一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法及其应用，属于天然活性物质领 域。
【背景技术】
[0002] 海洋来源的多糖、蛋白聚糖和胶原蛋白肽是十分重要的天然海洋食品资源，常常 具有显著的生活活性，如海参多糖、海藻多糖等均有许多的研究报道，证实其具有显著的生 物活性。
[0003]中华鳖（Pelodiscus sinensis)，又称甲鱼，具有重要的经济和药用价值，是我国 传统的滋补佳品。《本草纲目》、《中国中医药药典》等历史著作中论其功能有治疗疾病和养 生益寿的双重功效，中华鳖还含有较多的氨基酸、多肽和多糖，对人体的生理活性同样具有 很重要的功能。然而，以中华鳖为原料，从中分离提取制备胶原蛋白肽的研究报道国内外尚 很少见，迄今未见有从中分离提取具有免疫增强活性的胶原蛋白肽的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的一个技术问题是针对上述现有技术提供一种体外抗氧化能力 强和免疫活性强的中华鳖胶原蛋白肽的制备方法。
[0005] 本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述现有技术提供一种通过上述制备 方法所得的中华鳖胶原蛋白肽的应用。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该中华鳖胶原蛋白肽的制备方 法，其特征在于：包括如下步骤：
[0007] (1)预处理：将中华鳖的裙边洗净剪碎，经磷酸缓冲液处理除去杂蛋白及杂质，便 于酶解；
[0008] (2)酶解：将步骤⑴所得的胶原蛋白溶液，向其中加入木瓜蛋白酶进行酶解，将 胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；
[0009] (3)灭酶：对步骤⑵所得到的酶解液进行灭酶，冷却；
[0010] (4)离心：将步骤⑶的酶解液离心，取上清液；
[0011] (5)膜分离：通过膜分离截留上清液中分子量小于lOOOODa的胶原蛋白肽组分；
[0012] (6)浓缩：将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩，便于冻干；
[0013] (7)冻干：将浓缩后上清液冷冻干燥成粉末，即为成品，于干燥条件下贮存起来。
[0014] 进一步地，所述步骤（1)中磷酸缓冲液的浓度为1. 25%，该磷酸缓冲液的添加量 为中华鳖的裙边质量的10~15倍。
[0015] 在酶解的过程中对于的酶解条件得进行综合控制，才能保证胶原蛋白多肽的高提 取率。作为优选，所述步骤（2)中所述木瓜蛋白酶的加酶量为3000~4000U/g、酶解温度为 45~55°C、酶解时间为2~4h、pH值为7. 0~8. 5,所得胶原蛋白肽提取率为40~48. 6%。
[0016] 进一步地，所述步骤（3)中的灭酶步骤为：对步骤（2)所得到的酶解液放入50~ 55°C的沸水浴中加热灭酶，灭酶时间为10~15min。
[0017] 进一步地，所述步骤（4)中酶解液在4000~10000r/min离心15~20min得上清 液。
[0018] 进一步地，所述步骤（5)中的具体操作为：依次采用0.22 ym膜中进行过滤，再选 用分子量l〇〇〇〇Da的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到小于lOOOODa的胶原蛋白肽组 分。
[0019] 运用两次膜分离浓缩胶原蛋白肽，以提高胶原蛋白肽产品的肽含量和纯度，去除 糖类、大分子蛋白等杂质，产品的肽含量可达24. 28 %。
[0020] 进一步地，所述步骤（7)中分离得到的胶原蛋白肽组分于50°C旋转蒸发20~ 30min，并于-80至-20°C冷冻干燥40~48h即得中华鳖胶原蛋白肽产品。
[0021] 本发明还提供一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法在具有免疫增强功能的药品、保 健品、护肤美容用品的制备中的应用。
[0022] 为此本发明通过以下实验进一步说明中华鳖胶原蛋白肽的体外抗氧化性及免疫 增强功能。
[0023] 1.体外抗氧化性研究
[0024]通过铁离子还原体系和具有代表性的02- ?、DPPH ?、? 0H三种自由基体系的实 验，研究胶原蛋白肽体外对自由基的清除效果。以胶原蛋白肽的活性氧和自由基清除能力 作为抗氧化性的指标进行测定。以清除活性氧（02- ?、? 0H、H202)及有机自由基? DPPH能 力作为评价指标。
[0025] 2?体内免疫活性研究
[0026] 通过小鼠的养殖实验研究中华鳖胶原蛋白肽的免疫活性，主要从免疫器官指数的 测定、肝脏抗氧化指标的测定和Cyplal、HSP70的mRNA表达的测定三个方面进行研究。
[0027] 与现有技术相比，本发明的优点在于采用一次性酶法结合膜分离技术提取中华鳖 裙边胶原蛋白肽，用时仅为2~4h，相对一般研究的5_6h，有效降低了酶解时间，另外，胶原 蛋白多肽的分子量决定了其生物活性，分子量较大的多肽片段生物活性较低，运用两次膜 分离浓缩胶原蛋白肽，以分离得到小于l〇〇〇〇Da的胶原蛋白肽，能显著地提高胶原蛋白肽 产品的肽含量和纯度，同时还解决胶原蛋白肽的低生物活性问题；最后将分离出来的胶原 蛋白肽对小鼠去毒相关基因的mRNA表达研究及体外抗氧化性的研究表明，与正常组相比， 胶原肽对小鼠脾脏Cyplal、HSP70基因的表达具有促进作用，且在经膜分离前和经膜分离 后胶原蛋白肽的清除率比较中，经两次膜分离后的胶原蛋白肽，其清除羟基自由基的能力 最强，并且具有一定的剂量效应，因此推测胶原蛋白肽具有较强的体外抗氧化性，同时也能 有效地调节小鼠的细胞免疫和体液免疫功能，说明鳖源胶原蛋白肽可用于开发具有免疫增 强功能的药品、保健品、护肤美容用品等。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例2中的中华鳖胶原蛋白肽清除羟基自由基的能力的示意图 (其中，+为VC，为超滤后样品，为超滤前样品）；
[0029] 图2为本发明实施例3中的中华鳖胶原蛋白肽与Vc抗氧化的能力比较示意图（其 中，?为vc，《?为超滤后样品，-*为超滤前样品）；
[0030] 图3为本发明实施例3中的中华鳖胶原蛋白肽过滤前和过滤后抗氧化的能力比较 不意图（其中，为超滤后样品为超滤如样品）；
[0031] 图4为本发明实施例4中的中华鳖胶原蛋白肽清除有机自由基*DPPH的能力的示 意图（其中，?^为VC，为超滤后样品，?^为超滤前样品）；
[0032] 图5为本发明实施例7中的体内去毒相关基因的mRNA表达的电泳图。
【具体实施方式】
[0033] 以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0034] 实施例1中华鳖胶原蛋白肽的制备
[0035] -种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
[0036] (1)预处理：将中华鳖的裙边洗净剪碎，经浓度为1. 25%的磷酸缓冲液处理除去 杂蛋白及杂质，便于酶解，其中磷酸缓冲液的添加量为中华鳖的裙边质量的10倍；
[0037] (2)酶解：将步骤⑴所得的胶原蛋白溶液，向其中加入4000U/g的木瓜蛋白酶， 在温度55°C和pH值7. 0的条件下酶解4h，胶原蛋白肽的提取率为48% ;
[0038] (3)灭酶：在55°C的沸水浴中加热lOmin灭酶；
[0039] (4)离心：在4000r/min离心15~20min得上清液。取上清液；
[0040] (5)膜分离：依次采用0? 22um膜中进行过滤，再选用分子量lOOOODa的超滤膜截 留离心后的上清液，分离得到小于l〇〇〇〇Da的胶原蛋白肽组分；
[0041] (6)浓缩：将膜分离所得的胶原蛋白肽组分于50°C旋转蒸发20min浓缩；
[0042] (7)冻干：将浓缩后上清液于-20°C冷冻干燥40h即得鳖源胶原蛋白肽产品。
[0043] 实施例2中华鳖胶原蛋白肽清除羟基自由基的能力
[0044] 羟基自由基清除能力测定方法为：在反应体系中加入2. 5mL，9mmol/L FeS04溶液 和2. 5mL，9mmol/L水杨酸一乙醇溶液，再加入2、4、6、8、10mg/mL不同浓度的超滤前的胶原 蛋白肽和超滤后的胶原蛋白肽2. 5mL，超滤前的胶原蛋白肽和超滤后的胶原蛋白肽均溶于