包含聚合抑制剂的一组分纤维蛋白胶的制作方法
【专利摘要】本文提供了包含纤维蛋白单体和可逆纤维蛋白聚合阻断剂的稳定液体封闭剂制剂、制剂的制备和使用方法。
【专利说明】
包含聚合抑制剂的一组分纤维蛋白胶
[0001 ] 序列表
[0002] 本申请含有WASCII格式通过EFS-Web与本申请同时提交并且据此全文W引用方 式并入的序列表。2013年12月22日创建的所述ASCII副本命名为"序列表"并且大小为8千字 T。
技术领域
[0003] 本文提供一种单一组分液体封闭剂制剂、它的制备方法和它用于尤其是止血、封 闭、愈合和/或外科的使用方法。具体地，本文公开一种包含纤维蛋白原单体和GPRP肤的液 体封闭剂制剂。制剂表现出稳定性和延长的储存寿命并且在阻断、中和、稀释和/或除去肤 之后为可用的。
【背景技术】
[0004] 纤维蛋白封闭剂也称为纤维蛋白胶，已在临床中使用了数十年(参见例如，Tab有le 等人，J F*harm 曲armaceut Sci 2012,15 :124-140 ;Dickneite G等人，Thrombosis Res 2003,112:73-82)。通常，纤维蛋白封闭剂由两种液体组分组成，包含纤维蛋白原的组分和 包含凝血酶的组分，此类组分由于它们固有的不稳定性被冷冻储存。有时纤维蛋白封闭剂 产品由两种冷冻干燥的组分组成，所W需要就在使用之前重构W及通过连接的注射器或其 它双筒递送装置进行递送。冷冻干燥的制剂通常是稳定的，但是纤维蛋白原组分难W重构。 在将两种组分溶液混合之后，凝血酶裂解纤维蛋白原，因此使纤维蛋白原生成纤维蛋白聚 合物。
[0005] 纤维蛋白封闭剂凝块通过设及纤维蛋白原、凝血酶和因子XIII的酶促反应形成。 纤维蛋白原是血凝炔基质的前体蛋白质。它具有约340,000Da的分子量，并由通过二硫键连 接的3对不同多肤链Αα、邮和丫组成。纤维蛋白原具有Ξ结节结构:两个相同的D末端球状域 和一个中屯、Ε球状域，它们通过超螺旋的α螺旋连接。凝血酶通过酶促作用将纤维蛋白原转 化成纤维蛋白单体，速率由凝血酶的浓度决定。
[0006] 因子XIII为血液凝固系统的酶，通常存在于胶制剂中，当通过凝血酶活化并且存 在巧时使纤维蛋白凝块交联并稳定。此过程绕过了正常凝固的大多数步骤，并且模拟其最 终阶段。一些制造商将抗蛋白溶解剂添加到纤维蛋白胶制剂中（例如，如W093/05822中所 述)或特异性除去纤溶酶原W使纤维蛋白溶解停止或延迟(例如，如美国专利5,792,835和 7,125,569 中所述）。
[0007]
【背景技术】包括Laudano和Doolittle(PNAS 75(7) :3085-9)?及美国专利5,219， 328；5,318,524；8,367,802；5,750,657；6,262,236；6,268,483；6,500,427；5,723,579；5, 478,810;5,607,858;6,908,899和8,513,380。
【发明内容】
[0008] 纤维蛋白封闭剂在使用之前的制备是耗时的并且是繁琐的。市售的封闭剂由两种 组分组成，包含纤维蛋白原的组分和包含凝血酶的组分，此类组分通常呈干粉或独立的冷 冻液体的形式供应。用于重构粉末的过程由于纤维蛋白原组分的受限的溶解度而为耗时 的，并且常常需要加热。一旦重构或融化，就要将组分转移到两个独立的注射器中从而立即 使用。存在已知的单一组分封闭剂，此类封闭剂需要繁琐的处理和/或具有短的储存寿命。
[0009] 本文提供包含纤维蛋白单体和GPRP肤或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂的单一组 分稳定的封闭剂制剂、制造方法和使用方法，从而克服了已知封闭剂产品制剂、制造方法 和/或使用方法的缺点。
[0010] 可逆纤维蛋白聚合阻断剂可为大小小于约一（l)kD的试剂。在一些实施方案中，试 剂为小分子和/或分离的肤、它们的衍生物或盐，此类试剂能够可逆地结合纤维蛋白单体并 且防止或延迟纤维蛋白聚合。在一些实施方案中，可逆纤维蛋白聚合阻断剂包含小化学分 子或分离的肤。可逆纤维蛋白聚合阻断剂可为对纤维蛋白单体的亲和力低并且对纤维蛋白 聚合不具有永久性作用的结合试剂。因此，通常稀释和/或小分子交换将引发聚合。本文中 的阻断剂通过将抑降低至酸性抑不起作用。
[0011] 在一个方面，提供一种液体封闭剂制剂，其包含浓度为1%至13% (w/v)的纤维蛋 白单体;和GPRP肤和/或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂;其中阻断剂和/或GPRP肤W相对于 纤维蛋白单体摩尔过量超过约100或超过约340的量存在;并且其中液体制剂在选自由W下 项组成的组的环境溫度下稳定至少14天:约20°C、21°C、22°C、23°C、24°C和25°C。
[0012] 在一个实施方案中，液体制剂在选自由W下项组成的组的环境溫度下稳定多至90 天：约 20 °C、2 rC、22 °C、23 °C、24 °C 和 25 °C。
[0013] 在一个实施方案中，液体制剂在选自由W下项组成的组的环境溫度下稳定在14天 和多至90天的范围内的时间段:约20°(：、21°(：、22°(：、23°(：、24°(：和25°(：。
[0014] 在一个实施方案中，GPRP肤W相对于纤维蛋白单体摩尔过量约超过100至约460或 超过100至约340、或约340至约460倍的量存在。
[0015] 如本文所用的术语"纤维蛋白单体"包括纤维蛋白单体、二聚体和具有多个纤维蛋 白单元的低聚体，使得纤维蛋白在选自由W下项组成的组的环境溫度下在水性液体溶液中 呈可溶形式保持:约 20 °C、2 rC、22 °C、23 °C、24 °C 和 25 °C。
[0016] 在一个实施方案中，低聚体含有多至10个纤维蛋白单元。
[0017] 如本文所用的术语"纤维聚合物"包括多个具有多个纤维蛋白单元的纤维蛋白单 元，从而限制了纤维蛋白在选自由W下项组成的组的环境溫度下在水性液体溶液中的溶解 度:约 20 °C、2 rC、22 °C、23 °C、24 °C 和 25 °C。
[0018] 在一个实施方案中，聚合物含有超过10个纤维蛋白单元。
[0019] "环境溫度"为纤维蛋白制剂的周围环境的溫度。
[0020] 在一个实施方案中，制剂当在较低溫度例如2-8°C下保存或被冷冻时稳定较长时 间段。在融化之后，制剂可被转移到具有约20-25°C环境溫度的位置并在那个溫度下保持稳 定至少14天。制剂还可在除上文所具体描述的溫度之外的溫度下为稳定的。
[0021 ] 在各种实施方案中，纤维蛋白单体W1 %至4% (w/v)或3.5 %至13 % (w/v)的浓度 存在。
[0022] 在一些实施方案中，制剂还包含药学上可接受的载体。
[0023] 术语"药学上可接受的载体"是指适于人或其它动物使用的任何稀释剂或媒介物。
[0024] 在一些实施方案中，制剂基本上不含添加的凝血酶。"基本上不含"是指小于约一 (1) IU的凝血酶每毫升化/ml)的制剂。
[0025] 在一些实施方案中，GPRP肤包括包含Gly-Pro-Arg-Pro四肤氨基酸序列的肤、它们 的衍生物或盐。
[0026] 在一些实施方案中，GPRP肤为具有SEQ ID NO: 1中所列出的氨基酸序列的四肤或 它们的衍生物或盐。
[0027] 在一些实施方案中，GPRP肤为由SEQ ID NO: 1中所列出的氨基酸序列组成的四肤 或它们的衍生物或盐。
[0028] 在各种实施方案中，"GPRP肤"包括选自由具有选自W下的氨基酸序列的肤或它们 的衍生物或盐的肤：SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:42(沈Q ID N0:1;SEQ ID N0:2;SEQ ID NO: 3;沈Q ID N0:4;SEQ ID N0:5;SEQ ID N0:6;SEQ ID N0:7;SEQ ID N0:8;SEQ ID N0:9;SEQ ID N0:10;沈Q ID N0:11;沈Q ID N0:12;沈Q ID N0:13;沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:15;沈Q ID N0:16;沈Q ID N0:17;沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:19;沈Q ID N0:20;沈Q ID N0:21;沈Q ID N0:22;沈Q ID N0:23;沈Q ID N0:24;沈Q ID N0:25;沈Q ID N0:26;沈Q ID N0:27;沈Q ID N0:28;沈Q ID N0:29;沈Q ID N0:30;沈Q ID N0:31;沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:34;沈Q ID N0:35;沈Q ID N0:36;沈Q ID N0:37;沈Q ID N0:38;沈Q ID N0:39;沈Q ID NO:40;沈Q ID NO:41;和沈Q ID NO:42)。
[00巧]在各种实施方案中，GPRP肤选自具有选自SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:42的氨基酸 序列的肤或它们的衍生物或盐。
[0030] 在各种实施方案中，GPRP肤选自由由选自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:42的氨基酸 序列组成的肤或它们的衍生物或盐。
[0031] 在一些实施方案中，GPRP肤为GPRP肤酷胺。
[0032] 在一些实施方案中，制剂还包含凝血酶活化的因子XIII。制剂可还包括巧馨合剂。 巧馨合剂可为巧樣酸根离子、草酸根离子、邸TA、EGTA、或此类巧馨合剂的组合。在各种实施 方案中，巧馨合剂为例如巧樣酸钢所提供的巧樣酸根离子。巧樣酸钢可W约ImM至约50mM浓 度存在于制剂中。制剂可包括邸TA和/或EGTA，例如约0.1 mM至约2.5mM的邸TA和/或EGTA。
[0033] 在一些实施方案中，制剂具有中性抑，例如约6-8的抑或约6.5-7.5的抑或约6.7- 7.2的抑。
[0034] 在一些实施方案中，制剂含有缓冲液。通常，缓冲液为防止pH的极端偏移的成分。 在一个实施方案中，缓冲液选自由W下项组成的组:巧樣酸钢、草酸钢、乙酸钢、甘氨酸、精 氨酸、W及它们的组合。
[0035] 制剂可用于止血、愈合、封闭和/或外科，例如组织封闭、创伤愈合、硬脑膜愈合、缝 合线替换或吻合。
[0036] 在另一个方面，本文提供一种容纳如本文所公开的液体封闭剂制剂的容器。在一 些实施方案中，容器为安飯、小瓶或包含制剂的预填充的注射器。在一些实施方案中，制剂 或制剂的各个组分是冻干的。本文提供一种容纳冻干制剂的容器，冻干制剂在重构之后提 供如本文所公开的液体封闭剂制剂。
[0037] 在另一个方面，本文提供一种试剂盒，该试剂盒包括包含如本文所公开的液体封 闭剂制剂的容器和任选地小分子交换装置或G除去装置(W及任选地使用说明）。
[0038] 小分子交换装置可为含有用容许纤维蛋白聚合的小分子预平衡的树脂的任何模 块。制剂内的小分子被交换为所述容许聚合的小分子。
[0039] 通常，小分子交换为将至少一种小分子用至少另一种小分子置换。柱中的树脂用 一种或多种最终制剂中所需的小分子和/或容许纤维蛋白聚合的分子预平衡。树脂珠粒通 常为多孔的，孔在待置换的那些分子的分子量的范围内。
[0040] 在一个实施方案中，使包含纤维蛋白单体和GPRP肤的液体制剂通过装填有多孔树 脂的柱。制剂中的纤维蛋白单体将太大W至于不能进入树脂的孔并且将快速地通过柱。不 受机制的束缚，溶液中的小分子例如GPRP肤，将沿一条更曲折的路径行进，因为它们能够进 入并再离开树脂的孔，因此大大减缓了它们通过树脂的迁移速率。不受理论的束缚，那些使 树脂预平衡的小分子具有显著领先的优点，并由此与蛋白质(例如纤维蛋白单体)一起离开 树脂。因此，缓冲液、盐和其它小分子在运个步骤中得W交换。
[0041] 在一个实施方案中，在施用制剂之前和/或期间，将GPRP相对于纤维蛋白单体进行 稀释并且比率为等于或小于100,诸如比率为1-60,例如3、4、11、11.3、17、22.7、23、34、45、 56.7或57。
[0042] 在另一个实施方案中，试剂盒中的制剂或制剂的各个组分为冻干的。因此，试剂盒 包括了包含呈粉末或液体的纤维蛋白单体的容器、包含呈粉末或液体的GPRP肤的容器和任 选地包含重构液体的容器，重构液体诸如水、乙酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液或W中性pH的 精氨酸缓冲液或W中性pH的巧樣酸盐缓冲液。在一个实施方案中，干燥纤维蛋白单体和 GPRP肤粉末提供于相同的容器中。
[0043] 容器或试剂盒中的制剂可还包含药学上可接受的载体。
[0044] 在又一个方面，提供一种用于在表面处制备封闭剂的方法，该方法包括：
[0045] a)提供如本文所公开的液体封闭剂制剂；W及
[0046] b)在促进纤维蛋白在表面处聚合的条件下将制剂施用至表面。
[0047] 在一些实施方案中，表面为受治疗者的出血或未出血器官/组织。受治疗者包括哺 乳动物，包括人，并且可为人患者。在一些实施方案中，人患者为外科患者。
[0048] "表面"为人们期望形成封闭剂或胶的位置或方位。表面取决于封闭剂的使用。封 闭剂可用于例如止血、组织固定、移植物固定、创伤愈合和吻合。本文所公开的制剂、方法和 试剂盒可在内部或在外部用于组织和器官移植物固定、封闭外科创伤、包括提供止血的血 管外科和吻合，诸如动脉、胃肠和气管吻合。
[0049] 表面可W是可裸眼视力可见的皮肤的外表面W及为生物体内部解剖结构一部分 的体内部分的表面。外表面包括但不限于面部、咽喉、头皮、胸部、背部、耳朵、颈、手、肘、臀、 膝盖的皮肤W及其它皮肤部位。体内部分的示例包括但不限于暴露于外部环境和内部器官 的体腔或解剖学开口，诸如鼻孔;唇;生殖器区域，包括子宫、阴道和卵巢;肺;肛口；脾;肝； 和屯、肌。表面可为出血或未出血的部位。表面还可为工作表面。
[0050] 在一些实施方案中，条件包括除去、阻断、中和和/或稀释GPRP肤。GPRP肤可通过将 制剂直接施用到表面来除去或稀释。另选地，GPRP肤可通过使制剂通过小分子交换装置来 除去或稀释。另外，GPRP肤可通过使制剂在施用到表面之前或期间通过基于尺寸排阻和/或 亲合力的装置来除去或稀释。其它除去或稀释选项包括将GPRP-互补部分添加到装置。装置 中的互补部分可基本上为亲合力方法。
[0051 ]另选地或除此之外，制剂中的GPRP可通过添加肤例如GPRP肤的互补部分或能够置 换与纤维蛋白结合的GPRP的抗体来中和和/或阻断。
[0052] 在又一方面，提供一种在有需要的受治疗者中愈合、封闭和/或减少失血的方法， 该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的本文所公开的液体封闭剂制剂。制剂在促进纤维 蛋白聚合的条件下施用到受治疗者。在一些实施方案中，条件包括除去、阻断、中和和/或稀 释Grap肤。
[0053] 术语"治疗有效量"是指预防、改善和/或治疗疾病、病症或病状所需的剂量。有效 剂量可根据受治疗者的年龄和体重、疾病或病状和它的严重性W及本领域技术人员可认识 到的其它因素而变化。
[0054] 在另一个方面，提供一种如本文所公开的液体封闭剂制剂，其用于愈合、封闭、减 少失血和/或外科。
[0055] 在又一个方面，本文提供一种制造如本文所公开的液体封闭剂制剂的方法，该方 法包括：
[0056] a)提供包含纤维蛋白单体的组分；
[0057] b)提供GPRP肤或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂、它们的衍生物或盐；
[0058] C)渗和a)和b)W便获得液体封闭剂制剂，所述液体封闭剂制剂包含相对于纤维蛋 白单体摩尔过量超过100或超过至少340倍的量的GPRP和浓度为1 %至13% (w/v)的纤维蛋 白单体。
[0059] 在某一实施方案中，比率为相对于纤维蛋白单体摩尔过量约超过100至约460或超 过100至约340、或约340至约460倍。
[0060] 术语"渗和"意指W任何次序、任何组合和/或亚组合的形式混合组分。
[0061 ]另外提供一种可通过该方法获得的液体封闭剂制剂。
[0062] 纤维蛋白单体可通过在允许纤维蛋白原裂解成纤维蛋白的条件下使包含水性纤 维蛋白原的溶液与凝血酶接触来获得。在此类实施方案中，纤维蛋白单体的制备是在纤维 蛋白聚合受到抑制的条件下进行，例如在存在GPRP或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂时。在 一个实施方案中，纤维蛋白在抑制聚合(例如通过降低溫度）的条件下从纤维蛋白原获得， 并且稍后添加 GPRP肤。
[0063] 凝血酶可在溶液中是游离的或被固定在珠粒上。
[0064] 如果凝血酶被固定在珠粒上，例如W分批的形式或在柱中的珠粒，并且纤维蛋白 原组分穿过/接触珠粒，那么所得的制剂/组分可包含残余量的凝血酶。在一些实施方案中， 制剂基本上不含凝血酶，例如具有小于约一(1) lU/ml的凝血酶。
[0065] 在一些实施方案中，制剂/组分包括凝血酶活化的因子XIII。
[0066] 另选地，制剂中的纤维蛋白单体可通过在允许纤维蛋白原裂解成纤维蛋白的条件 下使包含水性纤维蛋白原的溶液与凝血酶样酶接触来获得。此类酶的示例为裂解纤维蛋白 肤A(巧A)的蛇毒酶，如己曲酶(Batroxobin)。在此类实施方案中，纤维蛋白单体的制备是在 纤维蛋白聚合受到抑制的条件下进行，例如在存在GPRP或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂 时。
[0067] 在一些实施方案中，纤维蛋白单体组分/制剂还包括巧馨合剂。
[0068] 在一些实施方案中，制造方法包括干燥步骤W提供干燥制剂。
[0069] GPRP肤和/或包含纤维蛋白单体的组分可呈粉末和/或液体形式。
[0070] 还提供一种使用本文所提供的方法所制造的封闭剂制剂。
[0071] 纤维蛋白原可由初始血液组合物制备。血液组合物可为全血或血液级分，即全血 制品，诸如血浆。纤维蛋白原可为自体的、人来源(包括汇集血浆)或非人来源。还可能的是， 纤维蛋白原通过重组方法来制备或可被化学改性。
[0072] 在本发明的一个实施方案中，纤维蛋白原溶液包含作为来源于血浆的蛋白质溶液 的生物活性组分(BAC)，纤维蛋白原溶液可还包含纤维蛋白溶解剂诸如氨甲环酸和/或稳定 剂，诸如精氨酸、赖氨酸、它们药学上可接受的盐、或它们的混合物。BAC可来源于冷析出物， 尤其是浓缩的冷析出物。
[0073] 术语"冷析出物"是指得自由全血制备的冷冻血浆的血液组分。当将冷冻血浆在寒 冷条件下(通常在〇-4°C的溫度下)解冻，导致形成含有纤维蛋白原和因子XIII的析出物时， 可获得冷析出物。析出物可例如通过离屯、来收集并溶解于合适的缓冲液中，诸如含有120mM 的氯化钢、ImM的氯化巧、lOmM的巧樣酸Ξ钢、120mM的甘氨酸、95mM的盐酸精氨酸的缓冲液。 BAC的溶液可包含附加因子，诸如像因子VIII、纤粘蛋白、血管性血友病因子(vWF)、玻连蛋 白等，例如US 6，121，232和W09833533中所述。BAC的组合物可包含稳定剂，诸如氨甲环酸和 盐酸精氨酸。BAC的溶液中氨甲环酸的量可为约80mg/ml至约11 Omg/ml。
[0074] 在另一个实施方案中，例如扣g/ml或更低的纤溶酶原，例如使用如US 7,125,569、 EP 1，390,485和W002095019中所述的方法，将BAC组合物中纤溶酶原和纤溶酶的浓度降低 至等于或低于15μg/ml。在另一个实施方案中，当将BAC组合物中纤溶酶原和纤溶酶的浓度 降低时，组合物不含有氨甲环酸或抑肤酶。
[00巧]纤维蛋白原溶液可为含有BAC2组分（来自EVICEL?)或任何其它纤维蛋白原的 溶液，诸如经纯化的重组纤维蛋白原或从人血浆产生的冷析出物。
[0076] 在另一个实施方案中，制剂为充分溶解的溶液，例如溶质和溶剂成分仅构成一个 相例如液相的溶液。
[0077] 在参阅W下详细的【具体实施方式】和附图后，本发明的运些和其它方面和实施方案 将变得显而易见。
【附图说明】
[0078] 图1为示出在固定的纤维蛋白浓度下GPRP肤浓度对纤维蛋白聚合时间的影响的 图。
[0079] 图2A示出包含GPRP肤和纤维蛋白的液体制剂。
[0080] 图2B示出在除去GPRP肤之后发生纤维蛋白聚合。在该实施方案中，GPRP通过使制 剂经受小分子交换装置来除去。
【具体实施方式】
[0081] 本公开部分基于在一定浓度下包括纤维蛋白单体和GPRP肤的稳定封闭剂制剂的 发现。
[0082] 本文提供W某一摩尔比包含纤维蛋白单体和GPRP肤的液体封闭剂制剂，从而克服 了当前可用的封闭剂制剂的不足。本文另外提供封闭剂的制造方法和使用方法。
[0083] 本文提供一种液体封闭剂制剂，其包含a)纤维蛋白单体;和b)GPRP肤或其它可逆 纤维蛋白聚合阻断剂。纤维蛋白单体W约1%至约13% (重量每体积(w/v))的浓度存在。在 一个实施方案中，GPRP肤具有氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Pro(GPRP; SEQ ID NO: 1)、它们的衍 生物或盐，并且W相对于纤维蛋白单体摩尔过量超过100倍、相对于纤维蛋白单体摩尔过量 超过或等于约340倍或摩尔过量约340至约460倍的量存在。
[0084] 在另一个实施方案中，GPRP肤包含氨基酸序列G1厂Pr〇-Arg-Pro(SEQ ID N0:1)或 Gly-Pro-Arg-VaK沈Q ID N0:23)。
[00化]在各种实施方案中，GPRP肤选自具有选自SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:42的氨基酸序 列的肤。
[0086] 稳定性可通过在制剂中观察到最小限度的或不存在自发聚合或凝结来确定，例如 制剂在存在GPRP肤多至14天时不示出或具有自发聚合或凝结，并且在除去、稀释、阻断和/ 或中和GPRP至等于或小于100的摩尔过量时保持它的凝结活性水平。制剂的凝结活性水平 或形成封闭剂的能力可使用本领域中已知的凝结技术体外和/或体内确定。稳定性还可通 过在即可上架(shelf-ready)的液体制剂中测量并观察到存在最小限度的或不存在纤维蛋 白聚合物或凝块来确定。
[0087] 在使用时，GPRP作用可例如通过根据预期用途稀释至一定浓度来减小。对于止血， 将为有利的是获得小于一分钟的凝结时间。在一个实施方案中，制剂中的GPRP浓度被稀释 至等于或小于100倍的摩尔过量或等于或小于34倍的摩尔过量。
[0088] 对于移植物固定，将为有利的是获得大约15分钟的凝结时间。在一个实施方案中， 制剂中的GPRP浓度被稀释至等于或小于100倍的摩尔过量或等于或小于56倍的摩尔过量。
[0089] 术语"稳定的"和"稳定性"当指代液体封闭剂制剂时意指在被施用到表面之前制 剂中不存在纤维蛋白聚合/纤维蛋白凝块。本文所公开的制剂在如上文所定义的环境溫度 下稳定至少14(十四）天。
[0090] 纤维蛋白聚合或凝结可例如通过在倾斜表面上测量迁移长度(或下落试验模型） 或通过本领域中已知的任何其它方法来测量。充分聚合可通过液体制剂例如在倒置时的流 动停止来评价。迅速聚合可使用Stat4凝结分析仪Stago Diagnostics或类似的测凝计测 量。
[0091] 对于在2-8 °C下长期储存例如一年或更长时间，包含纤维蛋白单体和GPRP肤的制 剂可被等分到无菌小瓶、安飯或其它容器中，然后将运些容器封闭。在一个实施方案中，使 用允许利用注射器穿过封闭件移除制剂的封闭件。可根据药学或医疗装置领域的标准操作 标记容器。
[0092] 在使用时，液体封闭剂制剂可从容器中被直接施用，可穿过小分子交换装置，或通 过GPRP除去装置(例如具有GPRP-互补部分的亲和力装置）；虽然使用方法将由使用者(例如 医疗工作者诸如医师、护±、医生）决定，即根据各个患者的需要并且基于出血或病状的严 重性。
[0093] 除非上下文中明确地指出，否则本文所用的不定冠词"一个(a)"和"一个(an)"意 为"至少一个"或"一个或多个"。
[0094] 如本文所用，术语"包含"、"包括"、"具有"、W及它们的语法变体应被视为指定所 述特征、步骤或组分，但不排除添加一种或多种另外特征、步骤、组分或它们的组。
[0095] 当数值前面为术语"约"时，术语"约"旨在指示+/-10%。
[0096] 如本文所用，术语"肤"广泛地用于指约4至约50个连续氨基酸的分离化合物或氨 基酸类似物。在肤的定义内包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如合成氨基酸、 类肤等）的肤，具有取代的键合、肤盐W及本领域中已知的其它修饰的肤，运两种肤为天然 存在的或非天然存在的(例如，合成的）。因此，合成肤、环化肤、支链肤等都包括在定义内。
[0097] 术语"肤"还包括本发明氨基酸序列的具有一个或多个取代、添加和/或缺失的衍 生物，包括一种或多种非天然存在的氨基酸。优选地，衍生物表现出与参考序列至少约50% 同一性，优选地至少约70%同一性，更优选地与本文所述的参考序列至少约75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性。肤衍 生物可包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(一般来讲在性质上是保守的），只要 肤保持所需的活性即可，例如可逆地抑制纤维蛋白聚合。
[0098] 运些修饰可为故意的，如通过定点突变诱发，或可为偶然的，诸如通过产生蛋白质 的宿主的合成或突变或归因于PCR扩增的错误。本文另外涵盖的是肤的药学上可接受的盐 和此类盐的衍生物。
[0099] 可逆抑制剂设及对纤维蛋白单体的亲和力低并且对纤维蛋白聚合或纤维蛋白凝 块不具有永久性作用的抑制剂(例如GPRP肤）。因此，通常稀释、除去和/或小分子交换将除 去抑制作用。
[0100] 术语"可逆聚合抑制剂"可在本文与术语"可逆纤维蛋白聚合阻断剂"互换使用。
[0101] "GPRP肤"意指SEQ ID N0:1中所列出的四个或更多个连续氨基酸序列的肤，明确 地说，序列Gly-Pro-Arg-Pro eGPRP肤可包含四聚体(GPRP，SEQ ID NO: 1)、它们的衍生物或 类似物。GPRP肤可为长度为4至12个氨基酸的残基或长度为4至8，优选地4、5、6、7或8个氨基 酸。
[0102] 不受理论束缚，GPRP肤能够与纤维蛋白单体结合，从而阻断了纤维蛋白单体的缔 合和聚合。GPRP肤可包括例如W引用方式并入的美国专利5，478，810和5，607，858中所公开 的GPRP肤酷胺(酷胺在C末端），具有式GPRP-X-N(RiR2 )，其中G为氨基酸甘氨酸，P为氨基酸心 脯氨酸，R为氨基酸心精氨酸，X为除脯氨酸之外的生蛋白氨基酸或为包括脯氨酸的二肤，N 为氮并且化和化相同或不同或为氨或具有至多4个碳原子的低级烷基链。其它GPRP肤包括美 国专利8,513,380中所公开的称为"纤维蛋白钮肤(fibrin knob peptide)"的肤，诸如具有 氨基酸序列GPRP(SEQ ID N0:1)、GPRV(沈Q ID N0:2)或GHRP(SEQ ID N0:3)的肤。GPRP肤可 具有氨基酸序列GPRPX(SEQ ID N0:32)、GPRVX(SEQ ID N0:33)、GPRPXX(SEQ ID N0:34)、 GPRVXX(SEQ ID N0:35)、GPRPXXX(沈Q ID N0:36)、GPRVXXX(SEQ ID N0:37)、GPRPXXXX(SEQ ID N0:38)或GPRVXXXX(SEQ ID N0:39)或GPRXXX(SEQ ID N0:40)，其中X为任何氨基酸。
[0103] 肤还可具有C末端氨基酸，诸如像半脫氨酸或赖氨酸，此类氨基酸允许与其它试剂 进行后续的化学反应W产生C末端缀合物。因此，在一些实施方案中，肤的C末端氨基酸为半 脫氨酸。因此，在一些实施方案中，肤的C末端氨基酸为赖氨酸。例如，GPRP可具有氨基酸序 列GPRPAAC(SEQ ID N0:25)、GPRPFPAC(SEQ ID N0:26)、GPRPPERC(SEQ ID N0:27)、
[0104] SEQ ID NOS: 1-42中所列出的任何肤序列可为肤酷胺，例如上文所参考的专利中 所公开的。
[0105]氨基酸和肤序列的常用缩写如下在表A中所示。
[0酒]表A:常见氨基酸的缩写、系统命名和化学式
[0107]
[0109]在一个实施方案中，使用氨基酸类似物序列，由此分离肤中的至少一个氨基酸被 类似物或生物类似氨基酸取代(保守取代），如本领域中已知的。氨基酸可W是L形式、D形式 或它们的衍生物(如，伪氨基酸、官能化的氨基酸(例如氣化的氨基酸……等）、β氨基酸、丫 氨基酸……等）。
[0110] 本领域的技术人员将认识到，本文所公开的肤可合成为肤的衍生物，包括"模拟 肤"。模拟肤或"拟肤"为在性质上不完全是肤，但是模拟在结构上所基于的肤的生物活性的 分子。此类拟肤包括含有非天然存在的氨基酸的肤样分子。拟肤可包括一种或多种氨基酸 类似物或可为肤样分子，含有例如酷胺键电子等排体诸如逆向-反转修饰;还原酷胺键;亚 甲基硫酸或亚甲基亚讽键;亚甲基酸键;次乙基键;硫代酷胺键;反式締控或氣締控键；1，5- 而取代四挫环;酷亚胺键;酬亚甲基或氣代酬亚甲基键或另一酷胺电子等排体。术语还包括 包含一种或多种Ν取代的甘氨酸残基Γ类肤"）和其它合成氨基酸或肤的分子。（对于肤的描 述参见例如，美国专利5,831,005; 5,877,278;和5,977,301;Nguyen等人（2000)Chem Biol.7(7) :463-473;和Simon等人（1992)Proc.化tl.Acad.Sci.USA 89(20):9367-9371)。 本领域的技术人员理解，运些和其它拟肤都涵盖在如本文所用的术语"拟肤"的含义内。
[0111] 肤的氨基酸序列根据常规表示法书写，其中N末端的氨基基团(N此）出现在序列的 左边，并且C末端的簇基基团（C00H)出现在序列的右边。
[0112] 本文所公开的肤可通过常规的盐形成反应形成生理上可接受的盐。此类盐可包括 与无机酸诸如盐酸、硫酸和憐酸的盐;与有机酸诸如乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、草酸、苹 果酸、巧樣酸、油酸和栋桐酸的盐;与碱金属和碱±金属诸如钢、钟、巧和侣的氨氧化物和碳 酸盐的盐;和与胺诸如Ξ乙胺、节胺、二乙醇胺、叔下胺、二环己胺和精氨酸的盐。
[0113] 链间和链内二硫键可形成，并且由此类二硫键的形成所得到的肤形式都由本发明 所涵盖。
[0114] 在一个实施方案中，本文所公开的肤为化学合成的。在其它实施方案中，本文所公 开的肤通过原核或真核宿主细胞中重组DNA的表达来体内或体外产生。
[0115] 在一些实施方案中，GPRP肤可逆地结合纤维蛋白和纤维蛋白原链的C末端区域。应 当理解，优先的相互作用不必需要在特定氨基酸残基和/或各肤的基序之间的相互作用。
[0116] 术语"基本上不含凝血酶"或"不含凝血酶的"设及组分或制剂具有不超过约1( 一） 个单位的凝血酶每毫升(ml)制剂。
[0117] 术语"有效量"是指本文所公开的组分或制剂形成封闭剂例如W覆盖受伤表面、减 少出血、增加愈合、改善不期望的病状等所需的量。
[0118] "药学上可接受的"或"药理学上可接受的"载体、溶剂、稀释剂、赋形剂和媒介物一 般是指不与本文所公开的组分的活性成分反应的惰性、无毒的固体或液体填充剂、稀释剂 或包封材料。可接受的赋形剂包括但不限于盐水；乙酸或乙酸盐;和氯化钢离子;甘露糖醇； 白蛋白；或它们的组合。
[0119] 本文所公开的肤根据本领域中已知的方法合成，包括但不限于合成（例如从各个 氨基酸化学合成肤)和重组方法(例如合成编码肤的DNA并且使用该DNA产生重组肤）。
[0120] 肤的化学合成：本文所公开的肤和编码肤的DNA可通过本领域中已知的方法化学 合成。用于合成肤的合适方法由Stua;rt和Young( 1984)，"Solid化ase Peptide Synthesis ," Sol id Phase Peptide Synthesis ^Methods Enzymol.，第二片反，Pierce Qiemical Company，289，Academic Press，Inc.，NY( 1997)描述。例如，可使用固相合成方法 或液相合成方法。固相合成通常通过用适当的保护基保护氨基基团来进行。例如，可使用 Boc(叔下氧基幾基)或Fmoc(9-巧基甲氧基幾基)或它们的组合。在一个实施例中，本文所公 开的肤通过W下步骤合成：1)将对应于待产生的肤的C末端的氨基酸残基通过氨基酸的a- C00H基团与不溶于反应溶剂的固相材料结合，或此类固相材料为购买的；2)在朝向肤的N末 端的方向上，在保护了除a-COOH基团之外的其它官能团诸如对应氨基酸或肤片段的a-氨基 基团之后，将对应的氨基酸或肤片段通过缩合与步骤1)的氨基酸结合;3)将形成肤键的氨 基基团的保护基诸如a-氨基基团从键合的氨基酸或肤片段除去;4)重复步骤2)和3) W伸长 肤链W形成对应于所期望的肤的肤链;5)使所产生的肤链从固相材料脱离并将保护基从所 保护的官能团除去；W及6)将肤纯化，从而获得所期望的肤。
[0121 ]固相材料W及溶剂和缩合剂均为本领域中熟知的。
[0122] DNA的化学合成和表达:编码本文所公开的肤的DNA当在广泛多种克隆和表达载体 中插入到广泛多种宿主细胞中之后可被复制并用于表达重组肤。宿主可为原核的或真核 的。DNA可为化学合成的。用于合成DNA和克隆载体(例如用于哺乳动物、昆虫、织物细胞、细 菌、隧菌体和酵母)的合适方法为可用的。可W融合蛋白的形式表达的重组肤通过本领域中 已知的方法进行纯化。
[0123] 虽然下列实施例说明了本发明的某些实施方案，但它们不应被理解为限制本发明 的范围，而应理解为有助于完善本发明的描述。
[0124] 实施例
[01巧]实施例1: GPRP肤浓度对纤维蛋白聚合时间的影响。
[0126] 为了评估肤的存在和它的浓度对纤维蛋白单体聚合速率的影响，培养GPRP肤:纤 维蛋白单体的混合物并且测量凝块形成的时间。
[0127] 如下制备GPRP肤:纤维蛋白单体的混合物：
[0128] 将GPRP肤(Gly-Pro-Arg-Pro;由Sigma定制；肤呈冻干形式供应（250mg)并且溶解 于lOOmM的二水合巧樣酸^钢中；pH = 7产生1M的GPRP)添加到纤维蛋白原溶液（如 EViaEL?纤维蛋白封闭剂中的BAC2溶液）中。溶液中肤最终浓度在W下表1中列出。所使 用的纤维蛋白原最终浓度为1 %、1.5%、3%、3.5%。将含有7 %可凝结纤维蛋白原的BAC2溶 液[EVICEL?的纤维蛋白原组分]溶解于2〇mM pH 7.0的乙酸钢(化Acetate)缓冲液中W 获得最终所列出的浓度。
[0129] 为了形成纤维蛋白，将凝血酶（巧IEVICEL/纤维蛋白封闭剂中）在lOIU/ml或 lOOIU/ml的最终浓度下添加到纤维蛋白原溶液中，然后记录凝结时间。通过评价当将管倒 置时的流动估计凝结。
[0130] 表1提供每个纤维蛋白和肤最终浓度的凝结时间的概要。
[0131 ]将纤维蛋白单体浓度估计为等于纤维蛋白原浓度。
[0。。表1:凝结时间随纤维蛋白和肤浓度的变化。
[0133]
[0134] 短期实验的结果：
[0135] -般来讲，当GPRP肤的浓度降低时，纤维蛋白单体W较快速率自发聚合。例如，在 1%的纤维蛋白和O.lmM的GPRP(约3.4:1摩尔比的6口1沁:纤维蛋白）下，纤维蛋白凝块即刻形 成，在1%的纤维蛋白和ImM的GPRP(约34:1摩尔比）下，凝块在小于5分钟内形成。在1%的纤 维蛋白和5mM的GPRP(约170:1)下，溶液呈液体形式稳定4小时，并且在1 %的纤维蛋白和 lOmM的GPRP(约340:1)下，溶液呈液体形式稳定大约7-8天，但之后不聚合W形成固体。
[0136] 长期实验的结果：
[0137] 在1.5 %的纤维蛋白浓度和20mM的GPRP(约453 :1)下，或在3.5 %的纤维蛋白和 40mM的GPRP(约389:1)下，溶液是稳定的但即使在室溫下2周之后仍不形成凝块。
[0138] 运些实验示出，340:1的摩尔比（GPRP:纤维蛋白）有利地导致液体溶液稳定约7-8 天。
[0139] 利用所使用的两种凝血酶浓度观察到了类似的结果。
[0140] 不受理论的束缚，此结果指出大部分或所有纤维蛋白原由凝血酶裂解，并且凝结 时间的差异与GPRP相对于纤维蛋白的浓度有关。
[0141] 聚合时间和GPRP:纤维蛋白摩尔比之间的关系还示出于图1中。
[0142] 在此实验中，使用固定的（3%)纤维蛋白浓度和递增量的GPRP(0.1mM、0.2mM、 0.5111]\1、1111]\1、1.5111]\1、21111、3111]\1、4111]\1和51111)来延迟聚合。所有运些（具有至多57:1的比率)都低 于纤维蛋白单体的长期稳定所需的最小比率。如上文(通过将GPRP肤添加到纤维蛋白原溶 液中并且将凝血酶添加到GPRP:纤维蛋白原混合物中）制备GPRP:纤维蛋白溶液。接着，如上 记录凝结时间。
[0143] 图1示出在纤维蛋白聚合速率和GPRP肤与纤维蛋白的摩尔比之间存在对数相关 性。
[0144] 运指出，纤维蛋白凝块形成速率可通过调整GPRP肤在溶液内的浓度来控制，W及 将GPRP肤稀释至甚至很少量都将影响纤维蛋白聚合速率。
[0145] 此外，在一些实施方案中，所定义的相关性允许通过控制施用之后(例如通过小分 子交换装置)最终GPRP肤浓度来控制聚合速率。
[01W 实施例2:使用小分子交换装置从包含纤维蛋白和GPRP的溶液的纤维蛋白凝块形 成。
[0147] W下实施例旨在示出，引发和/或加速纤维蛋白凝块形成可通过使用小分子交换 装置稀释或除去溶液中的GPRP肤来实现。
[0148] 如上所述(通过将GPRP肤添加到3.8%的纤维蛋白原溶液中并且添加凝血酶W将 纤维蛋白原裂解成纤维蛋白）制备含有浓度为大约3.8%的纤维蛋白、浓度为41mM的GPRP肤 的GPRP肤的混合物(摩尔比为约366:1)。发现此摩尔比足W维持制剂稳定。
[0149] 根据与装置一起提供的标准旋转协议使用小分子交换装置(GE PD-10旋转柱;产 品代码：17-0851-01，GE Healthcare) W除去/稀释GPRP:纤维蛋白单体制剂中的GPRP肤。将 交换装置用包括20mM的乙酸钢pH 7.0; 25mM的氯化巧的缓冲液预平衡。使2.5ml的溶液经受 缓冲液交换程序，并且通过将含有缓冲液交换的混合物的管倒置来评价纤维蛋白凝块形 成。
[0150] 小分子交换的制剂快速凝结（图2B)，然而未经受缓冲液交换程序的溶液保持液体 形式（图2A)。
[0151] 虽然本文已描述了各种实施方案，但是可W对那些实施方案实施多种修改和变 型。另外，凡是公开了用于某些组分的材料的，均可使用其它材料。上述【具体实施方式】和下 述权利要求旨在涵盖所有运样的修改和变型。
[0152] W引用方式全文或部分地并入本文的任何专利、公布或其它公开材料均仅在所并 入的材料不与本公开所述的现有定义、陈述或其它公开材料相冲突的范围内并入本文。因 此，并且在必要的程度下，本文明确阐述的公开内容取代W引用方式并入本文的任何冲突 材料。
[0153] 本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认此类参考文献可用作本 发明的现有技术。
[0154] 节段标题在本文用于易于理解说明书并且不应理解为必要限制性的。
【主权项】
1. 一种液体封闭剂制剂，所述液体封闭剂制剂包含浓度为1%至13%(w/v)的纤维蛋白单 体和GPRP肽或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂;其中所述阻断剂或GPRP以相对于所述纤维蛋 白单体摩尔过量超过100倍的量存在于所述制剂中；并且其中所述液体制剂在选自由以下 项组成的组的环境温度下稳定至少14天:约20°C、21°C、22°C、23°C、24°C和25°C。2. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述GPRP肽以相对于所述纤维蛋白单体摩尔过量 超过约340倍的量存在。3. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述GPRP肽以相对于所述纤维蛋白单体摩尔过量 约340至460倍的量存在。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的制剂，其中所述制剂基本上不含添加的凝血酶。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的制剂，所述制剂还包含凝血酶活化的因子XIII。6. 根据权利要求1至4中任一项所述的制剂，所述制剂还包含钙螯合剂。7. 根据权利要求6所述的制剂，其中所述钙螯合剂为柠檬酸根离子。8. 根据权利要求7所述的制剂，其中所述柠檬酸根离子由柠檬酸钠提供。9. 根据权利要求8所述的制剂，所述制剂包含约ImM至约50mM的柠檬酸钠。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的制剂，其中所述制剂具有中性pH。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的制剂，所述制剂用于止血、封闭、愈合和/或外 科。12. -种容器，所述容器包含权利要求1至10中任一项所述的制剂。13. -种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求12所述的容器和任选地使用说明。14. 一种用于在表面制备封闭剂的方法，所述方法包括:提供权利要求1至10中任一项 所述的制剂；以及在促进纤维蛋白在所述表面聚合的条件下将所述制剂施用到所述表面。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述条件包括除去、阻断、中和和/或稀释所述 GPRP 肽。16. -种制造液体封闭剂制剂的方法，所述液体封闭剂制剂包含浓度为1 %至13%( w/v ) 的纤维蛋白单体和GPRP肽或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂;其中所述阻断剂以相对于所述 纤维蛋白单体摩尔过量超过约100倍的量存在于所述制剂中；并且其中所述液体制剂在选 自由以下项组成的组的环境温度下稳定至少14天:约20°C、21°C、22°C、23°C、24°C^P25°C， 所述方法包括以下步骤： a) 提供包含纤维蛋白单体的组分； b) 提供GPRP肽或其它可逆纤维蛋白聚合阻断剂、它们的衍生物或盐；以及 c) 掺和a)和b)以便获得所述液体封闭剂制剂。17. 根据权利要求16所述的方法，其中所提供的纤维蛋白单体通过在允许纤维蛋白原 裂解的条件下使水性纤维蛋白原溶液与凝血酶或凝血酶样酶接触来获得。18. 根据权利要求16或17所述的方法，其中所述纤维蛋白单体组分包含凝血酶活化的 因子XIII。19. 根据权利要求16或17所述的方法，其中所述纤维蛋白单体组分包含钙螯合剂。20. -种制剂，所述制剂能够根据权利要求16至19中任一项所述的方法获得。21. -种在有需要的受治疗者中愈合、封闭和/或减少失血的方法，所述方法包括向所 述受治疗者施用有效量的根据权利要求1至10或权利要求20中任一项所述的制剂。22. -种液体封闭剂制剂，所述液体封闭剂制剂包含浓度为1%至13%(w/v )的纤维蛋白 单体和GPRP肽;其中GPRP以相对于所述纤维蛋白单体摩尔过量超过340倍的量存在于所述 制剂中；并且其中所述液体制剂在选自由以下项组成的组的环境温度下稳定至少14天:约 20。(：、21。(：、22。(：、23。(：、24。(：和25。(：。
【文档编号】A61L24/10GK105899242SQ201480071021
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月4日
【发明人】Y.皮尔佩, A.迪安格里斯, Y.泽德夫, S.多龙, I.努尔
【申请人】奥姆里克斯生物药品有限公司, 伊西康公司