专利名称：：固相多肽合成阿托西般的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种阿托西般的制备方法，具体涉及固相多肽合成阿托西般的制备方法。
背景技术：
：中文名阿托西般，醋酸阿托西般，阿托西班、醋酸阿托西班。英文名Atosiban，AtosibanAcetate.结构式为Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Om-Gly-NH2分子式为C43H67Nn012S2.分子量994.2阿托西般在临床上为一种可以静注的子宫内及蜕膜、胎膜上受体的环状肽催产素竞争性拮抗剂。使用本品后可剂量相关性地抑制宫縮，并使环状肽催产素介导的前列腺素分泌减少，达到保胎的目的，可用于18岁以上，孕龄24—33周，胎儿心率正常的孕妇。国外怀孕妇女的临床实验中，本品分别与e2激动剂(利托君、沙丁胺醇、特布他林)中的一种进行了双盲比较研究，治疗意图分析的综合结果显示，本品有效地抑制宫縮，达到保胎的作用，且不良反应和停药者均较少。综合分析中两组的平均生产孕龄及胎儿或婴儿的指标(出生体重、存活率、呼吸窘迫综合征或颅内出血的发生率)未见显著差异。美国专利4,504,469是采用Boc路线，以氯甲基树脂为起始原料，经縮合反应完成接肽，用干燥的液氨进行切肽，最后经氧化反应和分离纯化。该专利存在的主要缺陷是，生产周期较长，操作复杂，人工成本较高，产生三废较多，不能满足有关方面的需要。
发明内容本发明的目的是公开一种,相多肽合成阿托西般的制备方法，以克服现有技术存在的缺陷。本发明的方法包括如下步骤(1)以RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，用TBTU/HOBt、HBTU/HOBt、BOP/HOBt、TBTU/HOAt、HBTU/HOAt或BOP/HOAt为缩合剂进行接肽反应，逐个接上氨基酸，最后一个肽链使用保护的巯基丙酸(Map(X));得保护的九肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽。所说的RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂为一种常用的氨基树脂，可采用市售产品，如天津南开和成科技有限公司牌号为HCRAm04-l的产品；(2)然后加入切肽试剂(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)切肽；(3)以乙醚为溶剂，沉淀并收集还原型阿托西般粗品；(4)将还原型阿托西般粗品溶于水中，用氨水调节PH到7.5-10.0，收集氧化型阿托西般粗品；(5)将收集的粗品通过制备型HPLC(ds或Q柱)分离纯化，获得目标产物，总收率可达到18.5%以上。以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸时的反应温度为10~60°C，切肽温度为10~60°C;优选的，本发明的方法，包括如下步骤RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂与Fmoc-Gly-OH、TBTU/HOBT和六氢吡啶反应，获得Fmoc-Gly-树脂；然后与Fmoc-Orn(Boc)-OH、TBTU/HOBT和六氢吡啶反应，获得Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂；然后与Fmoc-Pro-OH、TBTU/HOBT和六氢吡瞎反应，获得Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；然后与Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HOBT和六氢吡啶反应，获得Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；然后与Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU/HOBT和六氢吡啶反应，获得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂；然后与六氢吡啶、Fmoc—Thr(tBu)-OH/TBTU/HOBt反应，获得Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)陽Pro-Om(Boc)-Gly-树脂；然后与六氢吡啶、Fmoc-Ile-OH/TBTU/HOBt反应，获得Fmoc-Ile—Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；然后与六氢吡啶、Fmoc-D-Tyr(OEt)-OH/TBTU/HOBt反应，获得Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；然后与六氢吡啶、Fmap(X)/TBTU/HOBt反应，获得Map(SX)-D-Tyr(OEtHle-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly誦树脂；然后与TFA/HBr/HAc/TIS/EDT反应，获得Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2(还原型阿托西班)；然后进行1.氧化；2.纯化；3.去盐；4.冻干，获得IIMap-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Om-Gly-NH2(阿托西班)。更为具体的包括如下步骤(1)树脂的预处理将RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂，用DMF浸泡0.52小时，使树脂充分溶胀，氮气吹干，加入六氢吡啶的DMF溶液，108(TC反应1060分钟，氮气吹滤去除六氢吡啶，DMF洗涤，氮气吹干。六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶DMF=1:3~5体积比；六氢吡啶的DMF溶液中，RinkAmideMBHA树脂的浓度比为1克/515ml。(2)Fmoc-Gly-树脂的制备将步骤(1)预处理的树脂与Fmoc-Gly-OH(MW:297.3)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW-101.2)和DMF混合，将混合物在10-60。C的条件下反应0.5-3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；NMM:DMF=1:5~15，体积比；Fmoc-Gly-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；然后加入六氢吡啶的DMF溶液，106(TC反应10~60分钟，氮气吹千，用DMF洗漆，氮气吹干，获得Fmoc-Gly-树脂；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10-40%;六氢吡啶的DMF溶液中树脂的重量的体积浓度为1克/515ml;反应通式为应通式为1.六氢吡锭RinkAmideAM-树脂Fmoc-Gly-树脂2.TBTU/HOBtFmoc-Gly-OH(3)Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备在歩骤(2)的Fmoc-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，1060。C反应10~60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Om(Boc)-OH(MW:454.5)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW-101.2)和DMF混合，106(TC反应0.5~3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂；NMM:DMF=1:515，体积比；反应体系中Fmoc-Orn(Boc)-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10~40%;六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为l克/515ml;反应通式为(4)Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备在步骤(3)的Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，10~60°C反应10~60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Pro-OH(MW337.4)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW-101.2)和DMF混合，1060。C反应0.5~3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；NMM:DMF=1:5~15，体积比；1.六氢吡啶Fmoc-Gly-树脂Fmoc-Om(Boc)-Gly-树脂2.TBT面OBtFmoc-Om(Boc)-OH反应体系中Fmoc-Pro-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10~40%;六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为l克/515ml;反应通式为1.六氢吡啶Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂-^Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂2.TBTU/HOBtFmoc-Pro-OH(5)Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备在步骤(4)的Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，10~60。C反应10-60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7)、TBTUMW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW401.2)和DMF混合，将混合物10-60。C反应0.5~3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂树脂；NMM:DMF=1:5~15，体积比；反应体系中Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10~40%;六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为l克/515ml;反应通式为1.六氢吡啶Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂-^Fmoc-Cys(Trt)國Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂2.TBT簡OBtFmoc-Cys(Trt)-OH(6)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>树脂的制备在步骤(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，106(TC反应10~60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物1060。C反应0.5~3.0小时，氮气吹千，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂；NMM:DMF=1:5~15,体积比；反应体系中Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为1040%;六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为l克/515ml;反应通式为1.六氢吡啶Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂-2.TBT簡OBtFmoc-Asn(Trt)-OHFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)隱Gly-树脂(7)Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)國Gly國树脂的制备在步骤(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，1060'C反应10~60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Thr(tBu)-OH(MW:397.5)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物10-60。C反应0.5~3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)國Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；NMM:DMF=1:5~15，体积比；反应体系中Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10~40%;六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为l克/515ml;反应通式为1.六氢吡啶Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂-2.TBT-OBtFmoc-Thr(1Bu)-OHFmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂(8)Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备在步骤(7)的Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，106(TC反应10~60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Ile-OH(MW:353.4)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物1060。C反应0.5~3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂；NMM:DMF=1:5~15，体积比；反应体系中Fmoc-Ile-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为1040%;六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为l克/515ml;反应通式为1.六氢吡啶Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂-2.TBTU/HOBtFmoc-Ile-OHFmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂(9)Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂的制备在歩骤(8)的Fmoc-Ile-Thr(tBu)隱Asn(Trt)-Cys(Trt)曙Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，106(TC反应10~60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-D-Tyr(OEt)-OH(MW:413)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物106(TC反应0.5~3.0小时，氮气吹千，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)，Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；NMM:DMF=1:5~15，体积比；反应体系中Fmoc-D-Tyr(OEt)-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10~40%;六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为l克/515ml;反应通式为1.六氢吡啶Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂-2.TBT蘭OBtFmoc-D陽Tyr(OEt)-OHFmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂(10)Map(SX)-D曙Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂的制备在歩骤(9)的Fmoc陽D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，1060'C反应10~60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Map(SX)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF,将混合物106(TC反应0.5~3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；NMM:DMF=1:5~15，体积比；反应体系中Map(SX)的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；甲醇洗涤，抽干，氮气吹干，得保护还原型阿托西般树脂；反应通式为Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)國Asn(Trt)-Cys(Trt)國Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂Map(SX)-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂(11)切肽将切肽试剂加入保护的还原型阿托西般树脂，106(TC反应26小时，过滤，抽干，滤液加乙醚沉淀，过滤收集沉淀得还原型阿托西般粗品(MW-833.96),收率为96%;所说的切肽试剂为TFA/HBr/HAc/TIS/EDT=(800-900ml/25陽40ml/5-20ml/40-60ml/20-30ml);反应通式为Map(SX)-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂TFA/HBr/HAc/TIS/EDT-^Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2以还原型阿托西般树脂的重量计，切肽试剂的加入量为520ml/g;(12)氧化(二硫键的形成)将还原型阿托西般粗品溶于水中，加入浓度为0.11.5mol/L的氨水，调节pH到7.5-10.0，通空气搅拌约1530小时，过滤；反应通式为Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Om-Gly-NH2p『.5-10.0,02-^M^p-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2(13)纯化1.六氢吡啶2.TBT簡OBtMap(SX))-OH滤液流经制备型HPLC(C18或C"柱进行纯化流速为200-800ml/min;用分析型HPLC跟踪收集所需要的流出液。样品峰合并后，采用常规的方法去盐、除乙腈、冻干，约得白色疏松块状物成品；流动相为0.1-0.9M醋酸盐缓冲液乙腈(70-90:30-10)，体积比；或0.1-0.9M磷酸盐缓冲液乙腈(70-90:30-10)，体积比；或0.05%-0.1%三氟醋酸缓冲液乙腈(70-90:30-10),体积比；由上述公开的技术方案可见，本发明的方法，采用RinkAmide树脂、RinkAmideAM树脂或RinkAmideMBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸的方法，接肽收率高。选用Fmoc-氨基酸，原料来源方便，最后一个肽链使用保护的巯基丙酸(M叩(SX))，简化了工艺，降低了成本；采用切肽试剂(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)进行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少，且提高收率，采用制备型HPLC(C18或C8)柱进行分离纯化，避免使用TFA(三氟醋酸)进行纯化，减少三废，纯化收率高达25%以上，每步接肽收率均在99%以上；切肽后收率为95.4%，总收率为18.5%。由此可见，本发明的方法便于工业化实施，具有较大的产业化前景。图l为本发明的流程图。具体实施例方式实施例和前述过程中所采用的原料列表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>10<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例1肽链制备称取RinkAmideAM树脂相当于720mmol的量(200目，0.80mmol/g)，装入SHYM-25的多肽合成仪中，用6000mlDMF浸泡，使树脂溶胀，抽干。加入6400毫升体积浓度为25。/。六氢吡啶的DMF溶液，25'C振摇30分钟。抽干，分别用DMF、洗涤数次，抽干。Fmoc-Gly-树脂的制备力口Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，1440mmo1)428g、HOBT(MW:135.1，1440mmol)195g、TBTU(MW:321,1440mmol)462g，NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，将混合物25'C振摇1.5小时。抽干，DMF洗涤数次，抽干。Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备加入6400毫升体积浓度为25%六氢吡淀的DMF溶液，25'C振摇30分钟。抽干，用DMF洗涤数次，抽干。Fmoc-Orn(Boc)-OH(MW:454.5，1440mmo1)654g、TBTU(MW:321，1440mmol)462g，HOBT(MW:135.1，1440讓ol)195g，NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF,将混合物25t振摇1.5小时。抽干，DMF洗涤数次，抽干。Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂的制备加入6400毫升体积浓度为25X六氢吡啶的DMF溶液，25。C振摇30分钟。抽干，用DMF洗涤数次，抽干。力口Fmoc-Pro誦OH(MW:337.4，1440mmo1)486g,TBTU(MW:321，1440腿o1)462g，HOBT(MW:135.1，1440mmol)195g,NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，将混合物25'C振摇1.5小时。抽干，DMF洗涤数次，抽干。Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备加入6400毫升体积浓度为25X六氢吡啶的DMF溶液，25'C振摇30分钟。抽干，用DMF洗涤数次，抽干。力口Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7,1440簡ol)843g，TBTU(MW:321,1440讓ol)486g,HOBT(MW:135.1,1440函ol)195g,NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，将混合物25'C振摇1.5小时。抽干，DMF洗漆数次，抽干。Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备加入6400毫升体积浓度为25X六氢吡啶的DMF溶液，25'C振摇30分钟。抽干，用DMF洗涤数次，抽干。力口Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7，1440mmol)859g，TBTU(MW:321，1440讓o1)486g，HOBT(MW:135.1，1440腿o1)195g，NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，将混合物25'C振摇1.5小时。抽干，DMF洗涤数次，抽干。Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备加入6400毫升体积浓度为25X六氢吡啶的DMF溶液，25'C振摇30分钟。抽干，用DMF洗漆数次，抽干。加Fmoc-Thr(tBu)-OH(MW:397.5，1440mmol)572g，TBTU(MW:321，1440mmo1)486g，HOBT(MW:135.1,1440mmo1)195g,NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，将混合物25'C振摇1.5小时。抽干，DMF洗涤数次，抽干。Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)誦Cys(Trt)陽Pro-Om(Boc)-Gly-树脂的制备加入6400毫升体积浓度为25X六氢吡啶的DMF溶液，25t:振摇30分钟。抽干，用DMF洗涤数次，抽干。加Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，1440mmol)509g，TBTU(MW:321,1440mmo1)486g，HO^T(MW:135.1，1440腿o1)195g,NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，将混合物25。C振摇1.5小时。抽干，DMF洗涤数次，抽干。Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备加入6400毫升体积浓度为25X六氢吡啶的DMF溶液，25"C振摇30分钟。抽干，用DMF洗涤数次，抽干。力口Fmoc隱D-Tyr(OEt)-OH(MW:413,1440mmo1)595g，TBTU(MW:321,1440mmo1)486g，HOBT(MW:135.U440mmo1)195g，NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF，将混合物25'C振摇1.5小时。抽干，DMF洗涤数次，抽干。Map-D-Tyr(OEt)國Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂的制备加入400毫升体积浓度为25%六氢吡啶的DMF溶液，25。C振摇30分钟。抽干，用DMF洗涤数次，抽干。力口Map(MW:196，1440mmo1)282g、TBTU(MW:321，1440mmol)486g，HOBT(MW:135.1，1440mmo1)195g,NMM320ml(MW=101.2)，4000mlDMF,将混合物25。C振摇1.5小时。抽干，DMF洗涤数次，抽干。再用无水甲醇洗涤数次。抽干后，放入真空抽干器中抽干，称重，得保护阿托西般树脂约700g。切肽取700g保护的阿托西般树脂转移到切肽瓶中，冷却下，边搅拌边加入切肽试剂(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT=850ml/34ml/llml/51ml/25ml),25。C搅拌3小时。过滤，抽干，滤液加无水乙醚沉淀，过滤收集沉淀得约37g还原型阿托西般粗品(MW^833.96，44.4mmo1)，收率为95.4%。氧化(二硫键的形成)将37g还原型阿托西般粗品溶于40L纯化水中，在搅拌下加入lmol/L氨水，调节pH到8，搅拌过夜，过滤。取700g还原型阿托西班粗品溶于5000ml纯化水中，用NaOH调pH7.5，在搅拌下加入双氧水，室温反应，液相色谱仪跟踪检测，确定反应终点。力BHAc至PH4.5土0.5后，过滤。纯化滤液经制备型HPLC(C18柱)进行纯化；流动相0.5M磷酸缓冲液乙腈(80:20);流速为550ml/min;检测波长为220nm;用分析型HPLC跟踪收集所需要的流出液。样品峰合并后去盐、除乙腈、冻干，约得132g白色疏松块状物成品(MW:993.4，133mmo1);总收率约18.5%(以RinkAmideAM-树脂的720mmol计)。权利要求1.固相多肽合成阿托西般的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)以RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，用TBTU/HOBt、HBTU/HOBt、BOP/HOBt、TBTU/HOAt、HBTU/HOAt或BOP/HOAt为缩合剂进行接肽反应，逐个接上氨基酸，最后一个肽链使用保护的巯基丙酸(Map(SX))；得保护的九肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽；(2)然后加入切肽试剂(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)切肽；(3)以乙醚为溶剂，沉淀并收集还原型阿托西般粗品；(4)将还原型阿托西般粗品溶于水中，用氨水调节PH到7.5-10.0，收集氧化型阿托西般粗品；(5)将收集的粗品通过制备型HPLC(C18或C8柱)分离纯化，获得目标产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂与Fmoc-Gly-OH、TBTU/HOBT和六氢吡啶反应，获得Fmoc-Gly-树脂；然后与Fmoc-Orn(Boc)-OH、TBTU/HOBT和六氢吡啶反应，获得Fmoc-Om(Boc)-Gly-树脂；然后与Fmoc-Pro-OH、TBTU/HOBT和六氢吡锭反应，获得Fmoc-Pro-0rn(Boc)-Gly-树脂；然后与Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HOBT和六氢吡啶反应，获得Fmoc陽Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂；然后与Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU/HOBT和六氢吡啶反应，获得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)陽Gly-树脂；然后与六氢吡啶、Fmoc—Thr(tBu)-OH/TBTU/HOBt反应，获得Fmoc-Thr(但u)陽Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；然后与六氢吡啶、Fmoc-Ile-OH/TBTU/HOBt反应，获得Fmoc-Ile—Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；然后与六氢吡啶、Fmoc-D-Tyr(OEt)-OH/TBTU/HOBt反应，获得Fmoc-D-Tyr(OEt)陽Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)陽Gly-树脂；然后与六氢吡啶、Map(X)-OH/TBTU/HOBt反应，获得Map(SX)-D-Tyr(OEt)隱Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)隱Gly-树脂；然后与TFA/HBr/HAc/TIS/EDT反应，获得Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Om-Gly-NH2(还原型阿托西班)；然后进行1.氧化；2.纯化；3.去盐；4.冻干，获得Map-D-Tyr(OEt)國Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn墨Gly-NH2(阿托西班)。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)树脂的预处理将RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂，用DMF浸泡，使树脂溶胀，氮气吹干，加入六氢吡啶的DMF溶液，10-80t:反应1060分钟，氮气吹滤去除六氢吡啶，DMF洗涤，氮气吹干；(2)Fmoc-Gly-树脂的制备将步骤(1)预处理的树脂与Fmoc-Gly-OH(MW:297.3)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW^01.2)和DMF混合，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；然后加入六氢吡啶的DMF溶液，反应，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得Fmoc-Gly-树脂；应通式为1.六氢吡啶RinkAmideAM-树脂_Fmoc-Gly-树脂2.TBT簡OBtFmoc-GIy-OH(3)Fmoc-Om(Boc)-Gly-树脂的制备在步骤(2)的Fmoc-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Orn(Boc)-OH(MW:454.5)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW^01.2)和DMF混合，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂；反应通式为1.六氢吡啶Fmoc-Gly-树脂_^Fmoc-Om(Boc)-Gly-树脂2.TBTU/HOBtFmoc-Orn(Boc)-OH(4)Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备在步骤(3)的Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干，加入Fmoc-Pro-OH(MW337.4)、TBTU(MW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW401.2)和DMF混合，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂；反应通式为1.六氢吡锭Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂-^-^Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂2.TBTU/HOBtFmoc-Pro-OH(5)Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备在步骤(4)的Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7)、TBTUMW:321)、HOBT(MW:135.1)、NMM(MW-101.2)和DMF混合，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹千；获得Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂树脂；反应通式为1.六氢吡啶Fmoc-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂-^Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂2.TBT簡OBtFmoc-Cys(Trt)-OH(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备在步骤(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Asn(Trt)隱Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂反应通式为Fmoc-Cys(Trt)-Pro隱Orn(Boc)-Gly-树脂Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂(7)Fmoc-Thr(但u)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备在步骤(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，反应，氮气吹千，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Thr(tBu)-OH(MW:397.5)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂；反应通式为l.六氢n比啶Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂-2.TBT簡OBtFmoc-Thr(tBu)-OHFmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)誦Gly-树脂(8)Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro陽Orn(Boc)陽Gly-树脂的制备在步骤(7)的Fmoc-Thx(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干，加入Fmoc-Ile-OH(MW:353.4)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反应，氮气吹千，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；反应通式为1.六氢吡啶Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂-2.TBT區OBtFmoc-Ile-OHFmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro國Orn(Boc)-Gly-树脂(9)Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂的制备1.六氢吡啶2.TBTU/HOBtFmoc-Asn(Trt)-OH在歩骤(8)的Fmoc隱Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，反应，氮气吹千，DMF洗涤，氮气吹干，加入Fmoc-D-Tyr(OEt)-OH(MW:413)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反应，氮气吹千，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂；反应通式，为1.六氢吡啶Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)"Pro陽Om(Boc)-Gly-树脂-2.TBT簡OBtFmoc-D-Tyr(OEt)-OHFmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂(10)Map(SX)-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-Gly-树脂的制备在步骤(9)的Fmoc-D國Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)國Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly誦树脂中，加入夭氢吡啶的DMF溶液，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干，加入Map(SX)-OH、TBTU、HOBT、NMM禾卩DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干，洗涤，抽干，氮气吹干，得保护还原型阿托西般树脂；反应通式为1.六氢吡啶Fmoc-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Om(Boc)-2.TBTU/HOBtMap(SX))-OHMap(SX)-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂(11)切肽将切肽试剂加入保护的还原型阿托西般树脂，反应，过滤，抽干，滤液加乙醚沉淀，过滤收集沉淀得还原型阿托西般粗品(MW:833.96)，收率为96%;所说的切肽试剂为TFA/HBr/HAc/TIS/EDTt800-900ml/25-40m]/5-20mV40-60ml/20-30ml);反应通式为Map(SX)-D隱Tyr(OEt)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂TFA/HBr/HAc/TIS/EDT-Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Om-Gly-NH2(12)氧化将还原型阿托西般粗品溶于水中，加入浓度为0.11.5mol/L的氨水，调节pH到7.5-10.0，通空气搅拌2028小时，过滤；反应通式为Map-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Oni-Gly-NH2P『.5-10.0，02_^Mlp國D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-CysZPro-Om-Gly-NH2(13)纯化滤液流经制备型HPLC(C18或Q)柱进行纯化用分析型HPLC跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后，去盐、除乙腈、冻干，约得白色疏松块状物成品。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以还原型阿托西般树脂的重量计，切肽试剂的加入量为520ml/g。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(13)中，流动相为0.1-0.9M醋酸盐缓冲液:乙腈(70-90:30-10)，体积比；或0.1-0.9M磷酸盐缓冲液:乙腈(70-90:30-10)，体积比；或0.05%-0.1%三氟醋酸缓冲液:乙腈(70-90:30-10)，体积比。6.根据权利要求15任一项所述的方法，其特征在于，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸时的反应温度为10~60°C。7.根据权利要求15任一项所述的方法，其特征在于，切肽温度为10~60°C。全文摘要本发明公开了一种固相多肽合成阿托西般的制备方法，包括如下步骤以RinkAmide树脂、RinkAmideMBHA树脂或RinkAmideAM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸，最后一个肽链使用保护的巯基丙酸(Map(SX))；得保护的九肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽；然后切肽，收集还原型阿托西般粗品；调节pH到7.5-10.0，收集氧化型阿托西般粗品；再通过制备型HPLC(C<sub>18</sub>或C<sub>8</sub>柱)分离纯化，获得目标产物。本发明的方法，原料来源方便，简化了工艺，降低了成本；三废污染少，且收率高，便于工业化实施，具有较大的产业化前景。文档编号C07K1/00GK101357937SQ200710044420公开日2009年2月4日申请日期2007年7月31日优先权日2007年7月31日发明者周逸明,颀崔申请人:崔颀;周逸明;上海苏豪逸明制药有限公司