一种ebv lmp1蛋白的功能抑制剂及应用
【专利摘要】本发明对天然小分子化合物EGCG与EB病毒致瘤蛋白LMP1的相互作用进行了一系列研究，确定EBV LMP1可作为天然小分子化合物EGCG的分子靶标，即，天然小分子化合物EGCG可作为EBV LMP1蛋白的功能抑制剂，为EGCG介导的肿瘤化学预防和治疗效应提供新的证据。
【专利说明】
一种EBV LMP1蛋白的功能抑制剂及应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种EBV LMP1蛋白的功能抑制剂及应用。【背景技术】
[0002]EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)也称为人类疱疹病毒4型，是第一个被发现与人类肿瘤直接相关的病毒。据统计，全世界超过90 %的人群感染过该病毒。国际癌症研究署 (IARC)2008年发布的世界癌症报告指出，EB病毒引发了全球癌症的1%，占所有感染性癌症的5.6 %。根据I ARC对致癌因子的分类标准，EB病毒被列在第一组致癌因子中。EB病毒与多种特定的人类肿瘤的发生密切相关，包括鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和胃癌等。美国国家卫生研究院(NIH)已将EBV列为减少全球癌症负担的重要因子。
[0003]在宿主细胞内，EB病毒的感染方式可分为两种形式:①潜伏感染，病毒基因组以环状分子形式游离于细胞DNA细胞染色体之外，仅有少量的病毒基因表达，其基因组伴随每个细胞周期复制一次，不释放病毒。②裂解复制感染，也称作生产性感染，病毒基因组以线型分子形式插入宿主细胞染色体DNA中，进行完整的DNA复制、转录、翻译和病毒装配，并释放病毒颗粒，导致细胞裂解。在EB病毒阳性肿瘤中，该病毒主要以潜伏状态存在。
[0004]EB病毒编码的潜伏膜蛋白LMP1是重要的致瘤蛋白。LMP1由386个氨基酸组成，包括 3个不同的结构域:①24个氨基酸残基组成的胞浆氨基末端(N末端)；②6个疏水性跨膜区 (25?186位氨基酸)；③200个氨基酸残基组成的胞浆羧基末端(C末端)，其包含3个重要的C 末端激活结构域(C terminal activating reg1ns，CTARs):CTARl、CTAR2和CTAR3。研究表明，LMP1通过其C末端CTARs募集肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factors，TRAFs)和肿瘤坏死因子受体相关的死亡结构域(TNFR associated dead domain protein，TRADDs)并组成性活化这些蛋白，介导LMP1胞衆信号通路的活化。LMP1通过激活陬-仙、从1(3/5141'、]\^?1(8(￡狀、？38和见1〇、？131(/^肚等信号通路， 影响上皮细胞生长因子受体、抗凋亡基因bcl-2和survivin以及与细胞周期相关的基因 cyclinDl、⑶K4和P53等，控制细胞的增殖和凋亡，使上皮细胞发生转化，从而诱发肿瘤的形成。此外，LMP1促进侵袭转移因子E-cadherin、ICAMl、MMP9以及血管内皮生长因子的表达， 在肿瘤的侵袭和转移中起重要作用。由于LMP1在EBV阳性肿瘤的发生、发展、转移多阶段具有重要功能，已被确定为鼻咽癌存活的标志物。因此，EBV LMP1已成为EBV阳性肿瘤的治疗靶点。
[0005]表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigall〇CateChingallate，EGCG)，又称为表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，是一种从绿茶中提取的多酚类化合物。EGCG的化学式是C22H18〇n，分子量为458.4,是一种具有抗氧化、抗肿瘤和抗病毒等多种生物活性的小分子化合物。研究表明，EGCG可调节酶活性及信号传导通路，抑制细胞生长和增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和周期阻滞，并通过抑制肿瘤新生血管的生成，发挥抗肿瘤细胞侵袭和转移的功能，从而在多阶段发挥抗肿瘤功能，在肿瘤化学预防以及治疗中发挥重要作用。研究揭示，EGCG对其分子靶标的结合是EGCG抗肿瘤活性的结构基础，高亲和力的EGCG结合蛋白可能是EGCG的直接作用靶标。目前，已经鉴定了EGCG的多个分子祀标，如脂後膜分子laminin和67-kDa laminin受体、 vimentin、胞浆蛋白ZAP-70、Fyn以及分子伴侣GRP-78等，这些分子靶标多为细胞膜蛋白或其受体，与EGCG具有较高的亲和力。研究证实，肿瘤病毒可以编码相应的致瘤蛋白，并通过与宿主细胞内的其他蛋白相互作用影响其正常的功能，以诱导肿瘤的发生。因此，发现EGCG 的病毒编码分子靶标将对肿瘤化学预防和治疗以及针对其分子靶标开发新抗肿瘤药物提供新的重要启示。
[0006]EGCG是具有广谱抗肿瘤活性的天然小分子化合物，对多发性骨髓瘤、人结肠癌、胰腺癌以及人头颈部肿瘤等均有抑制生长的作用。在不同类型的肿瘤中，EGCG发挥抗肿瘤作用的机制不尽相同。此外，EGCG具有抗病毒活性，其抗病毒谱涵盖多个病毒家族，包括EBV， HIV，HCV等多种重要的人类致瘤病毒。因此，对EBV引发的肿瘤，EGCG的抗病毒活性是发挥其抗肿瘤作用的重要方式。国际癌症研究署(IARC)2008年发布的世界癌症报告指出，EB病毒引发了全球癌症的1%，占所有感染性癌症的5.6%，说明不是所有的肿瘤均由病毒感染引发。对于致病机理与病毒感染无关的肿瘤而言，EGCG的抗肿瘤活性则需要通过其他途径实现。EGCG的抗肿瘤机制包括:作为抗氧化剂，减少R0S产生抑制肿瘤的发展;结合并调节能够影响细胞生长和增殖相关酶(如MAPKs、MMPs等)、受体(如EGFR、IGF-1R、HGFR等)和信号分子 (如Bcl2和Vimentin)的活性。目前，EGCG的临床效果与抑制EBV裂解复制有关，其能够抑制肿瘤患者外周血中的EBV抗体滴度和DNA拷贝数。但是，EGCG抑制EBV裂解复制机制的研究还较少。
【发明内容】
[0007]我们通过前期实验发现LMP1不仅能够介导EBV相关肿瘤的发生发展，而且能够促进EBV的裂解复制。本发明对天然小分子化合物EGCG与EB病毒致瘤蛋白LMP1的相互作用进行了一系列研究，确定EBV LMP1可作为天然小分子化合物EGCG的分子靶标，S卩，天然小分子化合物EGCG可作为EBV LMP1蛋白的功能抑制剂，为EGCG介导的肿瘤化学预防和治疗效应提供新的证据。
[0008]为明确EGCG结合LMP1，本发明首先利用荧光光谱法分析了二者之间的相互作用性质。观察荧光光谱发现，随着LMP1蛋白溶液中EGCG浓度的提高，LMP1的内源荧光逐渐淬灭。 根据EGCG对LMP1内源荧光的淬灭机理，测得两者在不同温度下的结合常数均大于生物大分子荧光平均寿命，确定EGCG对LMP1的淬灭为静态过程，从而排除了二者的相互作用为动态碰撞。通过进一步分析，判断EGCG与LMP1的结合位点数约等于1。[00〇9] 本发明随后利用pul 1-down亲和层析实验验证EGCG与LMP1的结合作用。经Western blot实验检测，我们发现，1.EGCG能够捕获细胞蛋白裂解液中的LMP1; 2.EGCG可结合纯化的 LMP1蛋白。
[0010]为确定LMP1是EGCG的分子靶标，本发明借助等温滴定量热(iso thermal titrat1n calorimetry，ITC)技术明确EGCG结合LMP1的热力学特征。实验结果表明，EGCG 与LMP1的结合位点数为1.05，Kd值为0.36yM，确定LMP1为EGCG的高亲和蛋白。[〇〇11]最后，本发明利用细胞增殖能力检测实验验证EGCG靶向LMP1的抗肿瘤效应。结果显示，在EGCG生理浓度(lyM)作用下，LMP1阳性的鼻咽癌细胞系与阴性细胞系相比，增殖能力受到明显的抑制。[0〇12]已发现的EGCG靶标都是由人类细胞表达，大多数定位于细胞质膜，例如EGFR、Fas、 Vimentin、IGF-1 受体、Laminin、67kDa Laminin receptor、Fibronectin、Fibrinogen和 Histindine-rich glycoprotein。另外，还有少数的革E标蛋白定位于细胞质，包括GRP-78、 ZAP-70和Fyn。本申请发现的EGCG新靶标LMP1是致瘤病毒EBV编码的潜伏膜蛋白，其6个疏水的跨膜结构域锚定于宿主细胞质膜，该靶标是一个组成型活化的蛋白，持续性地活化相关的致瘤信号通路，促进肿瘤的发生发展。因此，天然小分子化合物EGCG是一种EBV LMP1蛋白的功能抑制剂，通过靶向LMP1对EBV阳性肿瘤的化学预防与治疗具有较好的发展前景。【附图说明】[〇〇13]图la显示了天然小分子化合物EGCG对EB病毒致瘤蛋白LMP1的荧光淬灭效应，图lb 和图lc显示了EGCG对LMP1荧光淬灭的Stern-Volmer曲线；图lc显示了EGCG对LMP1荧光淬灭的双对数图；[〇〇14]图2a显示了 EGCG与AGS-EBV(EB病毒阳性胃腺癌细胞系)和B95-8 (EB病毒阳性狨猴淋巴瘤细胞系)细胞裂解液中的LMP1的结合;图2b显示了EGCG与纯化的LMP1蛋白的结合；
[0015]图3显示了EGCG与LMP1结合的热力学特征及相关参数；[〇〇16]图4a和4b分别显示了 EGCG对鼻咽癌细胞系CNE1-LMP1以及胃腺癌细胞系AGS-EBV增殖能力的抑制效应。【具体实施方式】[0〇17]本发明所用细胞系B95-8(ATCC;CRL 1612)来自美国标准培养物收藏所(AmericanType Culture Collect1n,ATCC);胃腺癌细胞系AGS-EBV来自中国农业大学;CNE1和CNE1-LMP1由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所建系。[〇〇18]实施例1荧光光谱法检测EGCG与LMP1的相互作用。
[0019]蛋白质分子中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸而产生较强的内源性荧光。荧光猝灭剂与荧光物质相互作用而导致荧光强度下降的现象称为荧光猝灭作用。荧光猝灭作用因猝灭机制不同可分为动态荧光猝灭和静态荧光猝灭。以此原理为基础的荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。
[0020]实验方法如下:在25°C和37°C条件下，分别在比色杯加入一定摩尔浓度梯度(0? 75yM)的EGCG和纯化的LMP1蛋白溶液(加入的EGCG体积不超过溶液总体积的1.5%，此时体积影响较小，可以忽略体积效应，即纯化的LMP1蛋白溶液浓度保持不变)，定容后混匀;设置荧光光谱仪激发波长为以lx = 280nm，狭缝宽度5nm，在300?450nm范围内扫描LMP1的荧光光谱以及LMP1在EGCG作用下的荧光淬灭光谱，并记录实验数据。[〇〇21]通过处理数据，叠加荧光光谱，获得EGCG对LMP1的荧光淬灭光谱。结果如图la。根据荧光光谱峰值和对应的EGCG浓度，分别用Stern-Volmer方程和双对数方程等处理实验数据(结果见图lb和图lc，证实了在实验浓度和温度范围内，EGCG能够与LMP1形成复合物，弓丨起静态荧光猝灭；并得到了在25°C和37°C下结合反应的相关参数:25°C和37°C时LMP1对 EGCG的结合位点数分别为0.8551和0.9283，约等于1;对于n?1，即当荧光体与猝灭体之间形成不发焚光的1:1型复合物时，静态猝灭满足Lineweaver-Burk方程，求得结合常数Ka = 4.4X104(mol/L)_1〇
[0022]实施例2Pull-down亲和层析实验确定EGCG结合LMP1蛋白。[〇〇23] 操作步骤如下:
[0024]将制备好的总蛋白(含LMPl)500yg(或者纯化的LMP1蛋白单体)与50yl EGCG-Sepharose 4B(或者与50yl Sepharose 4B，作为阴性对照)置于反应Buffer(50mmol/L Tris(pH 7.5)，5mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，lmmol/L DTT，0.01%Ninidet P-40， 0.02mmol/L Phenylmethylsulfonyl fluoride ,4Ag/mL bovine serum albumin ,IX protease inhibitor cocktail)中，于4°C轻轻振摇、孵育过夜。次日，珠子以Washing Buffer([50mmol/L Tris(pH 7.5)，5mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，lmmol/L DTT,0.01% NP40,0? 02mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride])洗5次以去除未结合的蛋白。加入适量的SDS上样缓冲液，沸水浴5min，13000rpm离心5min，取上清上样，在不连续SDS变性凝胶中分离，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，然后膜与EB 病毒LMP1—抗4°C孵育12h，PBST洗涤;二抗室温孵育2h，PBST洗涤，加入化学发光底物，于凝胶及化学发光成像系统进行化学发光，拍照记录图像。结果见图2a和图2b。[〇〇25]实验结果显示，EGCG直接结合EB病毒阳性细胞系总蛋白裂解液中的LMP1，也可结合体外表达纯化的LMP1单体蛋白。
[0026]实施例3EGCG与LMP1结合的ITC曲线，以及由实测ITC曲线积分得到的结合反应热对EGCG与蛋白摩尔比的非线性拟合曲线。[〇〇27]等温滴定量热技术是一种原位、在线和无损伤地研究生物热力学与生物动力学的重要方法。它通过类似化学滴定的方法，记录反应热流随时间的变化，具有灵敏度高、重现性好和原位在线不干扰研究反应的特点，是目前最准确、应用最多的热力学方法之一。常应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-小分子相互作用以及酶促反应动力学等。[〇〇28] 操作步骤如下:[〇〇29]在25°C时，EGCG与LMP1相互作用的热力学性质的测定在美国TA公司生产的等温滴定微量热仪Nano ITC上进行。滴定实验中，将100yM EGCG溶液装入50yl的滴定注射器，4.5y M LMP1纯化蛋白溶液放入lml的样品池，搅拌器以300r/min的速度搅拌，每间隔200s加入 2.5yl EGCG溶液到LMP1溶液中，共滴定20次。参比池中加入去离子水作为样品池的热平衡参照。另做一空白实验以扣除EGCG稀释热的影响，即在样品池中加入缓冲液，用100yM EGCG 溶液滴定。LMP1的稀释热经测定非常小，可略去。所有的溶液都在25°C条件下真空脱气处理以减小信号噪音。积分每个峰面积并扣除稀释热后得到结合反应热，对EGCG与LMP1的摩尔比作图得到反应等温线。以TA公司提供的Nano Analyze数据分析软件对等温线中的独立结合位点模型进行非线性最小方差拟合，可计算出EGCG与LMP1相互作用的本征解离常数Kd、 本征摩尔结合焓A H、反应熵变A S和结合位点数n，结果见图3。
[0030]结果显示，EGCG与LMP1结合的Kd值为0.36yM，为高亲和性结合，结合位点数为1.05〇[〇〇31]实施例4LMP1的表达增强EGCG对肿瘤细胞增殖能力的抑制效应。[〇〇32]取生长状态良好的细胞，用含EDTA的胰酶于37°C消化，制成细胞悬液，以每孔2 X 1〇4个细胞接种到24孔板中，接种体积为500yl; 37 °C、5 % C02培养过夜，待细胞贴壁。在37 °C、 5%C02培养条件下，以DMS0(对照组)和EGCG的生理浓度(lyM)分别处理两种细胞系，每个浓度设置3个重复孔，培养5天。处理完毕后，用细胞计数仪计数。结果见图4a和4b。
[0033] 结果显示，与对照组相比，lyM的EGCG能够明显抑制CNE1-LMP1和AGS-EBV细胞的增殖，差异具有统计学意义(*代表P<〇.〇5，***代表P<0.001)。
【主权项】
1.一种EBV LMP1蛋白的功能抑制剂，其特征在于，所述功能抑制剂为天然小分子化合 物EGCG。2.天然小分子化合物EGCG在制备EBV LMP1蛋白功能抑制剂中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105997987SQ201610328003
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】曹亚, 李弘德, 罗湘建
【申请人】中南大学