本发明涉及一种绿藻寡糖的提取工艺，尤其是一种利用提取多糖后的绿藻废液提取寡糖的工艺。
背景技术：
海藻是生长于海洋中的低等植物，是海洋生物的重要组成之一。
主要由褐藻、红藻、绿藻、蓝藻四大类海藻组成，其体内的生理活性物质研究已成为医药领域的热点之一。其中，海藻多糖(seaweed polysaccharides)是目前最具有前景的一类生理活性物质。实验和临床已经发现海藻多糖具有免疫调节、降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗凝血及抗病毒等多种生理活性。
由于天然多糖常因分子量大、粘度高、溶解度低等，制约了其临床应用。因此，必须改变海藻多糖的分子量，才能使海藻多糖发挥真正的作用。海藻寡糖（seaweed oligosaccharide）就是海藻多糖改变分子量后的高科技生物产品。
中国科学院海洋研究所的张燕霞教授指出“海藻寡糖又名低分子海藻多糖，其分子量通常在2000-8000Da，黏度在20CPS以下”（摘自百度文库“海藻多糖和海藻寡糖的前景的生理活性物质”一文）。由于植物中天然存在的寡糖含量很低，通常被认为不能作为工业生产”，因此，目前的植物寡糖提取工艺为：以植物体的茎、叶等为原材料，经粗提获得植物多糖，再对植物多糖经酸或碱等化学降解方法处理来获得寡糖。其中的化学降解方法对仪器的腐蚀性大，且污染环境。并且现在研究比较全面的是褐藻寡糖和红藻寡糖，而绿藻寡糖的研究则未见报道，绿藻被人类认识和利用的程度也远不如褐藻和红藻。
另外，现有的绿藻多糖提取工艺中，绿藻多糖粗提液可经超滤膜过滤对多糖进行纯化，但是，由于活性多糖成分基本都被截留（即大部分的活性多糖都存留于超滤后的滤渣中），而超滤后的滤液的成分通常被认为是没有利用价值的物质，因此，超滤后的滤液都是被作为“废液”直接排入污水系统。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种利用提取多糖后的绿藻废液提取寡糖的工艺。
一种利用提取多糖后的绿藻废液提取寡糖的工艺，包括以下步骤：
（1）收集提取多糖后的绿藻废液；
（2）采用截留分子量为2000 Da的滤膜对提取多糖后的绿藻废液进行膜过滤，收集滤液；
（3）在50~100 rpm的搅拌速度下，向滤液中投入壳聚糖絮凝剂进行絮凝分离，絮凝剂的投入量为300~500 ppm，搅拌2~4h，离心，收集絮凝分离物；
（4）对絮凝分离物进行冷冻干燥，获得分子量为2000Da以下绿藻寡糖的粉末。
本发明的技术方案是本申请人多次克服技术局限和技术偏见的基础上才获得的，具体为：
（1）由于现有的植物寡糖提取工艺为：以植物体的茎、叶等为原材料，经粗提获得植物多糖，再对植物多糖经酸或碱等化学降解方法处理来获得寡糖，本领域技术人员通常会采用绿藻粗多糖作为原材料来提取寡糖，而不会想到采用提取多糖后的废液来提取寡糖，并且，现有的绿藻多糖提取工艺中，本领域技术人员通常认为：提取多糖的绿藻废液中的成分为没有利用价值的物质，因此，提取多糖的绿藻废液都是被作为“废液”直接污水系统，但是，本发明人克服这些技术局限，采用提取多糖后的绿藻废液作为原材料，从中提取寡糖，实现了资源的合理利用，节约了成本；
（2）根据现有技术中所公布的“海藻寡糖的分子量通常为2000-8000Da”，本领域普通技术人员通常认为：截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤液的主要成份是蛋白质、矿物质、盐分等小分子成分，其不含有寡糖成分，因此，截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤液通常也是被作为“废液”直接废弃处理的。而本申请人克服本领域的技术偏见，对分子量为2000Da以下的绿藻寡糖进行纯化收集，其原因在于：在对截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤渣进行抗菌活性测试时，本申请人误将截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤液当作截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤渣稀释液来用，却获得了意想不到的发现：滤液对嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌均有显著的抑制生长作用，其中对嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最为显著，并且，虽然截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤液中寡糖的得率均为15%左右，远远低于截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤渣中寡糖的得率85%左右，但是，截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤液对嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用却远远高于截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤渣。这就说明：分子量为2000Da以下的绿藻寡糖粉末中含有某种特殊的寡糖成分，其对嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌作用，这为进一步对分子量为2000Da以下的绿藻寡糖粉末中的活性寡糖成分进行提纯和研究提供了线索；
（3）与现有技术中絮凝分离步骤中搅拌速度为300~500rpm相比，本发明突破了技术局限，采用了搅拌速度—50~100rpm来进行绿藻寡糖的絮凝分离，大大提高了寡糖得率，并且，本领域技术人员通常认为：过低的搅拌速度不利于小分子寡糖实现有效絮凝，本发明采用50~100rpm的搅拌速度克服了一定的技术偏见，另外，本申请人还进一步克服现有技术局限，采用絮凝时间为2~4h（现有技术中絮凝分离中絮凝时间为5~40min）的技术特征，进一步提高了寡糖得率，获得了意想不到的技术效果。
本发明通过利用提取多糖后的绿藻废液来提取寡糖，大大节约了成本，同时，获得了分子量为2000Da以下的绿藻寡糖粉末，该绿藻寡糖粉末显示出了绝佳的抑制嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌两种水产致病菌的活性功能，并且，该寡糖的得率也较高。
所述的绿藻废液通过以下步骤获取：绿藻干粉→加水提取→粗滤→离心→超滤膜过滤；其中，在加水提取步骤中，水与绿藻干粉的初始质量比为40 ～ 60 ：1，采用超声波法协同酶法进行绿藻多糖的提取；在超滤膜过滤步骤中，采用截留分子量为5000Da的滤膜对离心后的上清液进行过滤，收集滤液，即为绿藻废液。本发明人采用超声波法协同酶法进行绿藻多糖的提取，绿藻废液中多糖的得率最高，且超声波法和酶法均具有操作简单、反应迅速、无环境污染等优势；另外，酶法提取主要起到水解破坏细胞壁的作用，加上，超声波虽然能使绿藻多糖产生一定程度的降解，从而使绿藻水溶液的粘度显著降低，但是，其降解后的产物依然为多糖成分，而不是分子量较小的寡糖成分，因此，采用酶法和超声波法提取寡糖利于得到天然的寡糖成分，同时，绿藻水溶液的粘度变小，有利于膜过滤纯化的进行，进一步节约成本。进一步的，酶法提取中的酶优选采用纤维素酶，容易获得、成本低。所述的截留分子量为5000Da的滤膜后的滤渣用于提取绿藻多糖，最大程度的实现绿藻的资源化利用，避免浪费。
所述的截留分子量为2000Da的滤膜过滤后的滤渣用于提取分子量为2000-5000Da的绿藻寡糖，最大程度的实现绿藻的资源化利用，避免浪费。
所述的绿藻优选采用石莼、浒苔两种绿藻中的任一种或组合。石莼、浒苔均广泛分布在东南沿海的潮间带，容易获取，并且，与海带等褐藻相比，其水溶液的粘度更低，有利于膜过滤纯化的进行，最大程度的节约成本。
所述的采用截留分子量为2000 Da的滤膜对提取多糖后的绿藻废液进行膜过滤的具体步骤的为：在真空抽滤瓶内放入截留量为2000 Da的滤膜，将提取多糖后的绿藻废液倒入真空抽滤瓶内，抽滤至真空抽滤瓶内的液面为50 ml时，向真空抽滤瓶内加入无离子水稀释5~10倍轻轻搅拌后再抽滤，再抽滤至完全后，收集滤液，可尽量多的收集到分子量为2000Da以下的绿藻寡糖。
具体实施方式
现具体阐述本发明的较佳实施方式：
一种利用提取多糖后的绿藻废液提取寡糖的工艺，包括以下步骤：
（1）收集提取多糖后的绿藻废液；
（2）采用截留分子量为2000 Da的滤膜对提取多糖后的绿藻废液进行膜过滤，收集滤液，其中，所述的采用截留分子量为2000 Da的滤膜对提取多糖后的绿藻废液进行膜过滤的具体步骤的为：在真空抽滤瓶内放入截留量为2000 Da的滤膜，将提取多糖后的绿藻废液倒入真空抽滤瓶内，抽滤至真空抽滤瓶内的液面为50 ml时，向真空抽滤瓶内加入无离子水稀释5~10倍轻轻搅拌后再抽滤，再抽滤至完全后，收集滤液；
（3）在50~100 rpm的搅拌速度下，向滤液中投入壳聚糖絮凝剂进行絮凝分离，絮凝剂的投入量为300~500 ppm，搅拌2~4h，离心，收集絮凝分离物；
（4）对絮凝分离物进行冷冻干燥，获得分子量为2000Da以下绿藻寡糖的粉末；
其中，所述的绿藻废液通过以下步骤获取：绿藻干粉→加水提取→粗滤→离心→超滤膜过滤；在加水提取步骤中，水与绿藻干粉的初始质量比为40 ～ 60 ：1；在超滤膜过滤步骤中，采用截留分子量为5000Da的滤膜对离心后的上清液进行过滤，收集滤液，即为绿藻废液。
本申请人根据上述技术方案进行了8项实施例（即实施例1~8），同时，为了体现本发明的多糖提取方法和絮凝分离步骤中搅拌速度、絮凝剂投入量、絮凝时间对绿藻废液中寡糖得率和分子量小于2000Da的绿藻寡糖得率的影响，本发明还提供了9项对比例（即对比例1~9），并采用蒽酮- 硫酸比色法分别测定绿藻废液中寡糖得率、经截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤渣与滤液中寡糖的比例和以绿藻多糖废液中绿藻寡糖含量为100%计，最终获得的分子量为2000Da以下的寡糖粉末中绿藻寡糖的得率。其中，实施例1~8和对比例1~9的不同之处列举如下表1：
实施例1~8和对比例1~9的试验数据列举如下表2：
从表1和表2中实施例1~8的试验数据可看出，与单纯的采用超声波和单纯的采用酶法提取多糖相比，采用超声波协同酶法提取多糖时，绿藻废液中寡糖的得率最高。将表1和表2中实施例1~8与对比例1~9的实验数据进行对比可看出，絮凝分离步骤的搅拌速度限定为50~100 rpm、搅拌时间限定为2~4h，可大大提高了分子量为2000Da以下绿藻寡糖的得率，同时，絮凝剂的投入量限定为300~500 ppm，又进一步提高了分子量为2000Da以下绿藻寡糖的得率，使得分子量为2000Da以下绿藻寡糖的得率最高可达到14.41%。同时，本发明的实施例1~8均通过利用提取多糖后的绿藻废液来提取寡糖，大大节约了成本。
另外，本申请人分别将实施例4、实施例5、实施例6中经截留量为2000Da滤膜过滤后的滤渣溶解液（即分子量为2000~5000Da的绿藻寡糖）、实施例4、实施例5、实施例6中经截留量为2000Da滤膜过滤后的滤液（即分子量为2000Da以下的绿藻寡糖）分别稀释为寡糖浓度为4g/L的寡糖溶液，并分别加入嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌三种常见水产致病菌的发酵液中进行培养，培养15h，待全部培养结束后，以空白的培养基为对照，测定600 nm处的光密度值（即OD600值），结果如下表3：
从表3可看出，本发明的实施例4、实施例5、实施例6所获得的截留量为2000Da滤膜过滤后的滤液对嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌这三种常见水产致病菌均存在明显的（即分子量为2000Da以下的绿藻寡糖）抑制作用，并且，其对嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最为显著，其抑制作用远远优于截留量为2000Da滤膜过滤后的滤渣对嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。另外，从表3中也可看出，与采用小球藻作为原材料（即实施例5）相比，采用浒苔、石莼作为原材料（即实施例4、实施例6）获得的截留量为2000Da滤膜过滤后的滤液对嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌这三种常见水产致病菌的抑菌效果均更佳。
当然，本发明的原材料也并不限于实施例1~8中的浒苔和石莼，也可以是其他常见的绿藻，但是，石莼、浒苔均广泛分布在东南沿海的潮间带，更容易大量获取，且采用石莼、浒苔作为原材料根据本发明的技术方案获得的截留量为2000Da滤膜过滤后的滤液对嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌这三种常见水产致病菌的抑菌效果最佳。另外，虽然，本发明仅提供了浒苔、石莼这两种绿藻单独作为原材料的实施例，但是，实际上，本发明也可以采用这两种绿藻组合作为原材料来提取绿藻寡糖。
另外，本发明的步骤（2）中采用截留分子量为2000 Da的滤膜对提取多糖后的绿藻废液进行膜过滤的具体步骤不限于实施例1~8的具体操作，也可以是：在真空抽滤瓶内放入截留量为2000 Da的滤膜，将提取多糖后的绿藻废液倒入真空抽滤瓶内，直接抽滤至完全后，收集滤液。但是，同等条件下，将实施例4步骤（2）中采用截留分子量为2000 Da的滤膜对提取多糖后的绿藻废液进行膜过滤的具体步骤替换为上述步骤后，所获得的经截留量为2000 Da滤膜过滤后的滤渣与滤液中寡糖的比例为86：14，同时，以绿藻多糖废液中绿藻寡糖含量为100%计，分子量为2000Da以下绿藻寡糖的得率仅为13.54%。
本发明的实施例1~8均可做如下改进：
（1）所述的截留分子量为5000Da的滤膜后的滤渣用于提取绿藻多糖，最大程度的实现绿藻的资源化利用，避免浪费。
（2）所述的截留分子量为2000Da的滤膜过滤后的滤渣用于提取分子量为2000-5000Da的绿藻寡糖，最大程度的实现绿藻的资源化利用，避免浪费。
本发明的实施例1~6和实施例8还可做如下改进：酶法提取中的酶优选采用纤维素酶，容易获得，且成本低。