Boc和Fmoc固相肽合成的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是发明人于2007年8月31日提交的题为"Boc和Fmoc固相肽合成"的中 国专利申请200780043049. 3的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种制备包含三个或更多个氨基酸残基的肽的方法，所述肽具有 N-端氨基酸、邻近该N-端氨基酸的倒数第二个氨基酸和C-端氨基酸。
【背景技术】
[0003] 为了克服与溶液肽合成有关的许多中间体提纯问题，于1963年引入固相肽合成。 Stewart 等人，固相肽合成（Solid Phase Peptide Synthesis)(百克化学公司（Pierce Chemical Co.)，第2版，1984)。在固相合成期间，氨基酸被组装（S卩，偶联）成任何想得到 的序列的肽，而链的一端（即，C-端）被锚定到不能溶解的载体上。一旦在载体上将想得 到的序列连接到一起，那么肽就被从载体中解封闭（deblock)(即，裂开（cleave))。偶联氨 基酸的α -氨基官能团的这两个标准保护基团为通过利用强酸处理而除去的Boc，以及利 用碱除去的Fmoc。本发明涉及一种利用这些α -氨基保护基团两者的组合，以单一合成，在 便宜的氯甲基化的聚苯乙烯树脂上制备肽的便利方法。
[0004] 在通过利用任一种上面提及的α -氨基保护方案的固相方法合成肽的设计中， 重要的是在整个链组装期间保护构成氨基酸的任何反应性"侧基"不发生不希望的化学反 应。还希望选择来保护各种侧基的化学基团可耐受被用来除去α-氨基保护基团的试剂除 去。第三，重要的是在链组装期间生长中的肽链与树脂颗粒的连接对于用来除去任一类型 α -氨基保护基团的试剂稳定。在Fmoc α -氨基保护方案的情况下，侧基保护官能团应当可 耐受用来除去Fmoc的碱性试剂。实际上，在肽链组装之后，这些侧链保护基团一般由温和 酸性试剂除去。当利用Boc α -氨基保护方案时，侧链保护基团必须在每一个循环中都可耐 受被用来脱保护Boc基团的温和酸试剂除去。实际上，在肽链组装之后，Boca -氨基保护方 案的这些侧链保护基团一般由无水HF除去。因此，实际上，就Fmoc α -氨基保护而言常用 的侧链保护基团在用于Boca -氨基脱保护的条件下不稳定，并且这两个类型的α -氨基保 护方案未在通过固相肽合成的肽链的组装中混合。另外，尽管就Boc保护的氨基酸而言广 泛地使用了用于肽合成的最不昂贵的聚合树脂，氯甲基化的苯乙烯或"Merrifield树脂"， 但是文献暗示就在α -氨基上的Fmoc保护而言由于其在碱性条件下的不稳定性而不适于 使用。（参见Stewart等人，固相肽合成（百克化学公司，第2版，1984)。本发明涉及在某 些肽的固相合成期间在"Merrifield树脂"上混合使用Boc和Fmoc氨基酸两者的方法。
[0005] Lanreotide?!(兰瑞肽）为生长抑素的类似物并且已知抑制生长激素释放以及抑 制胰岛素、胰高血糖素和胰腺外分泌。
[0006] 美国专利号4853371公开并要求保护Lanreotide?、其制备方法及抑制生长激 素、胰岛素、胰高血糖素的分泌和胰腺外分泌的方法。
[0007] 美国专利号5147856公开了 Lanreotide?治疗再狭窄的用途。
[0008] 美国专利号5411943公开了 Lanreotide?]用于治疗肝细胞瘤的用途。
[0009] 美国专利号5073541公开了 Lanreotide?用于治疗肺癌的用途。
[0010] 于1993年7月9日提交的美国申请号08/089410公开了 Lanreotide?用于治疗 黑色素瘤的用途。
[0011] 美国专利号5504069公开了 Lanreotide?用于抑制实体瘤加速生长的用途。
[0012] 于1997年5月13日提交的美国申请号08/854941公开了 Lanreotide?用于降低 体重的用途。
[0013] 于1997年5月13日提交的美国申请号08/854943公开了 Lanreotide?用于治疗 胰岛素抵抗和综合征X的用途。
[0014] 美国专利号5688418公开了 Lanreotide? j目于延长胰腺细胞生存的用途。
[0015] PCT申请号PCT/US97/14154公开丫 Lanreotide?丨用于治疗纤维化的用途。
[0016] 于1997年5月13日提交的美国申请号08/855311公开了 Lanreotide?用于治疗 高脂血症的用途。
[0017] 于1995年5月12日提交的美国申请号08/440061公开了 Lanreotide?用于治疗 血淀粉酶过多（hyperamylinemia)的用途。
[0018] 于1997年5月7日提交的美国申请号08/852221公开了 Lanreotide?用于治疗 高催乳素血症和催乳素瘤的用途。
[0019] 前面的专利和专利申请的内容并入本文中作为参考。
【发明内容】
[0020] 本发明特征在于一种用于制备包含三个或更多个氨基酸残基的肽的方法，该肽具 有N-端氨基酸、邻近该N-端氨基酸的倒数第二个氨基酸和C-端氨基酸，其中所述方法包 括如下步骤：
[0021] (a)通过酯键把第一氨基酸连到固体载体树脂上以形成第一级偶联产物，其包括 (i)使碳酸铯的水溶液与第一氨基酸的醇溶液反应，以形成第一氨基酸的铯盐，（ii)获得 第一氨基酸的无溶剂铯盐，（iii)在干的极性非质子溶剂中使固体载体树脂与第一氨基酸 的铯盐反应，以形成第一级偶联产物；
[0022] 其中第一氨基酸与肽的C-端氨基酸对应，第一氨基酸的非侧链氨基被Boc封闭 并且第一氨基酸没有需要保护的侧链官能团，以及固体载体树脂为氯甲基化的聚苯乙烯树 脂；
[0023] (b)利用酸从第一级偶联产物中解封闭Boc，以形成第一级解封闭的偶联产物；
[0024] (C)任选地把下一个氨基酸偶联到第一级解封闭的偶联产物上，其包括在包含肽 偶联试剂的有机溶剂中使下一个氨基酸与第一级解封闭的偶联产物反应，以形成下一级封 闭的偶联产物，其中下一个氨基酸具有被Boc封闭的非侧链氨基，并且如果下一个氨基酸 具有一个或更多个侧链官能团，那么侧链官能团不需要保护，或者侧链官能团具有对于分 别用来解封闭Boc和Fmoc的酸试剂和碱试剂稳定的保护基团；
[0025] (d)从下一级封闭的偶联产物中解封闭Boc，其包括使下一级封闭的偶联产物与 酸反应，以得到下一级解封闭的偶联产物；
[0026] (e)任选地重复步骤（c)和⑷，每个循环形成（X+1)级的下一级解封闭的偶联产 物，其中X为所需的循环重复次数；
[0027] (f)把下一个氨基酸偶联到得自（b)的第一级解封闭的偶联产物上，或者任选地 偶联到得自（e)的（X+1)级的下一级解封闭的偶联产物上，其包括在包含肽偶联试剂的有 机溶剂中使下一个氨基酸与所述第一级解封闭的偶联产物或所述（X+1)级的下一级解封 闭的偶联产物反应，以形成下一级封闭的偶联产物，其中下一个氨基酸具有被Fmoc封闭的 非侧链氨基，条件是如果下一个氨基酸具有一个或更多个侧链官能团，那么侧链官能团不 需要保护，或者侧链官能团具有对于用来解封闭Fmoc的碱试剂稳定的保护基团；
[0028] (g)从下一级封闭的偶联产物中解封闭Fmoc，其包括使下一级封闭的偶联产物与 伯胺或仲胺反应，以得到下一级解封闭的偶联产物；
[0029] (h)任选地重复步骤（f)和（g)，每个循环形成（X+1)级的下一级解封闭的偶联产 物，其中X为所需的循环重复次数，直到肽的倒数第二个氨基酸被偶联和解封闭；
[0030] (i)把N-端氨基酸偶联到（X+1)级的下一级解封闭的偶联产物上，其包括在包含 肽偶联试剂的有机溶剂中使N-端氨基酸与（X+1)级的下一级解封闭的偶联产物反应，以形 成完成的封闭的偶联产物，其中N-端氨基酸具有被Boc或Fmoc封闭的非侧链氨基；
[0031] (j)从完成的封闭的偶联产物中解封闭Boc或Fmoc基团，其包括在Boc的情况下 使完成的封闭的偶联产物与酸反应，或者在Fmoc的情况下与碱反应，以形成完成的肽-树 脂产物；
[0032] (k)如果侧链官能团存在于完成的肽-树脂产物上，那么任选地脱保护 (deprotecting)完成的肽-树脂产物的侧链官能团，其包括使完成的肽-树脂产物与适当 的脱保护试剂反应，以形成脱保护的完成的肽-树脂产物；及
[0033] (1)使肽与完成的肽-树脂产物或脱保护的完成的肽-树脂产物的固体载体树脂 断裂，以得到肽，其包括使完成的肽-树脂产物或脱保护的完成的肽-树脂产物与氨、伯胺 或仲胺反应，直到肽与树脂的断裂基本上完成；
[0034] 条件是在肽的合成中，步骤（f)和（g)必须进行至少一次。
[0035] 本发明的优选方法是其中步骤（1)的氨、伯胺或仲胺在包含醇并且任选包含非质 子极性溶剂的溶剂中。
[0036] 本发明的优选方法是其中步骤（1)进一步包括下列步骤：
[0037] 从溶剂中沉淀出断裂的肽；
[0038] 过滤固体载体树脂和沉淀出来的肽；及
[0039] 在酸溶液中提取肽，以离析肽。
[0040] 本发明的优选方法是其中第一氨基酸为Boc-L-Thr。
[0041] 本发明的优选方法是其中第一氨基酸为得到Boc-L-Thr-树脂作为第一级偶联产 物的Boc-L-Thr-铯盐，并且H-L-Thr-树脂为第一级解封闭的偶联产物。
[0042] 本发明的优选方法是其中步骤（j)中用来解封闭Boc基团的酸为TFA。
[0043] 紧接着前述方法的优选方法是其中有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或二甲基甲酰胺， 并且肽偶联试剂为二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺或N-乙基-Ν' - (3-二甲基-氨基 丙基）碳二亚胺。
[0044] 紧接着前述方法的优选方法包括在式H-L-Thr-树脂的第一级解封闭的偶 联