专利名称：：一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法
技术领域：
：本发明涉及一种测定磷含量的方法，具体涉及一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法。
背景技术：
：多糖广泛参与细胞的各种生命活动且具有多种生物学功能，如增强免疫特性、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、延缓衰老等，因而受到人们的普遍重视，得到相应的研究和开发。但多糖的活性直接或间接地受其结构的制约，因此，采取一定的方法对多糖结构进行适当修饰是有必要的。磷是人体内含量较多的元素，不仅参与构成骨骼、牙齿以及神经组织等软组织，还参与体内的一些重要代谢过程。核酸、磷蛋白、磷脂酶以及细胞内第二信使环腺苷酸、环鸟苷酸等是含磷基的化合物。高能磷酸化合物的合成、分解是机体利用、储存能量的主要方式，体内所有能量的产生，储存都取决于适量的磷供给。磷缺乏会出现低磷血症，表现为贫血、肌无力、骨痛、骨软化、全身虚弱，以致神经、精神异常。磷酸化多糖是磷元素以磷酸根的形式取代多糖上的羟基。磷酸化多糖保持了多糖的基本构型，同时使一些本无活性的糖类化合物具有了活性，或显著提高某些多糖的生物活性。研究表明，磷酸化多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和免疫调节剂等生物活性，其活性普遍高于多糖，且更易于为机体吸收和利用。现有测定磷含量的方法有中子活化分析法(INAA)、原子发射光谱法(AES)、原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)、紫外分光光度法和荧光分光光度法、电化学分析法等。中国专利CN101251489A于2008年8月27日公开了"一种测定沉积物中总磷含量的快速预处理方法"，将土样消解后加入显色剂，在700nm处进行测定。中国专利CN1991339A于2007年7月4日公开了"一种分析样品中总磷含量的方法"，将待测样品与一种分解剂混合，再用一种酸性溶液完全溶解，还原成磷钼蓝，利用磷钼蓝在710nm处有最大光吸收值进行测定，测得的吸光度值范围为0.30.7。中国专利CN1296173A于2001年5月23日公开了"含磷抗静电剂中无机磷含量的测定方法"，将抗静电剂中的无机磷用饱和硝酸钠萃取，消解后用磷钼黄在420nm处进行比色测定。以上方法中，样品的处理方法只是适合于所针对的样品，适用范围小，未明确测定的检出限和线性范围，从而导致其应用范围窄。文献"香菇多糖磷酸化修饰工艺条件的研究"(《食品与发酵工业》，2007，33(12)，6467)2007年在《食品与发酵工业》第12期报道了测定香菇多糖磷酸酯中磷含量的方法，样品处理采用灰化法，处理时间长，过程繁琐，灰化成分溶解性不好，整个过程以主观判断为主，易导致测定结果不准确。中国专利CN1635366A于2005年7月6日公开了"一种利用低分辨率电感耦合等离子体质谱仪检测磷的方法"，此方法通过测定磷的氧化物浓度来间接测量磷的浓度，但测试成本太高而难以普及。对于测定磷酸化多糖中磷含量的方法，人们期望有一种准确度高、重复性好、成本低且易于推广的测定方法。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种重复性好、准确度高的测定磷酸化多糖中磷含量的方法。为解决上述技术问题，本发明一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法，包括如下步骤(1)绘制标准曲线并建立回归方程取一定质量的NaH2P04定容于容量瓶中制备磷酸根(P043—)浓度为10ug/ml的母液，再依次稀释制备0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度标准溶液，分别取上述梯度标准溶液35ml，加入1.83mlpH值为7.0的Tris缓冲液，摇匀后加入1.22ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置12min之后依次加入1.83ml浓度为lmol/L的H2S04和0.6lml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀后在3045"C的恒温水浴锅中保温2030min，以蒸馏水代替所述标准溶液作为空白对照按同样条件处理，然后分别在824nm处测定光吸收值(即OD值，opticaldensity),以磷酸根浓度为横坐标(X)，光吸收值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线并建立回归方程；(2)样品的处理在恒温箱中将磷酸化多糖待测样品在506(TC下处理30~45min除去残余水分，称取一定质量上述干物质样品，加入混酸，其中样品与混酸的比例为，重量体积-l2.5mg:lml，所述混酸中各成分的体积份数比为HN03:HC104=4:1，静止过夜后在120。C中消解12小时至溶液澄清，得消解液A;(3)磷含量的测定将消解液A在4060。C、0.060.08MPa下减压浓縮蒸干得到干物质B，将干物质B定容在容量瓶中制备成B溶液，使其磷酸根浓度在0.210ug/ml范围内，取与步骤(l)中梯度标准溶液相同体积的所述B溶液并按照与与步骤(1)中相同的条件处理，即取B溶液35ml，加入到1.83mlpH值为7.0的Tris缓冲液中，摇匀后加入1.22ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置l2min之后依次加入1.83ml浓度为lmol/L的H2SOjD0.6lml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀之后在3045。C的恒温水浴锅中保温2030min，以蒸馏水代替所述B溶液作为空白对照按同样条件处理，然后在824nm处测定光吸收值，每个样品测定三次光吸收值，取其平均值代入歩骤(1)中所建立的回归方程，算出定容后样品溶液的磷酸根浓度(ug/ml);然后，根据所定容的样品溶液的体积(ml)算出所定容样品B溶液中磷酸根含量(ug)，再根据所用磷酸化多糖干物质样品的重量(mg)算出所测磷酸化多糖干物质中磷酸根的含量(ug/mg)，最后，根据磷在磷酸根中的含量算出所测磷酸化多糖的磷含量(ug/mg)。表1为实施例13标准曲线的数据，图13为实施例13中光吸收(OD)值(Y)对梯度磷酸根标准溶液浓度(X)绘制的标准曲线，根据实施例13绘制标准曲线的数据分别建立其对应的回归方程，其相关系数RM直均非常接近于1，说明其对应的回归方程都具有极显著的线性关系。表1实施例13中各梯度磷酸根标准溶液所对应的光吸收(OD)值<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>30.38110.38100.381140.49630.49620.49630.62850.62850.628870.89000.88990.890191.13711.13721.1376101.26581.26571.2667R20.99990.99990.9999表2给出了针对同样的样品本发明实施例测定的磷含量与ICP(电感耦合等离子体发射光谱法)测定的磷含量数据的比较；此处的ICP测定是在其他测试机构测定的，ICP测定是目前比较准确、可靠的测定方法，但因测试费用较高而难以普及。本发明实施例的测定结果与ICP测定结果基本一致，说明本发明的测定结果是准确、可靠的。表2本发明实施例测定与ICP测定的对应磷酸化多糖干物质样品的磷含量(ug/mg)结果比较实施例样品本方法测定样品的磷含量(ug/mg)ICP测定样品的磷含量(ug/mg)实施例1样品15.5014.98实施例2样品74.0771.10实施例3样品114.86120.60本发明的有益效果是本发明一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法，不包括样品消解预处理的时间，样品一次测定的时间仅为30分钟左右且重复测定误差小，测定的线性范围为0.210ug/ml，检出限为0.05ug/ml，克服了以往测定磷含量方法中样品适用范围小、限制性大、成本高，以及测定结果不准确、重复性差等缺点。本发明的方法检测结果准确可靠，重复性好，测定成本低，易于推广实施。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明图1为根据实施例1中数据制作的标准曲线；图2为根据实施例2中数据制作的标准曲线；图3为根据实施例3中数据制作的标准曲线。具体实施方式实施例l本发明提供了一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法，具体步骤如下(1)绘制标准曲线并建立回归方程取12.63mgNaH2P04定容于1000ml容量瓶中制备磷酸根浓度为10ug/ml的母液，再依次稀释制备0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度标准溶液，分别量取上述标准溶液3ml，加入1.8mlpH值为7.0的Tris缓冲液，摇匀后加入1.2ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置2min之后依次加入1.8ml浓度为lmol/L的H2S04和0.6ml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀后在30°C的恒温水浴锅中保温30min，以蒸馏水代替所述标准溶液作为空白对照按同样条件处理，然后分别在824nm处测定光吸收(OD)值(结果如表1所示)，以磷酸根浓度为横坐标(X)、光吸收值为纵坐标(Y)绘制标准曲线(如图1)，得到回归方程Y=0.1264X+0.0002，R=0.9999;(2)样品的处理在恒温箱中将待测样品在6CTC下处理30min除去残余水分，称取2mg上述样品，加入混酸2ml，所述混酸中各成分的体积份数比为HN03:HC104=4:1，静止过夜后在120°C中消解2小时至溶液澄清，得消解液A;(3)磷含量的测定将消解液A在4(TC、0.08MPa下减压浓縮蒸干得到干物质B，将干物质B定容在100ml容量瓶中制成B溶液，取B溶液3ml，加入1.8mlpH值为7.0的Tris缓冲液中，摇匀后加入1.2ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置2min之后依次加入1.8ml浓度为lmol/L的H2S04和0.6ml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀之后在30°C的恒温水浴锅中保温30min，以蒸馏水代替所述B溶液作为空白对照按同样条件处理，然后在824nm处测定光吸收值，每个样品测定三次，将所测样品光吸收值的平均值Y)0.1200代入步骤(1)中所建立的回归方程(Y=0.1264X+0.0002)算出定容后样品B溶液中磷酸根浓度(X)为0.95ug/ml，再根据所定容的样品B溶液体积100ml算出其中的磷酸根含量95.00ug，根据干物质磷酸化多糖的重量2mg算出所测干物质磷酸化多糖磷酸根的含量47.50ug/mg，根据磷在磷酸根(P(V—)中的含量(约32.63%)算出磷酸化多糖的磷含量15.50ug/mg。实施例2本发明提供了一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法，具体步骤如下(1)绘制标准曲线并建立回归方程取12.63mgNaH2P04定容于1000ml容量瓶中制备磷酸根浓度为10ug/ml的母液，依次稀释制备0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度标准溶液。分别量取上述标准溶液5ml，加入3mlpH值为7.0的Tris缓冲液，摇匀后加入2ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置2min之后依次加入3ml浓度为lmol/L的112304和lml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀后在3CTC的恒温水浴锅中保温45min，以蒸馏水代替所述标准溶液作为空白对照按同样条件处理，然后分别在824nm处测定光吸收(OD)值(结果如表l所示)，以磷酸根浓度为横坐标(X)，光吸收值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线(如图2)，得到回归方程Y=0.1264X+3E-6，R=0.9999;(2)样品的处理在恒温箱中将待测样品在50。C下处理45min除去残余水分，称取4mg上述样品，加入混酸2ml，所述混酸中各成分的体积份数比为HN03:HC104=4:1，静止过夜后在12(TC中消解1.5小时至溶液澄清，得消解液A;G)磷含量的测定将消解液A在5(TC、0.07MPa下减压浓縮蒸干得到干物质B，将干物质B定容在200ml容量瓶中，量取定容后的B溶液5ml，加入3mlpH值为7.0的Tris缓冲液中，摇匀后加入2ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置2min之后依次加入3ml浓度为lmol/L的112504和lml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀之后在45°C的恒温水浴锅中保温20min，以蒸馏水代替所述B溶液作为空白对照按同样条件处理，然后在824nm处测定光吸收值，每个样品测定三次，将所测样品光吸收值的平均值(Y)0.5740代入步骤(1)中所建立的回归方程(Y=0.1264X+3E-6)算出定容后样品溶液中的磷酸根的浓度为4.54ug/ml，再根据所定容的样品溶液的体积200ml算出定容样品液中磷酸根含量908.00ug，根据干物质磷酸化多糖的重量4mg计算出所测干物质磷酸化多糖磷酸根的含量227.00ug/mg，根据磷在磷酸根(P043—)中的含量(约32.63%)算出磷酸化多糖的磷含量74.07ug/mg。实施例3本发明提供了一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法，具体步骤如下(1)绘制标准曲线并建立回归方程取12.63mgNaH2PO4定容于1000ml容量瓶中制备磷酸根浓度为10ug/ml的母液，依次稀释制备0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度标准溶液。分别量取上述标准溶液4ml，加入2.4mlPH值为7.0的Tris缓冲液，摇匀后加入1.6ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置2min之后依次加入2.4ml浓度为lmol/L的H2S04和0.8ml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀后在40°C的恒温水浴锅中保温25min，以以蒸馏水代替所述标准溶液作为空白对照按同样条件处理，然后分别在824nm处测定光吸收(OD)值(结果如表1所示)，以磷酸根浓度为横坐标(X)，光吸收值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线(如图3)，得到回归方程Y=0.1264X+0.0003，R=0.9999;(2)样品的处理在恒温箱中将待测样品在55r下处理40min除去残余水分，称取10mg上述样品，加入混酸4ml，所述混酸中各成分的体积份数比为HN03:HC104=4:1，静止过夜后在12(TC中消解1小时至溶液澄清，得消解液A;(3)磷含量的测定将消解液A在60。C、0.06MPa下减压浓縮蒸千得到干物质B，将干物质B定容在500ml容量瓶中，量取定容后的B溶液4ml，加入2.4mlpH值为7.0的Tris缓冲液中，摇匀后加入1.6ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置2min之后依次加入2.4ml浓度为lmol/L的H2S04和0.8ml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀之后在40°C的恒温水浴锅中保温25min，以蒸馏水代替所述B溶液作为空白对照按同样条件处理，然后在824nm处测定光吸收值，每个样品测定三次，将所测样品光吸收值的平均值(Y)0.8900代入歩骤(1)中所建立的回归方程(Y=0.1264X+0.0003)算出定容后样品溶液中的磷酸根浓度(X)为7.04ug/ml，再根据所定容的样品溶液的体积500ml算出定容样品液中磷酸根含量3520ug，根据干物质磷酸化多糖的重量10mg计算出所测干物质磷酸化多糖磷酸根的含量352ug/mg，根据磷在磷酸根(P043—)中的含量(约32.63%)算出磷酸化多糖的磷含量114.86ug/mg。权利要求1、一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法，其特征在于包括以下步骤(1)绘制标准曲线并建立回归方程取一定质量的NaH2PO4定容于容量瓶中制备磷酸根浓度为10ug/ml的母液，再依次稀释制备0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度标准溶液，分别取上述梯度标准溶液3～5ml，加入1.8～3mlpH值为7.0的Tris缓冲液，摇匀后加入1.2～2ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置1～2min之后依次加入1.8～3ml浓度为1mol/L的H2SO4和0.6～1ml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀后在30～45℃的恒温水浴锅中保温20～30min，以蒸馏水代替所述标准溶液作为空白对照按同样条件处理，然后在824nm处测定光吸收值，以磷酸根浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线并建立回归方程；(2)样品的处理在恒温箱中将磷酸化多糖待测样品在50～60℃下处理30～45min除去残余水分，称取一定质量上述干物质样品，加入混酸，其中样品与混酸的比例为，重量∶体积＝1～2.5mg∶1ml，所述混酸中各成分的体积份数比为HNO3∶HClO4＝4∶1，静止过夜后在120℃中消解1～2小时至溶液澄清，得消解液A；(3)磷含量的测定将消解液A在40～60℃、0.06～0.08MPa下减压浓缩蒸干得到干物质B，将干物质B定容在容量瓶中制备成B溶液，使其磷酸根浓度在0.2～10ug/ml范围内，取与步骤(1)中梯度标准溶液相同体积的所述B溶液并按照与与步骤(1)中相同的条件处理，即取B溶液3～5ml，加入到1.8～3mlpH值为7.0的Tris缓冲液中，摇匀后加入1.2～2ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置1～2min之后依次加入1.8～3ml浓度为1mol/L的H2SO4和0.6～1ml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀之后在30～45℃的恒温水浴锅中保温20～30min，以蒸馏水代替所述B溶液作为空白对照按同样条件处理，然后在824nm处测定光吸收值，每个样品测定三次光吸收值，取其平均值代入步骤(1)中所建立的回归方程，算出定容后样品溶液的磷酸根浓度；然后，根据所定容的样品溶液的体积算出所定容样品B溶液中磷酸根含量，再根据所用磷酸化多糖干物质样品的重量算出所测磷酸化多糖干物质中磷酸根的含量，最后根据磷在磷酸根中的含量算出所测磷酸化多糖的磷含量。全文摘要本发明涉及一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法。本发明通过配制磷酸根梯度标准溶液，以蒸馏水代替所述标准溶液作为空白对照，按同样条件处理，然后在824nm处测光吸收值，绘制标准曲线并建立回归方程；接着，将待测磷酸化多糖处理后先用混酸消解，再稀释定容配制样品溶液，取与被处理的磷酸梯度标准溶液相同体积的该样品溶液，以同样的条件处理并测光吸收值，根据回归方程算出待测样品溶液的磷酸根浓度，再进一步确定待测磷酸化多糖的含磷量。本发明方法测定时间较短、重复测定误差小，检测范围较宽、结果准确可靠，测定成本低而易于推广实施。文档编号G01N21/31GK101625316SQ20091016200公开日2010年1月13日申请日期2009年8月5日优先权日2009年8月5日发明者付丽娟,健姚,继张,桑春艳,梁俊玉,王云普,王俊龙,王小芳,赵保堂,马君义申请人:西北师范大学