利用响应曲面法优化黑果枸杞多糖的复合酶微波提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及利用响应曲面法优化黑果构杞多糖的复合酶 微波提取方法。
【背景技术】
[000引 黑果构杞化Murr.)藏药称为"旁玛"，为茄科（Solanceae)、茄 族（SolanceaeReihb)、构杞亚族（Lyciinaewettst)构杞属（Zj心fufflL.)。多年生灌木， 具棘刺，浆果球形，成熟后为紫黑色，有很高的光合效率和较强抗逆性，是我国西北特有的 抗盐抗旱野生植物种，主要分布于青海、西藏、新疆等地。黑果构杞味甜多汁，含丰富的维生 素、有机酸及糖类，民间常生食或棒汁做饮料；黑果构杞也具有一定的医疗保健功能，其味 甘、性平、清屯、热，藏医用于治疗屯、热病、屯、脏病、月经不调、停经等病症，并且药效显著，被 收载于《四部医典》、《晶珠本草》等藏医药经典著作中；《维吾尔药志》记载，维吾尔族医生 常用黑果构杞果实及根皮治疗尿道结石、月经不调、癖巧、齿銀出血等病症；民间用作滋补 强壮、明目及降压药。研究表明，黑果构杞多糖具有良好的抗疲劳、调节免疫力及降血糖的 功能。
[0003] 目前，运用于黑果构杞多糖的提取方法大致可分为；热水浸提法、超声法、微波法、 超声-微波协同萃取法等4类。但无论哪种方法，都是W破坏多糖和蛋白质的结合，通过溶 媒加W分离为基本原理，并在该一前提下，尽量保证多糖不被过多水解，再经过适当干燥处 理，获得粗多糖。据文献报道，所得黑果构杞多糖含量大多集中在10%左右。目前，黑果构 杞果实多糖最佳提取工艺为：提取温度90 °C，提取时间为60min,提取3次。在上述条 件下，3次提取多糖得率分别为；3. 34%，3. 72%，3. 95%，平均得率为3. 67 + 0. 31%，黑果构杞 果实粗多糖含量为46. 62% (江建红等，2009)。
[0004] 中国专利CN103333268公开了一种黑果构杞多糖的制备方法。该方法在制备过程 中采用超微粉碎技术，将已提取过色素的黑果构杞残渣进行粉碎，然后进行脱脂处理得到 脱脂黑果构杞粉末，脱脂粉末先经过酶解处理，再采用低温冻融技术，反复冻融，最后经过 滤、醇沉、脱蛋白处理、冻干等工序得到抗氧化活性黑果构杞多糖成品。该方法与传统提取 方法相比，具有收率高、活性强、成本低的优点。但提取过程中冻融技术需要用到超低温冰 箱，而且冻融过程耗时长，所W并不适合工业化生产。此外，脱蛋白处理所设及的Sevag由 氯仿和正了醇按照体积比4:1组成，处理不当很容易造成有害溶剂残留，产生健康安全隐 患。
[0005] 因此，为了合理和高效利用黑果构杞资源，亟需提供一种操作简单、提取率高、安 全的从黑果构杞果实中制备活性多糖的方法。有关复合酶-微波辅助提取黑果构杞抗衰老 活性多糖的专利未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、提取率高的利用响应曲面法优 化黑果构杞多糖的复合酶微波提取方法。
[0007] 为解决上述问题，本发明所述的利用响应曲面法优化黑果构杞多糖的复合酶微波 提取方法，包括W下步骤： 山样品制备： 将黑果构杞果实洗净，在25~30°C温度下烘干48~7化后粉碎至40~80目，按20~40血/g料液比加入体积浓度为80%的己醇溶液，在25°C ~35°C浸泡2~化后过滤，得到滤渣，该滤 渣于40~60°C下干燥12~2化，即得脱除脂类、色素和小分子糖的黑果构杞果粉；然后在微波 反应器中，按15~25血/g不同的料液比加入复合酶溶液，40~50°C静置浸泡1. 5~2.化的不 同时间，在300~400W的不同微波功率下按20~30min的不同时间进行反应提取，提取后的溶 液分别W 4000~5000转/min进行离屯、，15~20min后收集上清液A，该上清液A经50~60°C 真空旋转蒸发浓缩至原体积的1/6~1/8后，得到浓缩产物；所述浓缩产物中加入其体积3~4 倍的无水己醇溶液混匀，当其溶液中己醇浓度为80%时，于2~6°C下静置12~2化，再分别W 4000~5000转/min进行离屯、，15~20min后收集沉淀；沉淀加水复溶后，W 4000~5000转/min 进行离屯、，15~20min后收集上清液B，该上清液B于-70°C ~ -85°C预冻4~6h，最后在大气 压力为10~100化、温度为-55°C ~ -70°C的条件下冷冻干燥24~72h，得到对应于不同微波功 率的黑果构杞多糖提取物干燥粉末； 所述复合酶溶液是指蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等质量混合后加去离子水配制而成的 抑为4~5的溶液； 口)用苯酪-硫酸法测定每个提取液中多糖含量： ① 标准曲线制作： 准确称取10mg葡萄糖，配制成浓度为0.1mg/mL的溶液，分别取0血、0.1血、0.2血、 0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0.6mU依次补加蒸馈水至1mL;W蒸馈水作对照，分别向其中加 入0.5血6%的苯酪，振荡摇匀，垂直快速加入2.5血浓H2SO4,振荡摇匀后，静止30min, 冷却至室温，然后在490nm波长下测吸光值，W糖溶液浓度yg/mL为横坐标，吸光值为纵 坐标，绘制标准曲线； ② 样品中多糖含量的测定： 将样品配置成60 y g/mL的溶液，取样品1mU不加蒸馈水，其余操作均与所述步骤① 制作标准曲线相同；在490 nm波长下比色，所得数值在标准曲线上查出相应的总糖含量； 樹实验设计与统计分析： ① 单因素试验： 依次改变微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比进行单因素试验，用苯酪-硫酸法 测定所得的黑果构杞多糖提取物中多糖的含量，并按下式计算多糖产率，每次处理重复= 次： 多糖产率（％)=[(多糖含量X提取物重量）/果粉重量]X 100%; ② 响应面法优化设计： 根据单因素试验结果，选取多糖提取效果影响较显著的微波功率、提取时间、浸泡时 间、料液比该4个因素，利用Desi即Expert8. 0软件根据Box-Behnken设计原则进行实验 设计，W微波功率Xi、提取时间X2、浸泡时间X3和料液比X4为自变量，W多糖的产率为响应 值y，建立多元二次回归方程： y=-17. 47108+0. 12776Xi+0. 45350X2-1.29400X3-0. 14273X4-0.OOO8OX1X2+ 0.00320X1X3+0. 00029XA-0.00200X2X3+0.00120X2X4+0.OI8OOOX3X广 1. 60067X1〇-3Xi2-2. 45667X1〇-3乂22+ 4. 33333XlO-sXs'-l. 06667X (4)实验结果分析与优化： 利用Design Expert 8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的 响应面及其等高线图。
[000引本发明与现有技术相比具有W下优点： 1、本发明不仅利用复合酶酶解技术破坏植物细胞壁促进细胞内活性多糖成分的充分 溶出、水解果实中蛋白质成分提高多糖含量、避免氯仿等有害溶剂造成的安全隐患，而且利 用低功率微波穿透式内外加热，在降低活性多糖结构破坏风险的同时促进多糖溶出、节省 提取时间。
[0009] 2、与正交法相比，本发明采用Box-Behnken Desi即S炬抓）中屯、组合设计模型的 响应面分析法，用4个变化因子、3个水平及少量的实验组(仅29组实验）就可W得出优化 结果，获得最佳产率，在提高了提取效率的同时降低了能耗和污染物排放，具有工业化生产 的实际意义；并且所得的最佳提取条件不是设定的值，而是在设定条件的范围之内。
[0010] 3、本发明获得的黑果构杞多糖最终产品为栋色粉末，易溶于水，经测试其糖含量 为609(^66%，糖醒酸含量为2. 8°/cK3. 4%，不含蛋白质，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醒酸、 半乳糖组成，不仅能够有效阻止自由基的产生，而且能够显著清除已产生的自由基。
[0011] (1)糖醒酸含量检测采用间哲基联苯法，具体如下： ①标准曲线制备：分别量取0. 1g/LD-GalA标准溶液0uL、50yUlOOyL、200yL、300yL、400uL转于玻璃试管（1.8X18cm)中，加蒸馈水补至400uL，每个浓度 重复=个样品。向每支试管中加入氨基横酸试剂40 摇匀，再向各管加入浓硫酸2. 5 111以振荡均匀，沸水浴煮沸20min。冷却至室温后，向各管中加入间哲基联苯试剂40UL， 摇匀，室温放置15min。在A525皿处测定吸光度A。W吸收度A为纵坐标，D-半乳糖醒 含量（yg)为横坐标，得标准曲线。
[0012] ②样品中糖醒酸含量测定；取浓度0.1g/L左右的样品溶液400uL，按标准曲 线制备方法之操作，测定吸收度，根据标准曲线和样品浓度计算其中的糖醒酸含量。重复3 次，结果取平均数。
[0013] 口)蛋白质含量检测采用考马斯亮藍法，具体如下； ①考马斯亮藍试剂的配置： 称取10mg考马斯亮藍G-250,溶解于5血的95%己醇中，加入10血的85%磯酸，用 蒸馈水定容至100 111以过滤备用。最终试剂中考马斯亮藍的浓度为0.01% (w/v)，己醇浓度 为 4. 7% (w/v)。
[0014] ②标准曲线的制作： 分别取50yg/mL蛋白质标准溶液0血、0.2血、0.4血、0.6血、0.8血、1.0血，加蒸 馈水补至1.0mU分别向每支试管中加入考马斯亮藍试剂4mU迅速振荡混匀，静置5min 后在595皿处测定光吸收值A595皿。W吸收度A595皿为纵坐标，牛血清白蛋白质量C (yg)为横坐标，制