呈梯度的多个标准水溶液；(4)分别精密吸取相同体积的上述多个标 准水溶液，分别加入0. 1-0.5mol/L的NaOH水溶液和等体积的1_苯 基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生试剂，50-70"C下水浴衍生0.2-2h，冷却， 用酸的水溶液中和至中性，用氯仿萃取，吸弃下层，重复萃取2-6次， 将水层过滤，进行液相色谱分析，得到分离谱图，以所得谱图中岩藻 糖的峰面积对岩藻糖的浓度进行线性回归，得到回归方程；(5)取上 述供试液进行衍生和液相色谱分析，以岩藻糖衍生物的峰面积代入上 述回归方程中，求出样品中岩藻糖的含量；将岩藻糖的含量乘以转化 系数即得海参样品中海参多糖的含量。
本发明的优点在于(1)操作简便，只需对样品进行简单的粗提取 等预处理，便可以直接经过酶解进行水解。(2)灵敏度高，岩藻糖衍 生物在250nm有很强的吸收，检测限可以达到0.37 y M。 (3)取样少， 所需海参样品可小于0.01克干重。(4)适用范围，可同时应用于固态、 液态等多种海参制品中海参多糖含量的测定。(5)检测时间短，单个 测定耗时仅为3h左右；由于可同时进行水解、衍生等步骤，因此也适 用于大批量测定。(6)稳定性好，24小时内岩藻糖衍生物峰面积稳定， RSD〈2.5%。 (7)本方法可同时测定海参制品中葡萄糖醛酸的含量，可 同时用于鉴定海参制品中的实际添加海参样品量。
附图1为单糖标准品高效液相色谱分离图。
附图2为刺参粗多糖的单糖组成分析图。
附图3为海参肽中海参多糖的单糖组成液相色谱图。
具体实施例方式
实施例1海参肽中多糖含量的测定 (1)精确称取样品A海参肽6g，研细，加入30ml的浓度为0.05M/L、 pH为6的醋酸钠缓冲液和100mg的木瓜蛋白酶，于37。C反应24h后， 离心，取上清液并加入2倍体积的乙醇，使酶解后产生的海参多糖沉淀，离心所得沉淀用水溶解后定容至3ml;
(2) 取0. 5ml所得的液体加入等体积2mol/L的三氟乙酸(TFA)水 溶液于12(TC水解2小时，将所得水解液以氮气吹干，以O. 3M氢氧化 钠水溶液中和，用水定容至2ml后作为样品供试液。
(3) 精确称取岩藻糖标准品用水配成lmmol/L的水溶液作为储备液。 进一步依次稀释成0. 01mmol/L、 0. 05mmol/L、 0. lmmol/L、 0. 2mmol/L、 0.4mmol/L、 0. 6mmol/L、 0. 8mmol/L和1. 0mmol/L的8个浓度梯度的 标准水溶液。
(4) 标准物质的衍生分别吸取上述浓度的标准水溶液各250u L， 分别加入浓度为0. 5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液 250 uL和等体积的0.3mol/L的氢氧化钠水溶液，70°C衍生反应 30min，冷却10min,用0.3mol/L盐酸中和至中性；加入lmL氯仿萃 取，充分震荡，吸弃下层，重复萃取3次，水层过滤后作高效液相色谱分 析。
液相色谱分离和所得工作曲线Z0RBAX Eclipse XDB-C18型色谱 柱；流动相采用梯度洗脱模式，流动相采用乙腈-0. 05mol/L磷酸二氢 钾缓冲溶液，30分钟内实现从15%-40%的乙腈梯度；温度25。C;流 速1 mL / min，检测波长250nm。上述8个浓度梯度的标准水溶液的 衍生液经液相色谱分析，得到岩藻糖的出峰时间为22.5min，以岩藻 糖峰面积对岩藻糖标准溶液浓度进行线性回归，得到回归方程y = 9675x + 9.0095(R2 = 0.9986)，其中x为岩藻糖标准溶液的浓度，y 为岩藻糖峰面积。
(5) 样品测定吸取供试液250iiL，按步骤(4)进行衍生反应和液 相色谱分析，将岩藻糖峰面积带入工作曲线算得样品中岩藻糖的含量， 再乘以转化系数，得样品A中海参多糖含量。所测岩藻糖的峰面积为 1230，带入工作曲线计算表明，样品A中岩藻糖含量为5.12 mg/g， 由于该样品为剌参制品，所以转化系数为7.01。测定结果为样品A中 含海参多糖35.89 mg/g。
实施例2 干刺参中海参多糖含量的测定
(1) 精确称取市售干参(刺参)样品B10g，加入60ml的浓度为 0.05M/L、 pH为7.5的醋酸钠缓冲液和lg胰蛋白酶于60'C酶解24小 时，将所得酶解液离心后，采用3倍体积的乙醇，使所得上清液中的 海参多糖沉淀，所得沉淀定容至5ml。
(2) 取0.5ml上述液体，加入等体积的6mol/LTFA，氮气封管，110 'C下水解8h;水解液以氮气吹干，以0. 5M氢氧化钠中和，定容至100ml， 作为样品供试液。(3) 取供试液250 u L,按实施例1中(3) — (5)步骤进行衍生 和液相色谱分离，并得到相关的工作曲线y = 9675x + 9.0095 (R2 = 0.9986)。所测岩藻糖的峰面积为10000，带入工作曲线计算表明，样 品B中岩藻糖含量为8.41mg/ml，由于该种制品为刺参制品，所以转 化系数为7.01，测定结果为样品B中含海参多糖59.11 mg/ml。
实施例3海参冲剂中海参多糖含量的测定
(1) 取海参冲剂样品C和海参冲剂样品D各lg，加入60ml的浓度 为0.05M/L、 pH为6.5的醋酸钾缓冲液加lmg木瓜蛋白酶酶解，将所 得酶解液离心后，采用2倍体积的乙醇，使所得上清液中的海参多糖 沉淀，离心，沉淀定容至lOOml。
(2) 取0.5ml上述液体，加入等体积的lmol/L三氟乙酸，氮气封管， ll(TC下水解lh;水解液以氮气吹干，以0.3M氢氧化钠中和，定容至 2ml为样品供试液。
取供试液250 u L，按实施案1中(3) — (5)步骤进行衍生和液 相色谱分离，并得到相关的工作曲线y = 9675x + 9. 0095 (R2 = 0. 9986)。 所测岩藻糖的峰面积为865和725，带入工作曲线计算结果表明，海 参冲剂样品C中岩藻糖含量为0.806 mg/g，样品D中岩藻糖含量为 0.687 mg/g，由于该两种样品均为刺参制品，所以转化系数为7.01。 测定结果为海参冲剂样品C中含海参多糖5.654 mg/g， 海参冲剂样 品D中含海参多糖4.819 mg/g。 实施例4海参牛奶中海参多糖含量的测定
(1) 精确量取样品E海参牛奶60ml，加入等体积0.3MNaAc缓冲 溶液(pH6.0)于60"C木瓜酶解24h，将所得酶解液离心后，采用2 倍体积的乙醇，使所得上清液中的海参多糖沉淀，离心，所得沉淀定 容至100ml;
(2) 取0.5ml上述液体，加入等体积的6mol/L三氟乙酸溶液置于 IO(TC水解I小时，水解液以氮气吹干，以0. 3M氢氧化钠水中和，定 容至一定体积后作为样品供试液。
(3) 取供试液250 u L，按实施案例中(2) — (6)步骤进行衍生和 液相色谱分离，并得到相关的工作曲线y = 9675x + 9.0095(R2 = 0.9986)。计算结果表明，样品E岩藻糖含量为0.705mg/100ml，该样 品为剌参制品。因此样品E中多糖含量为4.95mg/100ml。
同种海参多糖中的岩藻糖含量一定，因此同种海参中的多糖含量 和岩藻糖含量之间存在固定的转换系数，能够直接以岩藻糖的含量来 比较和评价其中的海参总多糖的含量。按Marao等人的方法提取的海 参多糖，转化系数为100/PMP测定海参多糖中岩藻糖百分含量。对己知海参品种可以按照提取后的多糖中的岩藻糖含量，以其倒数算得转
化系数，如日本刺参多糖(^^W/c/zo/7ws /apom'cws)中岩藻糖的含量 为14.26%,其转换系数可算得为7.01;墨西哥肉参(Zso^/c/zopw /mcw)中岩藻糖含量为18. 26%，其转换系数为5.47。
本法除了使用实施例中说明的样品外，同样适用于海参酒、海参 原浆等海参水解样品，且无需酶解这一步骤，直接采用一定体积沉淀， 其它步骤如衍生和液相色谱分离同实施例1即可。
本发明所述蛋白酶为海参或海参制品干重的0.1%-10%。所述的 蛋白酶为木瓜蛋白酶胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶。所述的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生试剂的浓度为0.卜O. 5mol/L甲醇溶液。 所述的转化系数为1/所测海参或海参制品中海参多糖所含的岩藻糖 百分含量。
权利要求
1. 一种海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法，其特征在于(1)取海参或海参制品，用蛋白酶于缓冲业液中酶解，将酶解液离心，取上清液用2-5倍体积的乙醇使海参多糖沉淀，离心，所得沉淀用水溶解后定容至1-100ml；(2)取0.1-1ml所得水溶液，加入等体积0.5-6mol/L的三氟乙酸水溶液，氮气封管，在100-120℃下水解1-12h；将所得水解液吹干和/或加碱中和，用水定容至0.1-10ml，过滤，作为供试液；(3)精确称取岩藻糖标准品，配成浓度为0.01mmol/L-1mmol/L呈梯度的多个标准水溶液；(4)分别精密吸取相同体积的上述多个标准水溶液，分别加入0.1-0.5mol/L的NaOH水溶液和等体积的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生试剂，50-70℃下水浴衍生0.2-2h，冷却，用酸的水溶液中和至中性，用氯仿萃取，吸弃下层，重复萃取2-6次，将水层过滤，进行液相色谱分析，得到分离谱图，以所得谱图中岩藻糖的峰面积对岩藻糖的浓度进行线性回归，得到回归方程；(5)取上述供试液进行衍生和液相色谱分析，以岩藻糖衍生物的峰面积代入上述回归方程中，求出样品中岩藻糖的含量；将岩藻糖的含量乘以转化系数即得海参样品中海参多糖的含量。
2、 按权利要求1所述的海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法，其特征在于所 用蛋白酶的重量为海参或海参制品干重的0.1%-10%。
3、 按权利要求1所述的海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法，其特征在于所 述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶。
4、 按权利要求1所述的海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法，其特征在于所 述的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生试剂的浓度为0. 1-0. 5mol/L甲醇溶液。
5、 按权利要求书1所述的海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法，其特征在于 所述的液相色谱分离的条件为色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18型；流动相为 梯度洗脱模式，采用乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，30分钟内实现从15 %-40%的乙腈梯度，温度25。Cj流速1 mL / min，检测波长250nm。
6、 按权利要求1所述的海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法，其特征在于所 述的转化系数为1/所测海参或海参制品中海参多糖所含的岩藻糖百分含量。
7、 按照权利要求书1所述的海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法，其特征在 于所述的海参制品为海参粉、海参酶解肽、海参酒、海参牛奶、海参原浆或海参口 服液。
全文摘要
本发明公开了一种海参及海参制品中海参多糖含量的测定方法，其特征在于先将海参及海参制品用蛋白酶酶解，采用醇沉分离出酶解产生的海参多糖，再用三氟乙酸水解制出供试液，配制岩藻糖标准水溶液，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生，所得衍生物经高效液相色谱测定其中岩藻糖衍生物的峰面积，以岩藻糖为基准计算得出样品中海参制品中的海参多糖含量。本发明为各种海参及海参制品中海参多糖的测定提供了一种简便、准确、可靠的标准化定量分析方法。
文档编号G01N33/48GK101285826SQ20081001662
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月23日 优先权日2008年5月23日
发明者尹利昂, 常耀光, 杰 徐, 李兆杰, 平 董, 勇 薛, 薛长湖, 陈士国 申请人:中国海洋大学