一种生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖的方法与流程

本发明涉及枸杞多糖提取技术领域，具体为一种生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖的方法。

背景技术：

枸杞多糖是一种生物活性物质，具有促进T、B、CTL、NK和巨噬细胞等免疫功能，促进IL-2、IL-3和TNFβ等细胞因子产生。增强荷瘤、化疗与辐射损伤小鼠免疫功能及调节神经内分泌免疫调节(NIM)网络的作用，淡黄色纤维状固体，有调节免疫、延缓衰老多种功效，可制药；

枸杞多糖的提取纯化分为二步。一是枸杞粗多糖的提取，二是枸杞多糖的分级纯化。粗多糖的提取工艺如下：称取已烘干粉碎的枸杞子，以石油醚：丙酮(1：1)回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干后以80%乙醇脱单糖和低聚糖。将脱低聚糖等后的残渣用水在90~100℃水溶提多糖，提取液减压浓缩后用酒精沉淀多糖，再用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥得枸杞粗多糖。例如公告号为CN105367678A的一种枸杞多糖的提取方法，该方法讲述了对枸杞多糖的提取方式。粗多糖的分级纯化是将上述枸杞粗多糖通过DEAE纤维素柱，以不同浓度的NaCl梯度洗脱，将不同盐浓度的洗脱液分别减压浓缩后，用透析法脱盐，冷冻干燥后得不同级分的枸杞糖蛋白。但是在实际工作中，往往因为会提取工艺选择不当，导致制备的枸杞多糖活性大大降低；

生物表面活性剂只有少数糖脂类产品走向市场，借助其表面活性和无污染的特点，已应用到石油开采业并发展出“微生物三次采油技术”；借助其可乳化烃类和水的混合物，已用于降解石油化学工业泄露的原油中烃类物质，发展新型环境生物修复技术；借助其乳化和抑菌特性，已用于食品工业中作为乳化剂和生物防腐剂；借助糖脂类生物表面活性剂对皮肤的亲和性，已用于医疗和化妆品工业；

目前，北欧国家在生物表面活性剂的制备和应用等方面，处于世界领先水平，我国在这一领域远远落后于行业内的先进国家，原因在于：Lipopeptide类生物表面活性剂处于实验研究阶段，还没有进行大规模的工业化生产，一方面原因在于其生产成本较高，成本约为化学合成表面活性剂成本的3-10倍；另一方面，尚没有发现高效制备Lipopeptide类生物表面活性剂的方法。而在先进国家，生物表面活性剂也只有少数糖脂类产品得到应用，但取得了较好的市场响应。本发明重点研究的脂肽（Lipopeptide）类生物表面活性剂和糖脂类生物表面活性剂相比较，具有成本低，应用领域广阔等优势，目前，在国内外大规模的工业化生产和应用报道较少。

技术实现要素：

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖的方法，解决了在实际工作中，因为提取工艺选择不当，导致制备的枸杞多糖活性大大降低的问题。

（二）技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖的方法，包括以下步骤：

S1、通过单因素实验先后采集温度对枸杞多糖提取率的影响工艺参数、料液比对枸杞多糖提取率的影响工艺参数和提取时间对枸杞多糖提取率的影响工艺参数，每个因素做三个平行。

S2、在单因素实验的基础上进行L9正交实验，按照正交实现确定的最佳工艺进行验证实验，做出三个平行。

S3、通过观察实验记录表，取得最佳工艺，并制定生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖产业化生产工艺流程。

优选的，S1中温度对枸杞多糖提取率的影响工艺参数的采集方法为称取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去离子水，配制料液比为1:50，分别于26℃、28℃、30℃、32℃空气摇床内，180r/min，发酵48h后取出，离心取上清液，测定计算多糖提取率，每个因素做三个平行。

优选的，：S1中料液比对枸杞多糖提取率的影响工艺参数的采集方法为称取3.6g、4.5g、6g、9g干燥的枸杞粉末，分别加入180mL去离子水（即料液比分别为1:20、1:30、1:40、1:50），于28℃空气摇床内，180r/min，发酵48h后取出，离心取上清，测定计算多糖提取率，每个因素做三个平行。

优选的，S1中料液比对枸杞多糖提取率的影响工艺参数的采集方法为称取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去离子水，配制料液比为1:40，于28℃空气摇床内，180r/min，分别发酵36h、48h、60h、72h后取出，离心取上清，测定计算多糖提取率，每个因素做三个平行。

优选的，S3中生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖产业化生产工艺流程包括以下步骤：

A1、将枸杞干果放入60℃的烘干机内烘干至恒重，再将其粉碎，然后通过50目筛进行筛选，同时准备黄酒酵母菌种。

A2、将适量枸杞干果粉投入提取罐内，加入40倍原料量的去离子水和5%黄酒酵母菌种，加热搅拌升温至28℃，保温搅拌提取36小时。

A3、对保温搅拌后的液体进行过滤，以得到上清液。滤渣再次用5倍量的水与黄酒酵母分别提取两次，方法相同。

A4、滤液用真空泵抽到单效浓缩器中（滤液以装满容器体积的2/3为宜），在温度50±5℃、真空度0.05-0.06MPa和蒸汽压力0.2MPa条件下进行减压浓缩，浓缩到至固形物为50-55%左右。

A5、加入4倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉12 h，醇沉两次，再经过离心、乙醚洗涤、粉碎和喷雾干燥，最后通过80目筛，得枸杞多糖。

优选的，A1中黄酒酵母菌种的制作方法包括以下步骤：

A11、YPD培养基的配制。

A12、挑取黄酒酵母单菌落接菌于YPD培养基中，并将混入有黄酒酵母单菌的YPD培养基放入28℃的空气摇床中，180r/min，培养48小时之后即得。

优选的，A11中YPD培养基的配制方法为称取10g酵母浸粉、20g蛋白胨、20g分析纯葡萄糖，加水定容至1000mL，分装置500mL的锥形瓶中各100 mL，121℃高温高压灭菌15min制得。

优选的，A3中的过滤采用板框进行，板框由滤板和滤框交替叠合构成，在板与框之间设置有压滤布。

优选的，A1和A5中粉碎均采用型号为ZN-04B的小型粉碎机。

（三）有益效果

本发明提供了一种生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖的方法。具备的有益效果是：

1、该生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖的方法，以枸杞作为实验材料，枸杞多糖的提取率作为考察目标，通过酵母产槐糖脂、表面活性素、甘露糖蛋白和热水法提取枸杞多糖，选取影响枸杞多糖提取率的主要因素，通过单因素实验和正交设计实验确定表面活性剂法和热水法提取枸杞多糖的最优工艺条件，对比表面活性剂法和热水法提取枸杞多糖的提取率，评价利用酵母产表面剂提取枸杞多糖的可行性和优越性。

2、本发明采用黄酒酵母发酵生产槐糖脂、表面表面活性、甘露糖蛋白等表面活性剂辅助提取枸杞多糖，可显著提高枸杞多糖提取率和产品纯度（75%以上）

附图说明

图1为本发明生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖产业化生产工艺流程图；

图2为多糖提取率温度单因素实验图；

图3为多糖提取率料液比单因素实验图；

图4为多糖提取率提取时间单因素实验图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖的方法，包括以下步骤：

S1、通过单因素实验先后采集温度对枸杞多糖提取率的影响工艺参数、料液比对枸杞多糖提取率的影响工艺参数和提取时间对枸杞多糖提取率的影响工艺参数，每个因素做三个平行。

S1中温度对枸杞多糖提取率的影响工艺参数的采集方法为称取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去离子水，配制料液比为1:50，分别于26℃、28℃、30℃、32℃空气摇床内，180r/min，发酵48h后取出，离心取上清液，测定计算多糖提取率，每个因素做三个平行，具体请见图2：

由图可见，枸杞多糖提取率在28℃之前随着温度的升高而显著升高，28℃之后随着温度的升高而显著下降，过高的温度会对酵母的活性有抑制作用，故温度选在26℃-30℃为宜。

S1中料液比对枸杞多糖提取率的影响工艺参数的采集方法为称取3.6g、4.5g、6g、9g干燥的枸杞粉末，分别加入180mL去离子水（即料液比分别为1:20、1:30、1:40、1:50），于28℃空气摇床内，180r/min，发酵48h后取出，离心取上清，测定计算多糖提取率，每个因素做三个平行，具体请见图3：

由图可见，枸杞多糖的提取率随着料液比的先显著增高后显著下降，在1:40达到最大提取率，料液比为1:40之后开始显著下降的原因可能是随着料液比的增大，发酵底物中菌和酶的浓度较小，使多糖的提取率降低。故料液比应选取1:30-1:50为宜。

S1中料液比对枸杞多糖提取率的影响工艺参数的采集方法为称取4g干燥的枸杞粉末4份，加入去离子水，配制料液比为1:40，于28℃空气摇床内，180r/min，分别发酵36h、48h、60h、72h后取出，离心取上清，测定计算多糖提取率，每个因素做三个平行，具体请见图4：

有图可知，在微生物提取时间为48h时，枸杞多糖的提取率最大， 48h之后随着时间的增加，提取率开始显著下降，时间取36h-60h为宜。

S2、在单因素实验的基础上进行L9正交实验，按照正交实现确定的最佳工艺进行验证实验，做出三个平行，具体请见下表：

有图可知，三个因素对于枸杞多糖提取率影响大小为C>A>B，即料液比>发酵温度>时间，根据显著性分析可得，料液比和温度对微生物法提取枸杞多糖影响显著（P<0.05），时间对微生物法提取枸杞多糖影响不显著。由图微生物法提取正交实验结果可得最佳提取工艺为A2B1C2，提取率为2.74%，所以微生物法产表面活性剂提取枸杞多糖的最佳工艺为发酵温度28℃、发酵时间为36h、料液比为1:40。

S3、通过观察实验记录表，取得最佳工艺，并制定生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖产业化生产工艺流程。

如图1所示，S3中生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖产业化生产工艺流程包括以下步骤：

A1、将枸杞干果放入60℃的烘干机内烘干至恒重，再将其粉碎，然后通过50目筛进行筛选，同时准备黄酒酵母菌种。

A1中黄酒酵母菌种的制作方法包括以下步骤：

A11、YPD培养基的配制；

A12、挑取黄酒酵母单菌落接菌于YPD培养基中，并将混入有黄酒酵母单菌的YPD培养基放入28℃的空气摇床中，180r/min，培养48小时之后即得。

A11中YPD培养基的配制方法为称取10g酵母浸粉、20g蛋白胨、20g分析纯葡萄糖，加水定容至1000mL，分装置500mL的锥形瓶中各100 mL，121℃高温高压灭菌15min制得。

A2、将适量枸杞干果粉投入提取罐内，加入40倍原料量的去离子水和5%黄酒酵母菌种，加热搅拌升温至28℃，保温搅拌提取36小时。

A3、对保温搅拌后的液体进行过滤，以得到上清液。滤渣再次用5倍量的水与黄酒酵母分别提取两次，方法相同。

A3中的过滤采用板框进行，板框由滤板和滤框交替叠合构成，在板与框之间设置有压滤布。

A4、滤液用真空泵抽到单效浓缩器中（滤液以装满容器体积的2/3为宜），在温度50±5℃、真空度0.05-0.06MPa和蒸汽压力0.2MPa条件下进行减压浓缩，浓缩到至固形物为50-55%左右。

A5、加入4倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉12 h，醇沉两次，再经过离心、乙醚洗涤、粉碎和喷雾干燥，最后通过80目筛，得枸杞多糖，A1和A5中粉碎均采用型号为ZN-04B的小型粉碎机。

综上所述，该生物表面活性剂辅助提取枸杞多糖的方法，以枸杞作为实验材料，枸杞多糖的提取率作为考察目标，通过酵母产槐糖脂、表面活性素、甘露糖蛋白和热水法提取枸杞多糖，选取影响枸杞多糖提取率的主要因素，通过单因素实验和正交设计实验确定表面活性剂法和热水法提取枸杞多糖的最优工艺条件，对比表面活性剂法和热水法提取枸杞多糖的提取率，评价利用酵母产表面剂提取枸杞多糖的可行性和优越性。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。