固相肽合成方法及相关系统的制作方法

固相肽合成方法及相关系统的制作方法
【专利说明】固相化合成方法及相关系统
[oow] 相关申请
[0002] 本申请是2013年3月15日提交的名称为"SolidPhaseP巧tideSynthesis ProcessesandAssociatedSystems"的美国专利申请序列号13/833,745(其通过引用W 其整体并入本文用于所有目的）的部分继续申请。
技术领域
[0003] 一般性描述了用于进行固相肤合成的系统和方法。
【背景技术】
[0004] 固相肤合成是用于在固体支持物上化学合成肤的方法。在固相肤合成中，氨基酸 或肤通常通过C-末端与固体支持物结合。通过偶联反应将新的氨基酸添加至结合的氨基 酸或肤。由于非期望反应的可能性，通常使用保护基团。迄今为止，固相肤合成已经成为化 学肤合成的标准实践。已经通过自动化固相肤合成仪的商业成功证明了固相肤合成的广泛 效用。虽然固相肤合成已被使用了 30多年，但是还没有开发出快速合成技术。因此，需要 改进的方法和系统。

【发明内容】
阳0化]一般性描述了固相肤合成方法及相关系统。某些实施方案设及可用于快速地进行 固相肤合成而同时保持高产率的系统和方法。在一些实施方案中，可WW减少进行固相肤 合成所需的时间量的方式来加热、运输和/或混合试剂。在一些情况下，本发明的主题设及 相关的产品、特定问题的替代解决方案和/或一个或更多个系统和/或制品的多种不同的 用途。
[0006] 在一些实施方案中，提供了用于向肤添加氨基酸残基的方法。在某些实施方案中， 所述方法包括加热包含氨基酸的流W使得所述氨基酸的溫度提高至少约TC;W及使经加 热的氨基酸暴露于固定在固体支持物上的多个肤，其中在使经加热的氨基酸暴露于所述肤 之前且在约30秒内进行所述加热步骤。
[0007] 在某些实施方案中，所述方法包括提供多个包含保护基团的肤，每个肤均固定在 固体支持物上；进行第一氨基酸添加循环，其包括使氨基酸暴露于固定肤W使得向至少约 99%的所述固定肤添加氨基酸残基；W及进行第二氨基酸添加循环，其包括使氨基酸暴露 于固定肤W使得向至少约99%的所述固定肤添加氨基酸残基。在一些实施方案中，第一氨 基酸添加循环结束与第二氨基酸添加循环结束之间的总时间量为约10分钟或更短，并且 保护基团包括巧基甲氧幾基（fluoren^meth^oxycarbonyl)保护基团和/或第一氨基酸 添加循环结束与第二氨基酸添加循环结束之间的总时间量为约5分钟或更短。
[0008] 在某些实施方案中，所述方法包括提供固定在固体支持物上的多个肤；W及使活 化氨基酸暴露于固定肤W使得至少一部分所述活化氨基酸与所述固定肤结合W形成新结 合的氨基酸残基；其中至少约99%的所述固定肤在约1分钟或更短的时间内添加了氨基酸 残基。
[0009] 在某些实施方案中，所述方法包括使包含氨基酸的第一流流动；使包含氨基酸活 化剂的第二流流动；合并所述第一流和第二流W形成包含活化氨基酸的混合流体；并且在 合并所述第一流和第二流W形成混合流体之后的约30秒内将所述混合流体暴露于固定在 固体支持物上的多个肤。
[0010] 在某些实施方案中，所述方法包括提供多个包含保护基团的肤，每个肤均固定在 固体支持物上；使去保护试剂暴露于固定肤W从至少一部分的所述固定肤中除去保护基 团；除去至少一部分的所述去保护试剂；使活化氨基酸暴露于所述固定肤W使得至少一部 分的所述活化氨基酸与所述固定肤结合W形成新结合的氨基酸残基；W及除去至少一部分 不与所述固定肤结合的活化氨基酸；在一些实施方案中，在氨基酸暴露步骤期间，至少约 99 %的固定肤添加了氨基酸残基。在某些实施方案中，进行所有的去保护试剂暴露步骤、去 保护试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化氨基酸除去步骤的组合所花费的总时间量 为约10分钟或更短，并且所述保护基团包括巧基甲氧幾基保护基团和/或进行所有的去保 护试剂暴露步骤、去保护试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化氨基酸除去步骤的组 合所花费的总时间量为约5分钟或更短。
[0011] 当结合附图考虑对本发明的多种非限制性实施方案的W下详细描述时，本发明的 其他优点和新的特征将变得明显。在本说明书和通过引用并入的文献包含冲突和/或不一 致的公开内容的情况下，应W本说明书为准。
【附图说明】
[0012] 将通过参考附图举例的方式来描述本发明的非限制性实施方案，其是示意性的且 并不意在按比例绘制。在图中，所示的每一个相同的或几乎相同的组件通常由单个数字表 示。为了清楚的目的，在不必进行说明就可使本领域普通技术人员理解本发明的情况下，并 非在每幅图中的每个组件都被加W标记，也不必示出本发明每个实施方案中的每个组件。 在附图中：
[0013] 图1是根据一组实施方案之用于进行肤合成的一个系统的示意图；
[0014] 图2A-2D是根据某些实施方案的（A)肤合成系统的一个示例性示意图，度）一个 示例性肤合成系统的照片，（C)合成的肤Fmoc-ALFALFA-CONHz的色谱图W及值）反应器的 一个示例性示意图；
[001引图3A-3C是根据一组实施方案的（A)用不同的活化氨基酸暴露时间合成的LYRAG-CONHz肤的色谱图，度）用不同的活化氨基酸暴露时间合成的Fmoc-ALF-CONH2肤的色 谱图，和（C) 一个示例性的合成时间线；
[0016] 图4A-4D是根据某些实施方案的通过W下条件合成的ACP(65-74)肤的色谱图和 质谱：(A)在60°C下使用HATU合成和度）在60°C下使用皿TU合成，（C)在室溫下使用皿TU 合成，W及做使用相同的合成时间线在分批条件下使用皿TU合成；
[0017] 图5A-5B是根据一组实施方案的（A)合成的化IA(AlOL)肤的色谱图和质谱W及 度）合成的HIV-IPR(81-99)肤的色谱图和质谱； 阳0化]图6A-6E是根据某些实施方案的在如表1所示的多种条件（A) 5、做7、似8和 值)4下合成的GCF肤的总离子流色谱，W及胆）是可靠（authentic)的Gly-D-切S-L-Phe 样品的一个示例性总离子流色谱；
[0019] 图7A-7E是根据某些实施方案的（A)来自S个肤片段的亲和体（affibody)蛋白 之化学连接的一个示例性方案，度）第一亲和体片段的色谱图和质谱，（C)第二亲和体片段 的色谱图和质谱，值）第=亲和体肤片段的色谱图和质谱，W及巧）纯化的亲和体的色谱图 和质谱；
[0020] 图8A-8F是根据某些实施方案的（A-B)分别使用FmocN-末端保护基团的N-末 端亲和体片段和使用BocN-末端保护基团的常规手动排布的总离子色谱图，（C-D)分别使 用FmocN-末端保护基团的中间亲和体片段和使用BocN-末端保护基团的常规手动排布 的总离子色谱图，W及巧-巧分别使用FmocN-末端保护基团的C-末端亲和体片段和使用 BocN-末端保护基团的常规手动排布的总离子色谱图；
[0021] 图9A-犯是根据某些实施方案的（A)纯化的第一亲和体片段的总离子色谱图，度） 纯化的第二亲和体片段的总离子色谱图，（C)纯化的第=亲和体片段的总离子色谱图，值） 来自第一片段和第二片段之连接的纯化的亲和体片段的总离子色谱图，W及巧）纯化的亲 和体的色谱图和质谱；
[0022] 图10是根据一组实施方案的在肤的合成期间记录为时间之函数的紫外吸光度 图；
[0023] 图11是根据一组实施方案的流量相对于洗涂时间的图；
[0024] 图12A-G是根据一组实施方案的（A)入口（左）和出口（右）的照化做垫片 (spacer)的照片，（C)反应器主体单元的照片，值）组装式反应器的照片，W及巧）示出了 反应器主体、玻璃料和垫片之反应器的示意图，（巧反应器的剖面图，W及（G)用反应器所 使用的合成时间线；
[00巧]图13是根据一组实施方案的用于进行肤合成之一个示例性系统的示意图；
[0026] 图14是根据某些实施方案的合成的肤ALFALFA-C0NHNH2的一个示例性总离子色 谱图；
[0027] 图15示出了使用本文描述的某些肤合成系统所制成的肤的两个示例性色谱图；
[0028] 图16A-H是根据一组实施方案的用第二代方案在W下条件下合成的ACP化5-74) 的粗LCMS色谱图：(A)在60°C下使用HATU，度）在60°C下使用皿TU，（C)在室溫下使用 皿TU和值）在室溫下使用可比较的手动分批方法，W及用第一代方案在W下条件下合成的 ACP巧）（65-74)的粗LCMS色谱图：似在60°C下使用HATU，（巧在60°C下使用皿TU，（G)在 室溫下使用皿TU和（H)在室溫下使用可比较的手动分批方法；
[0029] 图17包括根据一些实施方案合成的生物素化肤的色谱图；
[0030] 图18A-D是根据一组实施方案的（A)用第二代方案合成的化IA(AlOL)芋螺毒 素（conotoxin)，度）用第二代方案合成的HIV-IPR(81-99)，（C)用第一代方案合成的 化IA(AlOL)芋螺毒素和值）用第一代方案合成的HIV-IPR(81-99)的色谱图；
[00川图19A-F是根据某些实施方案的（A-C)用第二代方案在氯S苯甲基 (Chlorotrytyl)酷阱官能化的聚苯乙締上合成的亲和体片段和值-巧用第一代方案在修 饰的Wang树脂上合成的亲和体片段的色谱图；
[0032] 图20包括根据一组实施方案合成的谷脫甘肤类似物之文库的色谱图；
[0033] 图21A-C是根据某些实施方案合成的富含半脫氨酸的肤的色谱图；
[0034] 图22A-B是根据某些实施方案的（A)使用自动化方法合成的（ALF)7和做使用 手动的方法合成的（ALF)7的色谱图。
[0035] 图23A-D是根据一组实施方案的（A)自动化流动平台的示意图，度）通过自动化 流动平台来渗入氨基酸残基而使用的合成时间线，（C)示出ALFALFA的色谱图，值）示出 ACP化5-74)的色谱图和似示出（AL巧7的色谱图；
[0036] 图24A-B示出了（A)使用包括除去步骤的添加循环合成的肤的色谱图和做使用 缺少一个或更多个除去步骤的添加循环合成的肤的色谱图；
[0037] 图25A-F示出了根据一组实施方案的（A)DARPin合成的一个合成方案，度-E)片 段DARPin的色谱图和（巧DARPin的色谱图； 阳03引图26A-F示出了根据某些实施方案的（A)芽抱杆菌RNA酶度arnase)合成的一个 合成方案，度-巧片段芽抱杆菌RNA酶的色谱图和（巧芽抱杆菌RNA酶的色谱图；W及
[0039] 图27A-C示出了根据某些实施方案的（A)人膜岛素A链的色谱图，做人膜岛素B 链的色谱图和（C)进化的邸TI-II整联蛋白结合肤的色谱图。
【具体实施方式】
[0040] 一般性地描述了用于进行固相肤合成的系统和方法。固相肤合成是其中向已被固 定在固体支持物上的肤添加氨基酸残基的已知方法。在某些实施方案中，本发明的系统和 方法可用于快速地进行固相肤合成而同时保持高产率。某些实施方案设及可用于W减少进 行固相肤合成所需的时间量的方式来加热、运输和/或混合试剂的方法和系统。
[0041] 某些实施方案设及向固定肤添加氨基酸的方法。图1是可用于进行本文所描述的 某些发明过程的示例性系统5的示意图。在某些实施方案中，本文所描述的系统和方法（例 如，在图1中的系统5)可设及基于流动的合成（与此相反的是用于许多传统的固相肤合成 系统的基于分批的合成）。在一些运样的实施方案中，可进行持续的肤合成，其中将（一种 形式或另一种形式的）流体基本上持续地运输经过固定肤。例如，在某些实施方案中，可将 试剂和漂洗流体交替且持续地运输通过固定肤。
[0042] 在一些实施方案中，肤20可被固定在固体支持物15上。固体支持物15固定可 包含在容器（例如反应器10)内。在一些实施方案中，如图1中所示，多个试剂储存器 (reservoir)可位于反应器10的上游并与其流体地连接。在一些实施方案中，试剂储存器 25容纳氨基酸（例如，预活化的氨基酸和/或未完全活化的氨基酸）。在一些情况下，试剂 储存器26容纳能够完成氨基酸活化的氨基酸活化剂（例如，碱性液体、碳二亚胺和/或脈 鐵（uronium)活化剂）。在某些实施方案中，试剂储存器27容纳去保护试剂，例如赃晚或= 氣乙酸。试剂储存器28可容纳可用于例如试剂除去步骤的溶剂，例如二甲基甲酯胺值MF)。 虽然为了简单起见在图1中示出了单一储存器，但是应当理解在示出单一储存器的图1中， 可使用多重储存器（例如，每个包含不同种类的氨基酸、不同种类的去保护试剂等）来代替 单一储存器。
[0043] 在某些实施方案中，肤20包含保护基团，例如，在肤的N-末端。如本文所使用的 术语"保护基团"具有其在本领域中的普通含义。保护基团包括连接至或被配置成连接至 分子（例如，肤）内的反应性基团（即，受保护的基团）W使得所述保护基团阻止或W其他 方式抑制受保护的基团参与反应的化学部分。可通过将保护基团连接至分子来进行保护。 当将保护基团从分子中除去时，例如，通过除去保护基团的化学转化，可发生去保护。
[0044] 在一些实施方案中，多个包含保护基团的肤可W与固体支持物结合W使得每个肤 固定于固体支持物上。例如，所述肤可通过其C-末端与固相支持物结合，从而固定所述肤。
[0045] 在一些实施方案中，向固定肤添加氨基酸残基的方法包括使去保护试剂暴露于所 述固定肤W从至少一部分固定肤中除去至少一部分保护基团。在某些实施方案中，可配置 去保护试剂暴露步骤W使得保留侧链保护基团，而N-末端保护基团被除去。例如，在某些 实施方案中，使用来保护肤的保护基团包括巧基甲氧幾基（Fmoc)。在一些运样的实施方 案中，包含赃晚（例如赃晚溶液）的去保护试剂可暴露于固定肤W使得从至少一部分的固 定肤中除去Fmoc保护基团。在一些实施方案中，用来保护肤的保护基团包括叔下氧幾基 度OC)。在一些运样的实施方案中，包含=氣乙酸的去保护试剂可暴露于固定肤W使得从至 少一部分的固定肤中除去Boc保护基团。在一些情况下，保护基团（例如，叔下氧幾基，即 Boc)可与肤的N-末端结合。
[0046] 在一些实施方案中，向固定肤添加氨基酸残基的方法包括除去至少一部分的去保 护试剂。在一些实施方案中，可W除去至少一部分可在去保护步骤期间形成的任何反应副 产物（例如，除去的保护基团）。在一些情况下，可通过用例如储存在任选的储存器28中的 流体（例如，液体如含水溶剂或无水溶剂、超临界流体等）洗涂肤、固体支持物和/或周围 区域来除去去保护试剂（W及在某些实施方案中的副产物）。在一些情况下，除去去保护 试剂和反应副产物可能会改善随后步骤的性能（例如，通过防止副反应）。在某些实施方 案中，随后步骤的性能并不依赖于至少一部分（例如，基本上全部）去保护试剂和/或反应 副产物的除去。在一些运样的情况下，除去步骤是任选的。在其中除去步骤为任选的实施 方案中，可W减少除去步骤（例如，减少除去步骤的时间、减少在除去步骤中使用的溶剂的 量）和/或消除除去步骤。减少或消除一个或更多个除去步骤可减少总的循环时间。应当 理解的是，如果减少或消除了任选的除去步骤，则添加循环中的随后步骤可用来除去至少 一部分的去保护试剂和/或反应副产物，例如，由于系统中的流体流动。
[0047] 在某些实施方案中，向固定肤添加氨基酸残基的方法包括使活化氨基酸暴露于所 述固定肤W使得至少一部分的所述活化氨基酸与所述固定肤结合W形成新结合的氨基酸 残基。例如，所述肤可暴露于与肤的去保护N末端反应的活化氨基酸。在某些实施方案中， 如在下面更详细地讨论的，可通过混合含氨基酸的流与活化剂流来活化氨基酸W用于与去 保护的肤进行反应。在一些情况下，可保护活化氨基酸的胺基W使得添加氨基酸导致具有 受保护N-末端的固定肤。
[0048] 在一些实施方案中，向固定肤添加氨基酸残基的方法包括除去至少一部分未与固 定肤结合的活化氨基酸。在一些实施方案中，可除去可在活化氨基酸暴露步骤期间形成的 至少一部分的反应副产物。在一些情况下，可通过用例如储存在任选的储存器28中的流体 (例如，液体如含水溶剂或无水溶剂、超临界流体等）洗涂肤、固体支持物和/或周围区域 来除去活化氨基酸和副产物。在一些情况下，除去至少一部分的活化氨基酸和反应副产物 可提高随后步骤的性能（例如，通过防止副反应）。在某些实施方案中，随后步骤的性能并 不依赖于至少一部分（例如，基本上全部）活化氨基酸和/或反应副产物的除去。在一些 运样的情况下，除去步骤是任选的。在其中除去步骤为任选的实施方案中，可减少除去步骤 (例如，减少除去步骤的时间、减少除去步骤中所使用的溶剂的量）和/或消除除去步骤。 减少或消除一个或更多个除去步骤可减少总的循环时间。应当理解的是，如果减少或消除 了可选的除去步骤，则添加循环中的随后步骤可用来除去至少一部分的活化氨基酸和/或 反应副产物，例如，由于系统中的流体流动。
[0049] 应当理解的是，W上提及的步骤是示例性的且氨基酸添加循环不必包括所有W上 提及的步骤。例如，氨基酸添加循环可W不包括去保护试剂除去步骤和/或活化氨基酸除 去步骤。通常，氨基酸添加循环包括导致氨基酸残基添加至肤的任何系列的步骤。
[0050] 在某些实施方案中，在氨基酸添加步骤期间，添加氨基酸可导致肤渗入单个额外 的氨基酸残基（即，可向固定肤添加单个氨基酸残基，W使得在添加步骤后给定的肤包含 单个额外的氨基酸残基）。在一些运样的实施方案中，随后的氨基酸添加步骤可用于通过单 独地添加氨基酸残基直至合成所需的肤来建立肤。在一些实施方案中，可向固定在固体支 持物上的肤添加一个W上的氨基酸残基（例如，W肤的形式）（即，可向给定的固定肤添加 包含多个氨基酸残基的肤）。通过本领域普通技术人员已知的方法（例如，片段缩合、化学 连接）可实现向固定肤添加肤。也就是说，在氨基酸添加步骤期间，向固定肤添加氨基酸可 包括向固定肤添加单个氨基酸残基或者向固定肤添加多个氨基酸残基（例如，作为肤）。
[0051] 在一些实施方案中，可W比常规方法显著更快地向肤添加氨基酸。在某些实施方 案中，进行步骤的组合所花费的总时间量受保护基团的影响。例如，在其中保护基团包括巧 基甲氧幾基（Fmoc)的某些实施方案中，进行所有的去保护试剂暴露步骤、去保护试剂除去 步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化氨基酸除去步骤的组合所花费的总时间量为约10分钟 或更短、约9分钟或更短、约8分钟或更短、约7分钟或更短、约6分钟或更短、约5分钟或 更短、约4分钟或更短、约3分钟或更短、约2分钟或更短、约1分钟或更短、约10秒至约10 分钟、约10秒至约9分钟、约10秒至约8分钟、约10秒至约7分钟、约10秒至约6分钟、 约10秒至约5分钟、约10秒至约4分钟、约10秒至约3分钟、约10秒至约2分钟或约10 秒至约1分钟。在某些实施方案（包括其中保护基团包括叔下氧幾基度OC)、巧基甲氧幾基 (Fmoc)和/或其他类型的保护基团的实施方案）中，进行所有的去保护试剂暴露步骤、去保 护试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化氨基酸除去步骤的组合所花费的总时间量为 约5分钟或更短、约4分钟或更短、约3分钟或更短、约2分钟或更短、约1分钟或更短、约 10秒至约5分钟、约10秒至约4分钟、约10秒至约3分钟、约10秒至约2分钟或约10秒 至约1分钟。
[0052] 一般而言，通过将进行去保护试剂暴露步骤所花费的时间量加上进行去保护试 剂除去步骤所花费的时间量和进行活化氨基酸暴露步骤所花费的时间量W及进行活化氨 基酸除去步骤所花费的时间量来计算进行所有的去保护试剂暴露步骤、去保护试剂除去步 骤、活化氨基酸暴露步骤和活化氨基酸除去步骤的组合所花费的总时间量。
[0053] 在其中如本文所描述的添加循环缺少一个或更多个除去步骤并且保护基团包括 巧基甲氧幾基（Fmoc)的实施方案中，进行所有的添加循环步骤（例如，去保护试剂暴露步 骤、活化氨基酸暴露步骤和活化氨基酸除去步骤；去保护试剂暴露步骤、去保护试剂除去步 骤和活化氨基酸暴露步骤；去保护试剂暴露步骤和活化氨基酸暴露步骤）的组合所花费的 总时间量为约10分钟或更短、约9分钟或更短、约8分钟或更短、约7分钟或更短、约6分 钟或更短、约5分钟或更短、约4分钟或更短、约3分钟或更短、约2分钟或更短、约1分钟 或更短、约0. 75分钟或更短、约10秒至约10分钟、约10秒至约9分钟、约10秒至约8分 钟、约10秒至约7分钟、约10秒至约6分钟、约10秒至约5分钟、约10秒至约4分钟、约 10秒至约3分钟、约10秒至约2分钟或者约10秒至约1分钟。在某些实施方案（包括其 中保护基团包括叔下氧幾基度OC)、巧基甲氧幾基（Fmoc)和/或其他类型的保护基团的实 施方案）中，进行缺少一个或更多个除去步骤的添加循环中所有步骤的组合所花费的总时 间量为约5分钟或更短、约4分钟或更短、约3分钟或更短、约2分钟或更短、约1分钟或更 短、约10秒至约5分钟、约10秒至约4分钟、约10秒至约3分钟、约10秒至约2分钟或约 10秒至约1分钟。
[0054] 一般而言，通过将进行去保护试剂暴露步骤所花费的时间量加上进行去保护试剂 除去步骤（如果存在的话）所花费的时间量和进行活化氨基酸暴露步骤所花费的时间量W 及进行活化氨基酸除去步骤（如果存在的话）所花费的时间量来计算进行缺少一个或更多 个除去步骤的添加循环中所有步骤的组合所花费的总时间量。
[0055] 在某些实施方案中，第一氨基酸添加步骤（和/或随后的氨基酸添加步骤）可W W相对高的产率添加氨基酸。例如，某些实施方案包括将氨基酸暴露于固定肤W使得向至 少约99%、至少约99. 9%、至少约99. 99%或基本上100%的固定肤添加氨基酸残基。在某 些实施方案中，可进行第二（W及在一些实施方案中，第=、第四、第五和/或随后的）氨基 酸添加循环，其可包括使氨基酸暴露于固定肤W使得向至少约99%、至少约99. 9%、至少 约99. 99 %或基本