以离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了以离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂及其制备方法，其特点是将1重量份冷冻干燥的未变性天然胶原溶于50～300重量份的离子液体中，加入以5～15重量份有机溶剂溶解的0.03～0.3重量份的长链疏水羰基化合物，4～10℃冰浴下反应6～10h，反应结束后用酸调节pH至9～10，再缓慢加入以5～15重量份有机溶剂溶解的0.1～0.5重量份的短链二元酸酐，同时用碱将pH稳定在9～10，4～10℃冰浴下反应3～5h，反应结束后用酸调节pH至出现沉淀为止，沉淀物用酸调节pH＝4.2～4.6的去离子水洗涤3～5次，获得疏水长链接枝率高、表面活性良好且中性水溶的未变性胶原基生物表面活性剂。
【专利说明】
以离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂及其 制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及以离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂及其制备方 法，属于美容化妆品和生物医药领域。 技术背景
[0002] 胶原（collagen)作为细胞外基质的主要成分，是一种广泛分布于动物有机体皮 肤、骨骼、肌腱等组织的结构蛋白，起支撑器官和保护机体的作用，约占所有脊椎动物机体 蛋白质的三分之一。胶原的相对分子质量为30万，具有典型的三股螺旋结构，其独特的分子 结构赋予其许多优异的生物学性能，如低抗原性、生物降解性和良好的生物相容性等，常应 用于生物医药、功能保健和化妆品领域。
[0003] 生物表面活性剂(Biosurfactant)是来源于动物或植物等集亲水基和疏水基结构 于一体的具有一定表面活性的物质。与传统化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂 具有更强的表面活性、生物降解性和良好的生物相容性等特点，在工业生产中具有广泛的 潜在的应用价值，正成为最新的研究热点。而胶原不仅具有优异的生物学性能，且类似于生 物表面活性剂，是一种同时含有亲水和疏水氨基酸残基的生物大分子。但是，由于胶原分子 量较大以及相对少且短的疏水基团和亲水基团，导致天然胶原的表面活性较低，因此欲发 挥胶原独特的生物学性能制备生物表面活性剂需通过化学改性来实现。目前，国内外基于 天然胶原制备生物表面活性剂的研究较少，仅有研究者邓茹等采用月桂酸酐(邓茹、李国英 《基于未变性胶原生物表面活性剂的性能研究》）、李从虎等采用月桂酰氯(李从虎、刘文涛、 田振华、段炼、李国英《未变性胶原生物表面活性剂的表面张力及其表面吸附》）以及梁育松 等采用月桂醛(梁育松、刘文涛、李国英《一种保留胶原天然结构的新型生物表面活性剂的 性能表征》)作为疏水长链修饰天然胶原，同时辅以亲水短链琥珀酸酐赋予胶原水溶性，得 到了具有一定表面活性的未变性胶原基生物表面活性剂，其表面张力分别为54.5mN/m、 55.92mN/m和50.5mN/m。由于链长及反应介质的影响，疏水长链较亲水短链更不易接枝成 功，从而使得疏水长链的接枝率成为影响未变性胶原基生物表面活性剂表面张力大小的关 键因素。前期，研究者主要通过探索疏水长链的种类以及疏水长链与亲水短链的比例来降 低未变性胶原基生物表面活性剂的表面张力，初步探索了疏水长链的可选类别，并发现当 疏水长链与亲水短链的接枝率之比接近1:1时得到的未变性胶原基生物表面活性剂的表面 张力最低、表面活性最好，为未变性胶原基生物表面活性剂的进一步研究奠定了基础。但由 于前期胶原与疏水长链均是在有机溶剂中以固液反应的形式接触反应，分散不均且反应效 率较低，具有一定的局限性，使得疏水长链的接枝率一直低于38%，从而导致未变性胶原基 生物表面活性剂的表面张力仍未达到理想要求，因此提高疏水长链的接枝率是降低未变性 胶原基生物表面活性剂表面张力的关键。所以，寻求一种可使胶原与疏水长链既稳定存在 又分散均匀的适当反应介质以提高疏水长链的接枝率成为必需。
[0004] 尚子液体（ionic liquids)是一种恪融盐，由分子量大的有机阳尚子和分子量小 的无机阴离子组成，具有高度的可调节性、与水和有机溶剂可充分混溶、几乎无蒸汽压、离 子导电性高、耐燃且催化性能显著，被称为"绿色溶剂"。由于其阴阳离子的可调节性好，特 别是在蛋白质方面易产生预期的效果，而又被称为"需求特定"或"量体裁衣"型溶剂。离子 液体在蛋白质组学中被研究最多的有机阳离子为咪唑类、季铵类、杂环芳香族类和吡咯烷 鑰盐类，并结合多种阴离子如(^』^、1'，％]、，?幻、[01 30)0-]，形成一种广泛的溶剂。 本发明是利用离子液体高度可调节的性质，使胶原与疏水长链均匀稳定的分散在同一体系 中发生液液反应以提高反应效率，增加疏水长链的接枝率，从而降低未变性胶原基生物表 面活性剂的表面张力。由固液反应到液液反应的改变以及通过调节疏水长链与亲水短链的 比例，可使疏水长链的接枝率提高并控制在45 %~50%，并使疏水长链与亲水短链的接枝 率之比接近1:1，从而使其表面张力降低至40mN/m以下。该发明制得的未变性胶原基生物表 面活性剂，一方面保留了胶原的三股螺旋结构，也就完整保留了胶原的生物学性能；另一方 面其接枝率与表面活性的大幅度提升使其具有良好的表面活性和中性水溶性，拓宽了胶原 在日用品、化妆品、保健品以及生物医用材料领域的应用范围。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足提供以离子液体为反应介质的未变性胶原 基生物表面活性剂及其制备方法，其特点是以离子液体为反应介质并用长链疏水羰基化合 物、短链二元酸酐与未变性天然胶原进行接枝反应，提高了疏水长链的接枝率，所得到的未 变性胶原基生物表面活性剂的表面张力更低、表面活性更好。
[0006] 本发明的目的由以下技术实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。
[0007] 以离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂包括以下原料组分： 未变性天然胶原 1份 离子液体 50~300份
[0008] 长链疏水羰基化合物 0.03~0.3份 短链二元酸酐 0.1-0.5份 有机溶剂 10-30份
[0009] 所述未变性天然胶原为牛皮胶原、猪皮胶原或鱼皮胶原中的任一种。
[0010] 所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-丁基-3甲基咪唑氯盐或磷酸二氢胆碱盐中的任一种。
[0011] 所述长链疏水羰基化合物为辛酸酐、正辛醛、壬酸酐、肉桂醛、正十一醛、月桂酸 酐、月桂酰氯、月桂醛、肉豆蔻酸酐、肉豆蔻醛、棕榈酸酐、棕榈醛、硬脂酸酐、硬脂醛或C8~ Cl8的羰基化合物中的任一种。；
[0012]所述短链二元酸酐为丙二酸酐、丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、庚二酸酐或C2~C8 的二元酸酐中的任一种。
[0013]所述有机溶剂为丙酮、乙醇、聚乙二醇、乙醚、苯甲醚、1-丙醇、2-丙醇、异辛烷、 异丙醚、甲基异丙酮、二甲基亚砜、甲基四氢呋喃或石油醚中的任一种。
[0014]以离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂的制备方法包括以下步 骤：
[0015] (1)将1重量份冷冻干燥的未变性天然胶原溶于50~300重量份的离子液体中，加 入以5~15重量份有机溶剂溶解的0.03~0.3重量份的长链疏水羰基化合物，4~10°C冰浴 下反应6~10h，反应结束后用酸调节pH至9~10,再缓慢加入以5~15重量份有机溶剂溶解 的0.1~0.5重量份的短链二元酸酐，同时用碱将pH稳定在9~10，4~10 °C冰浴下反应3~ 5h;
[0016] (2)反应结束后用酸调节pH至出现沉淀为止，沉淀物用酸调节pH = 4.2~4.6的去 离子水洗涤3~5次，获得所需表面活性良好的未变性胶原基生物表面活性剂。
[0017] 性能测试：
[0018] 1. SDS-PAGE 电泳测定
[0019] SDS-PAGE电泳法(十二烷基硫酸钠 一聚丙烯酰胺凝胶电泳法)测得未变性胶原基 生物表面活性剂的分子量分别为α链10万、β链20万、γ链30万，详见图1所示。结果表明所得 未变性胶原基生物表面活性剂保留了胶原的三股螺旋结构，也就完整保留了胶原的生物活 性。
[0020] 2.接枝率测定
[0021 ]将长链疏水羰基化合物接枝改性的初步样品溶液(0.15mL)与磷酸盐缓冲液(ρΗ = 10.0，1.2mL)和现配0.1 %的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)溶液（1.2mL)混合，在50 °C下水浴 避光反应60min，然后加入2.4mL0. lmol/L的HC1，在室温下反应30min，用紫外分光光度仪在 340nm处测定混合液的吸光度，并用甘氨酸作标准曲线，以天然胶原作为对照。所有样品测 定3次并取平均值。
[0023]所得未变性胶原基生物表面活性剂疏水长链的接枝率稳定在45%~50%。
[0024] 3.表面张力测定
[0025] 将未变性胶原基生物表面活性剂海绵溶解至蒸馏水中制备5mg/mL的母液，并稀释 至一系列浓度作为样品待测液，将天然胶原溶解在0. lmol/L醋酸中作对照。用表面张力仪 0CA-H200采用悬滴法测定样品的表面张力，实验前用蒸馏水多次清洗针管和针头，并以蒸 馏水校准表面张力仪。测样品前，先用待测液多次润洗针管和针头。测试中选择最佳液体挤 出体积，确保液滴处于临界点，测试温度为常温。所得未变性胶原基生物表面活性剂的表面 张力小于40mN/m。
[0026] 本发明具有如下优点：
[0027] 1.本发明得到的未变性胶原基生物表面活性剂保留了胶原的三股螺旋结构，也就 完整保留了胶原的生物学性能。
[0028] 2.本发明得到的未变性胶原基生物表面活性剂，以离子液体为反应介质，扩展了 疏水长链的可选范围，提高了疏水长链的接枝率，所得到的未变性胶原基生物表面活性剂 的表面张力更低、表面活性更好，拓宽了其在日用品、化妆品、保健品以及生物医用材料领 域的应用范围。
[0029] 3.本发明得到的未变性胶原基生物表面活性剂，通过调节疏水长链羰基化合物与 亲水短链二元酸酐的反应摩尔比使其接枝率之比接近1:1，达到丁提高和调控其表面活性 的目的。
【附图说明】
[0030] 图1为未变性胶原基生物表面活性剂的SDS-PAGE电泳(十二烷基硫酸钠一聚丙烯 酰胺凝胶电泳)分析图，1为Marker，2为天然胶原，3为未变性胶原基生物表面活性剂。
【具体实施方式】
[0031] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对 本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可 以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0032] 实施例1
[0033]取冷冻干燥的未变性天然牛皮胶原O.lg于50mL玻璃烧杯中剪碎，并加入5g 1-乙 基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体，持续搅拌5h以充分溶解，然后加入以l.OmL二甲基亚砜溶 解的0.003g的月桂醛，4°C冰浴下反应10h，反应结束后用HC1调节pH至9，再缓慢加入以 0.5mL二甲基亚砜溶解的0.01 g的丁二酸酐，同时用NaOH将pH稳定在9，4°C冰浴下反应5h，反 应结束后加 HC1直至出现沉淀为止，离心后沉淀物用HC1调节pH=4.2~4.6的去离子水洗涤 5次，获得以1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体为反应介质月桂醛和丁二酸酐接枝改性的 未变性胶原基生物表面活性剂。
[0034] 用甘氨酸作标准曲线，并以天然胶原作对照，紫外分光光度仪340nm处测定混合液 的吸光度，计算可得接枝率为48.7 % ;以5mg/mL未变性胶原基生物表面活性剂溶液为母液， 稀释至一系列浓度作为样品待测液，并以天然胶原作对照，用表面张力仪0CA-H200采用悬 滴法测定样品的表面张力，得到未变性胶原基生物表面活性剂的表面张力为37.59mN/m。
[0035] 实施例2
[0036]取冷冻干燥的未变性天然猪皮胶原0. lg于50mL玻璃烧杯中剪碎，并加入20g 1-丁 基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体，持续搅拌5h以充分溶解，然后加入以l.OmL丙酮溶解的 〇. 〇lg的月桂酰氯，6°C冰浴下反应10h，反应结束后用HC1调节pH至9.5，再缓慢加入以1. OmL 丙酮溶解的〇.〇3g的丙二酸酐，同时用NaOH将pH稳定在9.5，6°C冰浴下反应5h，反应结束后 加 HC1直至出现沉淀为止，离心后沉淀物用HC1调节pH=4.2~4.6的去离子水洗涤5次，获得 以1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体为反应介质月桂酰氯和丙二酸酐接枝改性的未变性 胶原基生物表面活性剂。
[0037] 用甘氨酸作标准曲线，并以天然胶原作对照，紫外分光光度仪340nm处测定混合液 的吸光度，计算可得接枝率为50 % ;以5mg/mL未变性胶原基生物表面活性剂溶液为母液，稀 释至一系列浓度作为样品待测液，并以天然胶原作对照，用表面张力仪0CA-H200采用悬滴 法测定样品的表面张力，得到未变性胶原基生物表面活性剂的表面张力为36.27mN/m。
[0038] 实施例3
[0039]取冷冻干燥的未变性天然鱼皮胶原0. lg于50mL玻璃烧杯中剪碎，并加入30g磷酸 二氢胆碱盐离子液体，持续搅拌5h以充分溶解，然后加入以0.5mL乙醚溶解的0.03g的肉豆 蔻酸酐，10°C冰浴下反应10h，反应结束后用HC1调节pH至9，再缓慢加入以1.5mL乙醚溶解的 〇. 〇5g的戊二酸酐，同时用NaOH将pH稳定在9，10°C冰浴下反应5h，反应结束后加 HC1直至出 现沉淀为止，离心后沉淀物用HC1调节pH=4.2~4.6的去离子水洗涤5次，获得以磷酸二氢 胆碱盐离子液体为反应介质肉豆蔻酸酐和戊二酸酐接枝改性的未变性胶原基生物表面活 性剂。
[0040]用甘氨酸作标准曲线，并以天然胶原作对照，紫外分光光度仪340nm处测定混合液 的吸光度，计算可得接枝率为45 % ;以5mg/mL未变性胶原基生物表面活性剂溶液为母液，稀 释至一系列浓度作为样品待测液，并以天然胶原作对照，用表面张力仪0CA-H200采用悬滴 法测定样品的表面张力，得到未变性胶原基生物表面活性剂的表面张力为39.36mN/m。
[0041 ] 应用实例1
[0042]制备作为药物丁卡因吸附载体的未变性胶原基生物表面活性剂微乳 [0043]将实施例1中冷冻干燥的未变性胶原基生物表面活性剂溶于0.01m〇l/L的PBS (pH7.4)中制备7.5mg/mL的溶液。将25g液体石蜡和lg司盘20混合均匀后，加入8.5g上述制 备的未变性胶原基生物表面活性剂溶液，2000rmp搅拌20min。而后加入30mL丙酮，7900rmp 冷冻离心10min，取沉淀，去离子水分散均匀后冷冻干燥，得未变性胶原基生物表面活性剂 微乳。将上述微乳置于去离子水中制备5mg/mL的悬浮液，并加入1.5mg/mL的丁卡因，20°C下 振摇5h，用0.45μπι滤膜过滤并用去离子水洗涤沉淀，收集沉淀冷冻干燥，测定丁卡因的缓释 性能。显微观察所制未变性胶原基生物表面活性剂微乳的粒度很小，形成微乳的能力很强。 所制未变性胶原基生物表面活性剂微乳对丁卡因的饱和吸附量为22.13%，5h后释放达平 衡，释放量为65.36 %。
[0044] 应用实例2
[0045] 制备未变性胶原基生物表面活性剂乳液
[0046]将实施例2中冷冻干燥的未变性胶原基生物表面活性剂溶解于0.01m〇l/L的PBS (pH7 · 4)中制备0 · 4mg/mL的溶液。取20mL该溶液与2mL植物油混合均匀，2000rmp搅拌10min， 得到未变性胶原基生物表面活性剂乳液。所制未变性胶原基生物表面活性剂乳液为ο/w型 乳液，乳化活性ΕΑΙο为312.05m 2/g，乳化活性EAI1Q为275.16m2/g，乳化稳定性ESI为 88.39min〇
【主权项】
1. W离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂，其特征在于该表面活性剂 由W下原料组分组成，按重量份计为： 未变性天然胶原 1份 离子液体 紳~300份 长链疏水鑛基化合物 0.03~0.3份 短链二元酸巧 0.]~0.5份 有机溶剂 10~30份。2. 如权利要求1所述W离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂，其特征 在于未变性天然胶原为牛皮胶原、猪皮胶原或鱼皮胶原中的任一种。3. 如权利要求1所述W离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂，其特征 在于离子液体为1-乙基-3-甲基咪挫醋酸盐、1-下基-3-甲基咪挫醋酸盐、1-下基-3甲基咪 挫氯盐或憐酸二氨胆碱盐中的任一种。4. 如权利要求1所述W离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂，其特征 在于长链疏水幾基化合物为辛酸酢、正辛醒、壬酸酢、肉桂醒、正十一醒、月桂酸酢、月桂酷 氯、月桂醒、肉豆違酸酢、肉豆違醒、栋桐酸酢、栋桐醒、硬脂酸酢、硬脂醒或C8~Cl8的幾基化 合物中的任一种。5. 如权利要求1所述W离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂，其特征 在于短链二元酸酢为丙二酸酢、下二酸酢、戊二酸酢、己二酸酢、庚二酸酢或C2~C8的二元酸 酢中的任一种。6. 如权利要求1所述W离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂，其特征 在于有机溶剂为丙酬、乙醇、聚乙二醇、乙酸、苯甲酸、1-丙醇、2-丙醇、异辛烧、异丙酸、甲 基异丙酬、二甲基亚讽、甲基四氨巧喃或石油酸中的任一种。7. 如权利要求1~6之一所述W离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂 的制备方法，其特征在于该方法包括W下步骤： (1) 将1重量份冷冻干燥的未变性天然胶原溶于50~300重量份的离子液体中，加入W5 ~15重量份有机溶剂溶解的0.03~0.3重量份的长链疏水幾基化合物，4~10°C冰浴下反 应6~lOh，反应结束后用酸调节抑至9~10,再缓慢加入W5~15重量份有机溶剂溶解的0.1 ~0.5重量份的短链二元酸酢，同时用碱将pH稳定在9~10,4~10 °C冰浴下反应3~化； (2) 反应结束后用酸调节pH至出现沉淀为止，沉淀物用酸调节pH = 4.2~4.6的去离子 水洗涂3~5次，获得所需表面活性良好的未变性胶原基生物表面活性剂。8. 如权利要求1所述W离子液体为反应介质的未变性胶原基生物表面活性剂，其特征 在于未变性胶原基生物表面活性剂用于日用品、化妆品、保健品和生物医用材料领域。
【文档编号】A61K47/42GK106076193SQ201610409463
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】李国英, 李倩, 刘文涛
【申请人】四川大学