丙型肝炎病毒ns5b rna聚合酶抑制多肽序列及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抑制病毒药物开发领域，主要用于对HCV NS5B聚合酶的检测和生物活 性的抑制以及对HCV的治疗等方面。
【背景技术】
[0002] 当前无论是国内还是国外，丙型肝炎病毒（HCV)的感染率持续增多；据统计，全世 界范围内有超过3%的人员感染HCV，而在我国这一比例已达到3. 2%，远高于世界平均水平。 多数HCV感染者终身携带病毒，其中一半以上的患者最终会发展成为慢性肝炎，甚至进一 步发展为肝硬化；这其中约有2%的肝硬化患者会发展成为原发性肝癌。因此，HCV已成为 威胁公共安全的重大疾病。
[0003] 由于目前没有针对HCV的疫苗和特效药物，临床上多采用干扰素和利巴韦林联合 用药的方式来进行抗病毒治疗。但这一联合治疗方案并不完美，其治疗总有效率大概在 50%左右，而且治疗的时间漫长、费用昂贵，一部分患者还会因不能耐受其严重的副作用（如 类流感样症状、骨髓抑制、甲状腺功能亢进等）而中断治疗。目前针对HCV治疗的新型药物 研究多集中于HCV感染过程中的特异位点开展，主要包括内源性核糖体进入位点（IRES)、 NS3/4A丝氨酸蛋白酶和NS5B RNA聚合酶等。其中针对HCV NS5B RNA聚合酶的抑制剂药物 索非布韦（Sofosbuvir，S0F)已于2013年底通过美国FDA批准上市，这种药物仍需与利巴 韦林联用，这也是全球首个不需使用干扰素的口服治疗药物。但是，目前的化学合成的抗病 毒药物均存在不同程度的副反应，包括已上市的SOF仍然存在疲乏、头痛、恶心及失眠等一 系列副反应，这在一定程度上限制了它的应用范围。
[0004] 随着科学研究的不断开展，人们对蛋白质结构和药物分子的认识也越来越深入。 分子对接技术是研究小分子化合物与蛋白质相互作用的重要技术手段。目前在药物研发领 域，由于小分子药物的结构特征非常清晰，结合高性能计算机辅助设计的分子对接技术来 研究药物与靶标分子结合机理的应用已非常普遍。而相对于药物小分子来说，多肽的结构 比较复杂；更为关键的是随着多肽长度的增加，其空间结构也变得更加难以预测，因此借助 分子对接技术对多肽与靶标分子进行准确的预测就变得异常困难。
[0005] HCV非结构蛋白NS5B是一个相对分子量为68kDa的RNA依赖的RNA聚合酶 (RNA-cbpendent RNAPolymerase, RdRp)，和HCV RNA 的复制有关。在HCV复制过程中，NS5B RNA聚合酶起非常重要的催化作用，同时它还能调节解旋酶的活性。在不同基因型的HCV 中，NS5B RNA聚合酶均高度保守，其空间结构以一种类似右手的三维结构呈现；其中具有催 化活性的关键氨基酸位点包括ASP220、GLY317、ASP318、ASP319等区域。NS5B RNA聚合酶 是HCV复制过程中的关键酶，是从单链病毒RNA合成双链RNA所必须的。而且，目前的研究 尚未发现与NS5B RNA聚合酶功能相近的酶在哺乳动物类细胞中表达，使得针对NS5B RNA 聚合酶的抑制剂具有较高的专一性，这使得针对NS5B RNA聚合酶抑制剂的研究成为抗HCV 治疗药物研发的热点。
【发明内容】
[0006] 本发明设计了一系列不同长度的多肽组合库，利用分子对接软件，将多肽与HCV NS5B RNA聚合酶上特定的抑制性位点进行分子对接。本发明建立了鉴定表达HCV NS5B RNA 聚合酶活性的方法，通过筛选多肽与HCV NS5B RNA活性的抑制作用，进而筛选出具有抑制 HCV NS5B RNA聚合酶活性的多肽，为进一步研发抗HCV药物奠定基础。
[0007] 本发明的技术方案： 一种和丙型肝炎病毒NS5B RNA聚合酶活性位点特异结合的多肽，该序列核心为 IIe-Asn-Gln-Arg-Lys-Val-Trp〇
[0008] 所述的多肽在抗丙型肝炎的药物或制剂的应用。
[0009] 所述的多肽在制备检测HCV及其NS5B蛋白中的应用。
[0010] 所述的多肽在建立HCV NS5B的定性或定量检测试剂盒的应用。
[0011] 利用HCV NS5B RNA聚合酶活性评价体系进行多肽筛选的方法，包括以下步骤： (1) 取 100ug/ml 的 Poly(A)磁珠 5μ 1，加入 RNasin 0.5uL，同时加入 5μ 1 的 10XRNA Buffer、25mM的Mg2+离子4ul，加水补充至50 μ 1，于37°C条件下水浴30min ; (2) 将所有合成备筛选的多肽均溶解于0. 5%的DMSO中；取IOmM的合成多肽15 μ 1与 15μ I NS5B相应表达蛋白于37°C反应30min，然后取10μ 1用于下一步反应； (3) 加入 ImM 的 Bio-Il-UTP 0.5 μ IUOmM 的 rUTP 5 μ 1，于 37°C条件下水浴 30min; 阴性对照组仅加入IOmM的rUTP 5 μ 1，同时加入10 μ I NS5B相应的表达蛋白作为阳性对 昭. (4) 将反应后的溶液置于磁力架上，吸附5min，然后加入2XSSC溶液200μ1，清洗三 次； (5) 加入FAM标记的1000倍稀释的链霉亲和素100 μ 1，于37°C条件下水浴30min ; (6) 将反应后的溶液置于磁力架上吸附5min，然后加入2X SSC的溶液200 μ 1清洗三 次，加入50μ 1灭菌水，于Abs/Em=492/518nm条件下读值，以三次测定的平均值为最终结 果； (7) 以（多肽反应组的荧光计数值-阴性荧光值）/(阳性荧光值-阴性荧光计数值）的 比值高低，判定多肽对NS5B表达蛋白的酶活抑制性。
[0012] 本发明的积极有益效果： (1)本发明通过计算机辅助设计技术来进行定向结合多肽的虚拟筛选，使得对蛋白质 与小分子化合物的微观结合研究更加精细与深入。基于计算机模拟的药物筛选工作，不仅 大大减少筛选强度、降低筛选人工和缩短研发周期，还大大提高了筛选成功的机率。
[0013] (2)本发明设计的多肽能与表达蛋白结合，表达融合蛋白测定结果和虚拟对接结 果之间有相关性，因此合成本发明多肽序列可以快速建立HCV NS5B的定性或定量检测试剂 盒。
[0014] (3)利用HCV NS5B RNA聚合酶体外活性鉴定体系进行多肽抑制筛选的结果表明， 本发明的多肽对HCV NS5B蛋白的聚合酶活性均有显著抑制作用，其IC50可达9. 85 μ M，由 于HCV NS5B在病毒复制过程中起到非常重要的作用，通过抑制NS5B的功能，是当前抗HCV 药物的重点研发方向，因此本发明多肽序列具备抑制NS5B蛋白的聚合酶活性，说明其具备 开发抗HCV药物的前景。
[0015] (4)借助本发明的多肽HCV NS5B RNA聚合酶含量进行评价，可以替代抗体；由于 抗体的生产至少需要半年到一年时间，采用人工合成多肽的方法可以大大节省检测产品的 研发时间，而且成本也远远低于市场上的检测试剂盒产品。
【附图说明】
[0016] 图1本发明多肽的空间模型； 图2活性口袋与多肽间的静电相互作用分析； 图3 HCV NS5B活性口袋与多肽的疏水作用分析； 图4 HCV NS5B活性口袋与多肽的氢键区域分析； 图5对接结果中的氢键(虚线）； 图6不同多肽浓度与表达蛋白的结合结果； 图7不同浓度的多肽对NS5B的抑制率。
【具体实施方式】
[0017] 实例1:多肽与HCV NS5B RNA聚合酶的虚拟对接分析 多肽与蛋白之间的相互作用力主要包括有范德华力、疏水性作用、氢键结合作用力及 静电相互作用三种形式。因此为了解通过虚拟对接得到的结果，评价多肽与蛋白之间的相 互作用情况，我们选择虚拟筛选所得的对接效果最佳的多肽与目标蛋白为参照，其相互作 用力分析如下： 相对于分子间的化学键来说，范德华力比较弱，它只是分子间的吸引力，它与分子之间 的距离