一种半夏半胱氨酸蛋白酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体设及一种半夏半脫氨酸蛋白酶 及其应用。
【背景技术】
[0002] 种子的萌发对于农作物具有关键的作用，玉米，大豆，烟草，水稻等粮食和经济作 物已经实现了
[0003] 动物来源的半脫氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶B、H、L等，一般存在于溶酶体，主要 参与细胞吞隧和细胞内多余物质的清除和消化。近年来组织蛋白酶B(CathepsinB，CB)的 作用日受重视。正常组织中分离到的CB最适PH为酸性，在中性或碱性条件下无活性，但肿 瘤组织中CB却在中性或碱性时活性更高，运似乎更适宜于恶性肿瘤的代谢素乱。CB能降 解I型胶原、LN、PG，并能活化间质胶原酶原和IV型胶原酶原，降解基质中的I、II、III和 IV型胶原纤维。因而参与肿瘤的浸润转移。SmidL检测喉癌的癌组织和癌旁组织中的半 脫氨酸蛋白酶及其抑制剂的浓度，结果发现癌组织中半脫氨酸蛋白酶及其抑制剂的浓度均 明显高于癌旁组织中的浓度，表明它们可能参与肿瘤浸润的全过程。
[0004] 植物来源的半脫氨酸蛋白酶功能比较复杂，专利201010121565. 7公开了一种半 脫氨酸蛋白酶在增强植物介导的昆虫RNA干扰的作用，该发明将半脫氨酸蛋白酶基因转入 双子叶或者单子叶的植物中，可W改善植物的抗虫性。专利201410497324. 0公开了一种四 翅滨襲半脫氨酸蛋白酶的基因克隆及其应用。并且检测到该蛋白在干旱和盐胁迫的情况下 响应，起到抗旱和抗盐的效果，其转基因植物的抗逆性增强。
[0005]目前，尚未有从药用植物半夏中克隆半脫氨酸蛋白酶基因并研究其功能的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种半夏半脫氨酸蛋白酶及其应用。本发明在天然有毒的 中药材半夏中克隆得到了一个半夏半脫氨酸蛋白酶，该蛋白具有促进种子萌发，美白皮肤， 消除黄褐斑，和抗干旱的功能。
[0007] -种半夏半脫氨酸蛋白酶，所述半夏半脫氨酸蛋白酶的氨基酸序列如序列表SEQ IDN01所示。
[0008] 所述半夏半脫氨酸蛋白酶的基因序列如序列表SEQIDN02所示。
[0009] 所述半夏半脫氨酸蛋白酶的基因载体。
[0010] 所述半夏半脫氨酸蛋白酶的基因载体的宿主菌。
[0011] 扩增所述的半夏半脫氨酸蛋白酶中任一片段的引物。
[0012] 一种半夏半脫氨酸蛋白酶突变体，所述半夏半脫氨酸蛋白酶的突变体氨基酸序列 如序列表SEQIDN03所示。
[0013] 所述半夏半脫氨酸蛋白酶抑制剂突变体的基因序列如序列表SEQIDN04所示。
[0014] 所述半夏半脫氨酸蛋白酶或所述半夏半脫氨酸蛋白酶突变体在促进种子萌发，美 白皮肤，消除黄褐斑，和植物抗干旱中的应用。
[0015] 本发明的有益效果：本发明在天然有毒的中药材半夏中克隆得到了一个半夏半脫 氨酸蛋白酶基因，经研究，该基因具有明显的促进种子萌发，美白皮肤，消除黄褐斑，和植物 抗干旱的作用。本发明还发现了上述半夏半脫氨酸蛋白酶的一个突变体，该突变体蛋白具 有更高的促进种子萌发，美白皮肤，消除黄褐斑，和植物抗干旱的作用，且在体内不容易降 解，半衰期长。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明克隆的半夏半脫氨酸蛋白酶基因鉴定电泳图；
[0017] 图中，Maker:500bpMaleH500bp、1000bp、1500bp、3000bp、5000bp、7500bp、 lOOOObp、15000bp)，1.p2301-PtCP/EcoRI+BamHI(1162化p+2inbp)。
[0018] 图2为本发明构建的pCAMBIA2301-PtCP载体结构示意图。
[0019] 图3为表达载体的酶切鉴定图；
[0020] 图中，Μ:λΟΝΑHindlll/EcoRIMarker;1:SacII与EcoRI(10606bp巧42化P) ;2 : BamHI与EcoRI(11600bp+1423bp) ;3 :BgllU9758bp+3274bp)。
[0021] 图4为本发明纯化的半夏半脫氨酸蛋白酶蛋白鉴定图；
[0022] 图中，Μ:蛋白Maker, 1、2、3、4、5:PtCP蛋白纯化样品（48. 8邸）。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0024]W下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆 实验指南》第Ξ版相应部分（J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社）或参阅所用试剂 盒的说明书。
[0025] 实施例1
[0026] 提取半夏块茎中总mRNA，将所得到的mRNA打断成300-50化P的核酸序列，进行高 通量测序，构建半夏块茎基因表达文库，该工作由北京安诺优达生物技术公司完成；具体实 验步骤如下：
[0027] >RNA质量检测
[002引今1 %的琼脂糖电泳检测RNA样品是否有降解W及杂质；
[0029] 今NanoPhotometer⑧分光光度计检测样品纯度（IMPLEN，CA，USA);
[0030]今Qubit⑩2. 0FlurometeHLifeTechnologies,CA，USA)检测RNA样品浓度； [00；31]今Agilent2100RNANano6000AssayKit(AgilentTechnologies,CA，USA) 检测RNA样品的完整性。
[003引 >RNA转录组文库制备
[0033] 每个样品取3ug总RNA作为起始原料来构建文库。根据肥BNextRNA超快速文库 制备试剂盒-Illumina(組7530L，肥B)的操作说明分别选取不同的index标签建库。
[0034] 过程：首用试剂盒富集mRNA，富集后的mRNA中加入化agmentationbuffer使其片 断化成为短片段，再W片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexamers)合成 cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNaseΗ和DMpolymeraseI合成cDNA第二链，经过 Qia如ickPCR试剂盒纯化并加邸缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A,加测序接头，再经琼脂 糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作。
[0035] > 库检
[0036] 文库构建完成后，先使用如bit2. 0进行初步定量，稀释文库至Ing/ul，随后使用 Agilent2100对文库的inse;rtsize进行检测，inse;rtsize符合预期后，使用Bio-RAD CFX96巧光定量PCR仪，Bio-RADΙαΤiQSYBRGRN进行Q-PCR，对文库的有效浓度进行准 确定量（文库有效浓度> 2nM)，W保证文库质量。
[0037] >库成簇（clustering)与测序
[0038]使用TruSeq阳ClusterKitv3-cBot-服（Illumia)试剂在cBot上生成簇。之 后在化Seq2500测序平台上运行双端测序程序（PE100)，得到l(K)bp的双端测序reads。
[0039] 测序拼接获得的半脫氨酸蛋白酶基因（核巧酸序列如序列表SEQIDN05所 示，鉴定图如图1所示）构建CaMV35S启动子驱动，CaMV35S-PolA终止的植物表达载体 (pCAMBIA2301-PtCP，如图2-3所示），并通过农杆菌介导法转化烟草，获得了 35S启动子驱 动PtCP基因的转基因烟草植株。
[0040]克隆得到的PtCP基因表达框：EcoRI-CaMV35S-PtCP-CaMV35S-PolA-BamHI，经双 酶切连接载体pCAMBIA2301-PtCP。
[0041] 通过常规方法获得纯化目的蛋白并鉴定，如图4所示。
[004引 实施例2
[0043] 利用p2300-35S-PtCP植物表达载体为模版，通过重叠延伸PCR的方法获得突变 体，突变位点为第9位氨基酸G变为P。重新构建植物表达载体p2300-35S-PtCP2,并通过