一种产角蛋白酶的甜菜假单胞菌及其应用
【专利摘要】本发明提供一种产角蛋白酶的甜菜假单胞菌，其保藏号为CGMCC No.12183。本发明还提供该产角蛋白酶的甜菜假单胞菌在降解角蛋白上的应用，当发酵培养24h后，对羽毛的降解率可高达60％，其角蛋白酶酶活达到35.6U/mL，该产角蛋白酶的甜菜假单胞菌在降解和再利用含有角蛋白的畜禽业废弃物领域具有较可观的应用前景。CGMCC No.1218320160307
【专利说明】
一种产角蛋白酶的甜菜假单胞菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种微生物技术，具体涉及一种产角蛋白酶的甜菜假单胞菌及其应 用。
【背景技术】
[0002] 羽毛是重要的蛋白质资源，其蛋白含量高达85-90%。但由于其主要成分角蛋白是 一种具有极强抗性、难生物降解的硬蛋白，难以直接利用，而传统的物理和化学加工方法 (高温高压、酸碱处理等）不仅消耗大量能源还引发严重的环境污染问题。目前我国养殖业 中每年产生的羽毛废弃物百万余吨，随着我国养殖业的不断发展其数量还在持续增长，实 现废弃资源的高值转化和循环利用已是必然选择。研究角蛋白资源的转化及应用，对含有 羽毛、毛发等角蛋白成分的养殖业废弃物的无害转化以及对和角蛋白有相似结构的物质的 转化均具有重要理论价值和创新意义。
[0003] 角蛋白酶(keratinase)是一种主要由真菌、放线菌、细菌等微生物产生，可特异降 解角蛋白的蛋白酶。利用自然界中微生物分泌的角蛋白酶特异性地消化羽毛等角蛋白，将 角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸，以作为一种饲科蛋白质应用于畜禽的饲养，从而 变废为宝，既能保护环境又利用资源，这也将具有十分显著的经济效益和深远的社会效益。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种产角蛋白酶的甜菜假单胞 菌。
[0005] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0006] 一种产角蛋白酶的甜菜假单胞菌，该菌种于2016年03月07日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为 CGMCC No. 12183,其分类命名为甜菜假单胞菌Pseudomonas beteli〇
[0007] 该产角蛋白酶的甜菜假单胞菌的序列号为SEQ ID No. 1。
[0008] 本发明的目的之二在于提供上述产角蛋白酶的甜菜假单胞菌在降解角蛋白上的 应用。
[0009] 本发明的目的之三在于提供产角蛋白酶的甜菜假单胞菌降解角蛋白的方法，包括 以下步骤：
[0010] 1)取含有角蛋白的待降解物，加入无机液体培养基中；
[0011] 2)向步骤1)所述的无机液体培养基中加入甜菜假单胞菌菌株；
[0012] 3)将步骤2)后的无机液体培养基于27-47Γ震荡至待降解物大部分降解。
[0013] 作为优选，步骤1)中，戶斤述无机液体培养基的pH值= 4-11。
[0014] 作为优选，步骤1)中，所述无机液体培养基的pH值= 10。
[0015] 作为优选，步骤2)中，甜菜假单胞菌菌株的添加量为无机液体培养基体积的1 %。
[0016] 作为优选，步骤1)中，所述无机液体培养基包括按重量份计的以下组分：1份 Κ2ΗΡ〇4,0·5份Mg2S〇4 · 7Η20,0·5份NaCl，0.1份lOOg/L的FeS〇4 · 7H20,调节pH量的H2S〇4或 NaOH溶液，补足至1000份的双蒸水。
[0017]相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0018] 本发明针对养殖业中出现的环境污染和资源浪费的问题，提供一株甜菜假单胞 菌，该甜菜假单胞菌在以完整羽毛为唯一碳氮源的PH值为10的无机液体培养基中32°C培养 24h后，羽毛降解率达60%，角蛋白酶酶活达到35.6U/mL，该产角蛋白酶的甜菜假单胞菌在 降解和再利用含有角蛋白的畜禽业废物领域具有较可观的应用前景。
[0019] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0020] 图1为甜菜假单胞菌Dl的透射电子显微镜照片；
[0021]图2为甜菜假单胞菌Dl及部分相关菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树；
[0022] 图3为不同起始pH值下甜菜假单胞菌Dl降解羽毛的速率图；
[0023] 图4为不同发酵温度下甜菜假单胞菌Dl降解羽毛的速率图。
【具体实施方式】
[0024] 本实施例中，如未特殊说明，所采用试剂或仪器均为市售。以下实施例中，土壤样 品采自于广东温氏食品集团股份有限公司某鸡场。
[0025] 实施例1:角蛋白酶产生菌的分离培养
[0026] 将采集的土壤样品置于无菌蒸馏水中混匀，静置取上清液，进行梯度稀释(稀释至 10'10'10'，分别涂布于牛奶琼脂平板培养基上，37°(：恒温箱中倒置培养2411。挑选能产 生透明降解圈的单个菌落，接种于含有一根约〇.5g的羽毛的无机液体培养基中，37°C， ISOrpm震荡培养72h。挑选羽毛降解明显的菌株培养液，接种至新的无机液体培养基上进行 复筛培养。
[0027]将复筛得到的菌株接种于含有一根完整羽毛和50mL无机液体培养基的250mL锥形 瓶中，35°C，200rpm震荡培养48h，观察羽毛的降解情况，筛选出羽毛降解能力较强的菌株， 编号为目的菌株Dl，保种备用。
[0028] 本实施例中，牛奶琼脂平板培养基成分：氯化钠10 . Og，琼脂粉20 . Og，脱脂奶粉 5. Og，双蒸水补足至1000mL。
[0029] 本实施例中，无机液体培养基成分：lg K2HP〇4,0.5g Mg2S〇4 · 7H20,0.5g NaCl， O.lmL lOOg/L的FeS〇4 · 7H20,调节pH值的H2S〇4或NaOH溶液，补足至1000 mL的双蒸水。
[0030] 实施例2:角蛋白酶产生菌的鉴定 [0031] 实施例2A)形态特征
[0032]将分离纯化的目的菌株Dl划线接种牛奶琼脂平板培养基，37°C培养24h。肉眼观察 菌落的形状、颜色、表面质地以及菌落边缘。光学显微镜和透射电子显微镜观察菌体形态。 参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株的生理生化特性进行鉴定，初步分类。
[0033]目的菌落在透射电子显微镜照片下的形状如图1所示。该目的菌株Dl的菌落在牛 奶琼脂平板培养基上培养24h后产生透明降解圈，菌落呈黄色单菌落，边缘光滑;革兰氏染 色阴性;短链杆状，无芽孢，无荚膜，有鞭毛。
[0034] 实施例2B)生理生化特征
[0035]经生理生化测定，目的菌株Dl能够水解牛奶、明胶，具有角蛋白酶活性;能水解七 叶苷，具有葡萄糖苷酶活性;能利用柠檬酸盐;硝酸还原测定结果为阳性。具体的生理生化 特征见表1。
[0036]表1甜菜假单胞菌的生理生化特征
[0039] 注:+表示阳性;-表示阴性 [0040]实施例2C)16S rDNA鉴定
[0041 ]测定目的菌株01的163扣嫩序列，经661113&111<:(111^。：//11(313；[.111111.11；[11.80￥/131^\31') 核酸数据库作比对分析(blasting)，与已知菌群的16S rDNA基因序列进行比较，调出与其 序列同源性较高的相关菌株的16S rDNA序列，计算测定目的菌株Dl的核苷酸序列及其同源 序列的遗传距离，用邻接法(Neighbor-joining)推演系统发生关系，构建系统发育树。 [0042]采用菌种鉴定通用引物，扩增目的菌株Dl的16S rDNA序列，并送上海生工生物工 程股份有限公司测序。PCR扩增所用引物、体系、程序如表2-4所示：
[0043] 表2扩增引物
[0050] 测序结果如SEQ ID No. 1所示。经GenBank核酸数据库与已知菌群的16S rDNA基因 序列比对分析，调出与其序列同源性较高的相关菌株的16S rDNA序列，计算目的菌株的核 苷酸序列及其同源序列的遗传距离，用邻接(Neighbor-joining)推演系统发生关系，构建 系统发育树见图2。综合形态学分析、生理生化分析及16S rDNA鉴定，目的菌株Dl为甜菜假 单胞菌，记为甜菜假单胞菌Dl。
[0051] 实施例3:培养条件的初步优化
[0052] 实施例3A)不同起始pH值的选择
[0053] 分别取Ig K2HP〇4,0.5g Mg2S〇4 · 7H20,0.5g NaCl和O.lmL 100g/L的FeS〇4 · 7H20 配成8份无机液体培养基，该8份无机液体培养基分别使用IM硫酸或IM的NaOH溶液调节pH至 4、5、6、7、8、9、10和11，加双蒸水补足至1000111匕
[0054]取甜菜假单胞菌Dl的菌种0.5mL，添加至上述不同pH值的无机液体培养基中，以 220r/min转速于37°C培养24h，测定羽毛的降解率。不同起始pH值下的降解率如图3所示， 当无机液体培养基的起始pH为10时，降解率最高。
[0055]实施例3B)不同发酵温度的选择
[0056]取甜菜假单胞菌Dl的菌种0.5mL，分别添加至5份pH为10的无机液体培养基中，以 220r/min的转速分别于不同温度(27°C，32°C，37°C，42°C，47°C )下培养24h，测定羽毛的降 解率。
[0057] 不同发酵温度下甜菜假单胞菌Dl降解羽毛的影响如图4所示，由图4可知，培养温 度为27-32°C时，起始pH为10时，降解效率较高，可达60% ;而当培养温度由32°C上升至42°C 时，降解速率呈较大的下降趋势。
[0058] 实施例3C)角蛋白酶酶活测定
[0059]角蛋白酶酶活定义为:每毫升酶液在规定条件下反应15min后OD值增加0.01为1个 酶活单位。
[0060] (1)取IOg的偶氮蛋白加入至1600mL pH=7.4的磷酸缓冲液；
[0061] (2)用移液枪量取3.2mL上述磷酸缓冲液于试管中，32°C水浴中预热2min;
[0062] (3)加入粗酶液0.8mL，在32 °C水浴中保温反应15min;
[0063] 该步骤(3)中，所述粗酶液为实施例3B)中的甜菜假单胞菌Dl的菌种在含有一根羽 毛的起始pH为10的无机液体培养基，32°C摇床震荡培养24h后，经离心分离后得到的上清 液；
[0064] (4)加入质量分数10%三氯乙酸0.8mL，终止酶反应；
[0065] (5)反应液于10000r/min下离心6min，并在450nm下测定吸光值；
[0066] (6)反应时加空白对照，空白对照在反应液中先添加10 %三氯乙酸0.8mL，再加酶 液0·8mL。
[0067] 当发酵液的起始pH= 10，发酵温度为32°C时，粗酶液角蛋白酶活性为35.6U/mL。
[0068] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种产角蛋白酶的甜菜假单胞菌，其特征在于，其保藏号为CGMCC No. 12183。2. 如权利要求1所述的产角蛋白酶的甜菜假单胞菌在降解角蛋白上的应用。3. 利用如利要求1所述的产角蛋白酶的甜菜假单胞菌降解角蛋白的方法，包括以下步 骤： 1) 取含有角蛋白的待降解物，加入无机液体培养基中； 2) 向步骤1)所述的无机液体培养基中加入甜菜假单胞菌菌株； 3) 将步骤2)后的无机液体培养基于27-47Γ震荡至待降解物大部分降解。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述无机液体培养基的pH值=4- 11〇5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述无机液体培养基的pH值=10。6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，甜菜假单胞菌菌株的添加量为无 机液体培养基体积的1 %。7. 如权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述无机液体培养基包 括按重量份计的以下组分：1份K2HPO4，0.5份Mg 2S〇4 · 7H20，0.5份NaCl，0.1份100g/L的 FeS〇4 · 7H20,调节pH量的H2S〇4或NaOH溶液，补足至1000份的双蒸水。
【文档编号】C12N1/20GK105861374SQ201610274637
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】黄妙容, 钟楚红, 刘传高, 任广彩, 陈瑞爱, 叶俊贤
【申请人】广东温氏大华农生物科技有限公司, 肇庆大华农生物药品有限公司