一种基于施氏假单胞菌细胞催化的秦皮甲素羟基保护反应方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物催化及生物医药合成与控制领域，具体涉及一种基于施氏假单胞 菌细胞催化的秦皮甲素羟基保护反应方法。
【背景技术】
[0002] 黄酮类化合物是两个苯环通过三个碳原子相互连接而形成的一系列重要的多酚 类化合物，广泛存在于几乎所有的植物，尤其是蔬菜和水果；在医药、食品和化妆品上有很 大的应用价值。黄酮有多种生物活性包括抗氧化活性，抗炎，抗癌的，抗菌，抗过敏和抗 病毒等，然而，由于其多羟基结构的特点，大部分黄酮生物活性受限于其低脂溶性或水溶 性。位于苯环或配糖体骨架上的羟基对黄酮的生物和化学活性有重要的影响。黄酮的酯化 被认为一种很有前景的方法用于提高黄酮的溶解度，从而使黄酮展示出更多的生理活性。 已有研究表明，有选择地修饰黄酮类化合物结构不仅可以提高物理化学属性，例如，热稳 定性和脂溶性；而且增强其生物活性，如抗氧化活性；抗菌活性；细胞渗透能力；减肥和降 血脂功能。
[0003] 秦皮甲素水合物是黄酮的一种，具有抗炎、抗菌、抗血凝、镇痛等活性，是枯草杆菌 的生长抑制剂，同时对化学性致癌亦有抑制作用。秦皮甲素水合物有5个羟基，分布在苯 环或者糖环上。环上的羟基对其活性有重要的影响，因此选择性的对秦皮甲素水合物的羟 基进行酯化具有重要的意思，即可以保持其活性又可以增加其溶解度来增加其他方面的活 性。
【发明内容】
[0004] 利用传统的化学方法通常难以对特定的羟基进行保护，本发明目的在于开发一种 保护秦皮甲素水合物6'羟基的方法。施氏假单胞菌细胞促秦皮甲素水合物酰化反应的最 适有机溶剂、酰基供体、酰基供体与秦皮甲素水合物摩尔比、初始水含量、施氏假单胞菌细 胞催化剂用量、反应温度和振荡速度分别为50% (v/v)异辛烷-吡啶、丙酸乙烯酯（VP)、 20:1、0 %(v/v)、20g/L、40°C和180rpm，反应产率可达98.9 %。反应条件对施氏假单胞菌细 胞在秦皮甲素水合物丙酰化反应中的区域选择性影响不大，6' -区域选择性保持在94%以 上。
[0005] 该方法所用的催化剂制备简单易操作，反应条件温和，产率高，初速度快，羟基保 护区域选择性可控制，克服了传统化学方法的选择性低而导致底物利用率低，产物纯度低， 易生成副产物等缺点。
[0006] 本发明目的通过以下技术方案来实现：
[0007] -种基于施氏假单胞菌细胞催化的秦皮甲素羟基保护反应方法，包括以下步骤：
[0008] 1)制作施氏假单胞菌细胞催化剂：将细菌种子液接种至含产酶诱导剂的液体培 养基中，接种量为〇. 5%~20% (v/v)，培养条件为30°C~50°C，培养时间为12~144h ;离 心后收集菌体，蒸馏水洗涤两次，经真空冷冻干燥12h-36h，收获菌体干粉，即为细菌细胞催 化剂；
[0009] 2)在带塞三角瓶中加入有机溶剂；
[0010] 3)加入黄酮类水合物；
[0011] 4)加入酰基供体，形成有机溶剂反应体系；
[0012] 5)在有机溶剂反应体系中加入0~160 y L水；
[0013] 6)加入施氏假单胞菌细胞催化剂使整个反应体系最终质量为20~160mg，混合均 匀；
[0014] 7)置于水浴恒温振荡器反应，震荡速度为100~260rpm。
[0015] 进一步地，可适当改变步骤2)所述带塞三角瓶的体积来放大或缩小反应体系体 积；带塞三角瓶体积为10mL ;步骤2)所述有机溶剂是单一种类有机溶剂或混合有机溶剂， 其中单一种类有机溶剂是吡啶，混合有机溶剂是乙腈-吡啶、叔丁醇-吡啶、叔戊醇-吡啶、 四氢呋喃-吡啶、正己烷-吡啶、异丙醚-吡啶、石油醚-吡啶或异辛烷-吡啶；步骤2)所 述有机溶剂为2mL体积比为1:1的异辛烷-吡啶；
[0016] 进一步地，步骤3)所述黄酮类水合物用量为10mmol/L-90mmol的秦皮甲素水合 物；
[0017] 进一步地，步骤4)所述酰基供体为用量为60~2400mmol的丙酸乙稀酯；
[0018] 进一步地，步骤5)所使用水为超纯水或双蒸水；反应温度控制方法为水浴摇床恒 温震荡器水浴或恒温摇瓶柜气浴等；
[0019] 进一步地，步骤7)所述反应温度为20 °C~50 °C。
[0020] 进一步优化地，所述方法具体包括以下步骤：
[0021] 1)制作施氏假单胞菌细胞催化剂；
[0022] 2)在10mL带塞三角瓶中加入2mL有机溶剂，可为纯机溶剂或混合有机溶剂；
[0023] 3)加入秦皮甲素水合物；
[0024] 4)加入酰基供体丙酸乙烯酯，用量为60~2400mmol ;
[0025] 5)在2mL50% (v/v)异辛烷-吡啶反应体系中加入0-160 y L水；
[0026] 6)在2mL 50% (v/v)异辛烷-吡啶（VP)反应体系中加入施氏假单胞菌细胞催化 剂使整个反应体系最终质量为20~160mg ;
[0027] 8)秦皮甲素水合物羟基保护时反应温度范围为20°C~50°C，水浴恒温振荡器反 应；
[0028] 9)在水浴恒温振荡器振荡反应，速度为100~260rpm。
[0029] 步骤2)中反应所使用的三角瓶体积不限于10mL，反应体系可适当放大或缩小；有 机溶剂是单一种类有机溶剂如吡啶或是混合有机溶剂，如乙腈-吡啶、叔丁醇-吡啶、叔戊 醇-吡啶、四氢呋喃-吡啶、正己烷-吡啶、异丙醚-吡啶、石油醚-吡啶或异辛烷-吡啶； 最佳混合有机溶剂为异辛烷-吡啶，所有混合有机溶剂最佳配比均为1 :1 (v/v)，但不限于 此配比。
[0030] 步骤7)恒温震荡器不限于水浴摇床，如恒温摇瓶柜等气浴条件也可。
[0031] 本发明与现有的技术相比具有如下的优点：
[0032] 1.利用施氏假单胞菌细胞催化剂作为生物催化剂，较之化学催化剂反应条件温 和、环境友好；较之酶催化剂成本低。
[0033] 2.该方法催化剂制备简单易操作，酰基供体丙酸乙烯酯常用易购买，初速度快，产 率高，区域选择性高，克服了传统化学方法的选择性低导致底物利用率低，产物纯度低，易 生成副产物等缺点。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于 此。
[0035] 实施例1
[0036] 在10mL带塞三角瓶中加入2mL吡啶、60mmol秦皮甲素水合物、1200mmol丙酸乙 烯酯和80mg施氏假单胞菌细胞催化剂，混合均匀，置于水浴恒温振荡器反应（40°C、180r/ min)，定时取样20 iil，用60% (体积分数，下同）甲醇-水混合溶液稀释50倍，混合均匀 后离心（15, 000r/min) 15min，自动进样器取上清液20 y 1，供高效液相色谱分析。在纯溶剂 吡啶中施氏假单胞菌细胞可以催化秦皮甲素水合物发生酰化反应，24后产率为16. 7 %，6 ' 区域选择性为98. 6% ?
[0037] 菌种培养方法：斜面培养基，营养肉汤培养基；种子液培养24h后接种到发酵培 养基中，接种量为2% (V/v)，180r/m，30°C，培养48h。种子液培养基（w/v)为1%葡萄 糖，1% 牛肉膏，1% 蛋白胨，0.5% K2HP04,0 . 02%MgS04, 7H20,0.5% NaCl，pH 7.0±0. 1 ; 发酵培养基（￥八）为0.5%大豆油，0.1%酵母浸膏，0.5%(順4)230 4,0.1%1(2册04,0 . 02% MgS04 ? 7H20〇
[0038] 实施例2
[0039] 在8个lOmL带塞三角瓶中均加入60mmol秦皮甲素水合物和1200mmol丙酸乙烯 酯，再向8个带塞三角瓶中分别加入2mL混合有机溶剂（体积分数为25%的乙腈-吡啶、 体积分数为25%的叔丁醇-吡啶、体积分数为25%的叔戊醇-吡啶、体积分数为25%的四 氢呋喃-吡啶、体积分数为25%的正己烷-吡啶、体积分数为25%的异丙醚-吡啶、体积分 数为25 %的石油醚-吡啶，体积分数为25 %的异辛烷-吡啶），最后向每个带塞三角瓶中 均加入80mg施氏假单胞菌细胞催化剂，混合均匀，置于水浴恒温振荡器反应（40°C、180r/ min)，定时取样10 y 1，用40%甲醇-水混合溶液稀释100倍，混合均匀后离心（15, OOOr/ min) 15min，自动进样器取上清液20 y 1，供高效液相色谱分析。反应结果如表1。
[0040] 表1含吡啶混合有机溶剂对施氏假单胞菌细胞促秦皮甲素水合物丙酰化反应的 影响
[0041 ]
[0042] 反应条件：2mL混合有机溶剂，80m施氏假单胞菌细胞催化剂，60mmol秦皮甲素水 合物，1200mmol丙酸乙稀酯，40°C，180rpm，反应24h。
[0043] a体积分数，v/v。
[0044] 实施例3
[0045] 在9个10mL带塞三角瓶中均加入60mmol秦皮甲素水合物和1200mmol丙酸乙稀 酯（VA)，再向10个带塞三角瓶中分别加入2mL不同体积分数的混合有机溶剂异辛烷-吡 啶（0%、5%、10%、15%、20%、30%，35%，40%，50% )，最后向