处，使用实施例8所述的反应器、实施例13所述的方法和HATU偶 联剂合成运些。使用DMF中的20%赃晚作为去保护试剂合成所有肤。所有半脫氨酸是受Acm保护的并且渗入76G1U作为环己基醋。 阳222] 对于B[1]的合成，通过在递送鄉氨酸偶联剂之后暂停添加循环将C-末端鄉氨酸 与树脂偶联10分钟。认为可使用较短的偶联和/或较高溫度下的偶联，然而发现实施例13 所述的6(TC下30秒的偶联不足W数量上将位阻鄉氨酸与位阻=苯甲基酷阱树脂结合。 阳223]对于B[2]的合成而言，如B[l]中将C-末端鄉氨酸与树脂偶联10分钟，并且用径 基甲氧基苄基（HMB)骨架保护渗入33Ala。该残基用DCC/HOBt而不是HATU活化并通过在 完成偶联剂递送之后暂停氨基酸添加循环25分钟而偶联25分钟。随后谷氨酸通过在完成 偶联剂递送之后暂停氨基酸添加循环30分钟来偶联30分钟。认为可通过在更高溫度下操 作来加速渗入受HMB保护的氨基酸。
[0224] 如上所述W及实施例8和13合成B3。 阳225] B4在由化emMatrix提供的化nk-PEG树脂上合成并且90Arg用DCC/HOBt而不是 HATU活化。 阳226] 在粗蛋白质片段制备之后，使用本领域普通技术人员已知的和基本上与实施例12 所述的那些相似的方法通过RP-HPLC纯化所述粗蛋白质片段。然后根据图25A和26A中的 方案连接纯化的片段W得到分别在图25F和26F中所示的全长蛋白质。按照Liu和同事做 了小改进的过程，用本领域普通技术人员已知的方法进行连接。 阳227] 实施例19 阳22引该实施例描述了基于邸TI-II膜蛋白酶抑制剂之进化的结合骨架的整联蛋白W及人膜岛素的A链和B链的合成。粗合成产物的总离子色谱图分别示于图27A-C中。使用 氨基甲基官能化的聚苯乙締代替MBHA官能化的聚苯乙締来合成所有的运些肤。使用本领 域普通技术人员已知的方法并如W下实施例20所述的方法制备氨基甲基官能化的聚苯乙 締。 阳229] 使用实施例8中所述的第二代反应器和实施例13所述的方法合成人膜岛素的A 链，不同之处在于在85°C下进行合成并且所有半脫氨酸受Acm保护。除了在85°C下进行合 成，使用实施例8所述的反应器和实施例13所述的方法合成人膜岛素的B链。使用实施例 8所述的反应器和实施例13所述的方法合成结合骨架的整联蛋白，不同之处在于所有手性 氨基酸具有反转的手性（即，右旋性（dextrorototory))。 阳230] 尽管本文中已对本发明的几个实施方案进行了描述和说明，但是本领域普通技术 人员将容易想到多种其他手段和/或结构来实现本文所述功能和/或获得本文所述结果和 /或本文所述一个或更多个优点，并且认为运些变化或修改中的每一个均在本发明的范围 内。更一般地，本领域技术人员将容易认识到，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构造均是 示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的具体应用。 阳231] 实施例20
[0232] 该实施例描述了用于制备实施例18和19中所使用的氨基甲基树脂的过程。 阳23引为了制备氨基甲基树脂，在IL圆底烧瓶中，向450血的DCM添加25g的Bio-Rad,Bio-beadsS-X1(苯乙締-二乙締苯共聚物，1%交联）和4. 9g(27. 6mmol)的N-径甲基 苯邻二甲酯亚胺。向其中添加50mL的甲横酸并且将反应在室溫下轻轻地揽拌5小时。 揽拌5小时之后，将浆料转移至粗糖的烧结玻璃漏斗中并用DCM(1500-2000mL)和乙醇 (ISOOmL)洗涂。然后将树脂在真空下干燥1小时。干燥之后，将苯邻二甲酯亚氨基甲基树 脂转移至SOOmL圆底烧瓶中并且悬浮于200mL酷阱一水合物（20%v/v)的无水乙醇溶液 中。连接回流冷凝器并且将溶液溫和回流至少8小时。为了完全地洗掉白色邻苯二甲酯 阱（Ptha化y化azide)沉淀物，将所得的凝胶状材料热转移至烧结玻璃漏斗并用沸腾乙醇 (1000血-2000血）洗涂，然后用热甲醇（1000血）洗涂。然后用DMF(800血）、DCM(800血）、 DMF中的10% (v/v)DIEA巧00血)、DMF化00血）和DCMdOOO血）洗涂树脂。然后将所述树脂 在真空下干燥并且载荷确定为1. 2mmol/g。 阳234] 本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或者将能够确定许多与本文所描述的 本发明特定实施方案等同的方案。因此，应理解，前述实施方案仅作为示例示出，并且在所 附权利要求及其等同方案的范围内，本发明可WW不同于已具体描述并要求保护的方式的 其他方式进行实践。本发明设及本文所述的每一个单独的特征、系统、制品、材料和/或方 法。此外，如果运些特征、系统、制品、材料和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个运些特 征、系统、制品、材料和/或方法的任意组合均包括在本发明的范围内。
[0235] 除非明确指示相反情况，否则本文说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰 的名词应理解为指"至少一个/种"。 阳236] 本文说明书和权利要求书中使用的短语"和/或"应理解为意指运样联合的要素 中的"任一或两者"，即在一些情况下共同存在而在另一些情况下分开存在的要素。除非明 确指示相反情况，否则除"和/或"表述具体指示的要素之外，还可任选地存在其他要素，无 论与那些具体指示的要素是否相关。因此，作为一个非限制性实例，提及"A和/或B"，当与 开放式语言例如"包含/包括"联合使用时：在一个实施方案中，可指A而无B(任选地包括 除B之外的要素）；在另一个实施方案中，可指B而无A(任选地包括不除A之外的要素）； 在又一个实施方案中，可指A和B两者（任选地包括其他要素）等。 阳237] 本文说明书和权利要求书中使用的"或"应理解为与W上定义的"和/或"具有相 同的含义。例如，当在列表中分列项目时，"或"或者"和/或"应解释为包括在内，即包括大 量要素或要素列表中的至少一个，但是也包括其中的一个W上，并任选地包括其他未列出 项目。只有明确指出相反的术语，例如"仅之一"或"正好之一"或者当在权利要求中使用 的"由......组成"，将指包括大量要素或要素列表中的正好一个要素。一般而言，当前面 有排他性术语，例如："任一"、"之一"、"仅其一"或"恰好其一"时，本文使用的术语"或"仅 应解释为指排他性替代方案（即"一个或另一个而非两者。"基本由...组成"当在权利 要求书使用中时应具有其在专利法领域中所使用的一般含义。
[0238] 本文说明书和权利要求书中在提到一个或更多个要素的列表时使用的短语"至少 一个"应理解为选自要素列表中的任何一个或更多个要素的至少一个要素，但并不一定包 括元素列表中具体列出的每个和各个要素中的至少一个要素，并且不排除要素列表中要素 的任意组合。该定义还允许除了在短语"至少一个"所指的要素列表内的具体指定的要素 之外，还可任选地存在另一些要素，无论与具体指定的那些要素是否相关。因此，作为一个 非限制性实例，"A和B中的至少一个"（或者等同地，"A或B中的至少一个"，或者等同地， "A和/或B中的至少一个"）可W是运样的：在一个实施方案中，指至少一个，任选地包括一 个W上的A，但不存在B(并且任选地包括除B之外的要素）；在另一个实施方案中，指至少 一个，任选地包括一个W上的B，但不存在A(并且任选地包括除A之外的要素）；在又一个 实施方案中，指至少一个，任选地包括一个W上的A和至少一个（任选地包括一个W上的） B(并且任选包括其他要素）等。
[0239] 在权利要求书及W上的说明书中，所有过渡性短语例如"包含"、"包括"、"携带"、 "具有"、"含有"、"涵盖"、"持有"等应理解为开放式的，即意指包括但不限于。仅过渡性短语 "由...组成"和"基本由...组成"分别应是封闭式的或半封闭式的过渡性短语，如化ited StatesPatentOfficeManualofPatentExaminingProcedures，第2111. 03 章中所述D
【主权项】
1. 用于向肽添加氨基酸残基的方法，其包括： 加热包含氨基酸的流，以使得所述氨基酸的温度提高至少约l°c ;以及 使经加热的氨基酸暴露于固定在固体支持物上的多个肽， 其中在使所述经加热的氨基酸暴露于所述肽之前且在约30秒内进行所述加热步骤。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物包含聚苯乙烯和/或聚乙二醇。3. 根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含树脂。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述固体支持物包含微孔聚苯乙烯树脂。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含在填充柱和/ 或流化床内。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在使所述经加热的氨基酸暴露于固 定肽之后，至少约99%的所述固定肽添加了氨基酸残基。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在使所述经加热的氨基酸暴露于所 述固定肽之后，少于约1 %的所述固定肽结合了所述氨基酸残基的多份拷贝。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中向所述固定肽添加氨基酸残基包括 向所述固定肽添加单个氨基酸残基。9. 根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中向所述固定肽添加氨基酸残基包括 向所述固定肽添加包含两个或更多个氨基酸残基的肽。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中使所述氨基酸的温度提高至少约 KTC011. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中使所述氨基酸的温度提高至少约 25。。。12. 用于向肽添加氨基酸残基的方法，其包括： 提供多个包含保护基团的肽，每个肽固定在固体支持物上； 进行第一氨基酸添加循环，其包括使氨基酸暴露于固定肽以使得向至少约99%的所述 固定肽添加氨基酸残基；以及 进行第二氨基酸添加循环，其包括使氨基酸暴露于所述固定肽以使得向至少约99%的 所述固定肽添加氨基酸残基； 其中： 所述第一氨基酸添加循环结束与所述第二氨基酸添加循环结束之间的总时间量为约 10分钟或更短，并且所述保护基团包括芴基甲氧羰基保护基团，和/或 所述第一氨基酸添加循环结束与所述第二氨基酸添加循环结束之间的总时间量为约5 分钟或更短。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述保护基团包括芴基甲氧羰基保护基团。14. 根据权利要求12所述的方法，其中所述保护基团包括叔丁氧羰基保护基团。15. 根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述第一氨基酸添加循环结束与 所述第二氨基酸添加循环结束之间的总时间量为约5分钟或更短。16. 根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述第一氨基酸添加循环结束与 所述第二氨基酸添加循环结束之间的总时间量为约10秒钟至约10分钟并且所述保护基团 包括芴基甲氧羰基保护基团。17. 根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中所述第一氨基酸添加循环结束与 所述第二氨基酸添加循环结束之间的总时间量为约10秒钟至约5分钟。18. 根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中在所述第一氨基酸添加循环和所 述第二氨基酸添加循环期间，在超过约5%的进行所述循环的时间段期间整个所述固体支 持物的压降不超过约700psi。19. 根据权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含在填充柱和 /或流化床内。20. 根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含聚苯乙烯和 /或聚乙二醇。21. 根据权利要求12至20中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含树脂。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述固体支持物包含微孔聚苯乙烯树脂。23. 根据权利要求12至22中任一项所述的方法，其包括：在使所述氨基酸暴露于所述 固体支持物之前约30秒内，合并包含氨基酸的第一流体流与包含氨基酸活化剂的第二流 以形成包含活化氨基酸的混合流体。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述氨基酸活化剂包括碱性液体、碳二亚胺和/ 或脲鑰活化剂。25. 根据权利要求12至24中任一项所述的方法，其中在所述第一氨基酸添加循环期 间，少于约1 %的固定肽结合了所述氨基酸残基的多份拷贝。26. 根据权利要求12至25中任一项所述的方法，其中在所述第二氨基酸添加循环期 间，少于约1 %的固定肽结合了所述氨基酸残基的多份拷贝。27. 根据权利要求12至26中任一项所述的方法，其中向所述固定肽添加氨基酸残基包 括向所述固定肽添加单个氨基酸残基。28. 根据权利要求12至27中任一项所述的方法，其中向所述固定肽添加氨基酸残基包 括向所述固定肽添加包含两个或更多个氨基酸残基的肽。29. 根据权利要求12至28中任一项所述的方法，其包括加热包含氨基酸的流以使得所 述氨基酸的温度提高至少约1°C，其中在使经加热的氨基酸暴露于所述固定肽之前且在约 30秒内进行所述加热步骤。30. 用于向肽添加氨基酸残基的方法，其包括： 提供固定在固体支持物上的多个肽；以及 使活化氨基酸暴露于所述固定肽，以使得至少一部分的所述活化氨基酸与所述固定肽 结合以形成新结合的氨基酸残基； 其中至少约99%的所述固定肽在约1分钟或更短的时间内添加了氨基酸残基。31. 根据权利要求30所述的方法，其中在暴露步骤期间，在超过约5%的进行所述暴露 步骤的时间段期间整个所述固体支持物的压降不超过约700psi。32. 根据权利要求30至31中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含在填充柱和 /或流化床内。33. 根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其包括加热氨基酸以使得所述氨基酸 的温度提高至少约1°C，其中在使所述氨基酸暴露于所述固定肽之前且在30秒内进行所述 加热步骤。34. 根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含聚苯乙烯和 /或聚乙二醇。35. 根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含树脂。36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述固体支持物包含微孔聚苯乙烯树脂。37. 根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其包括：在使所述氨基酸暴露于所述 固体支持物之前约30秒内，合并包含氨基酸的第一流体流与包含氨基酸活化剂的第二流 以形成包含活化氨基酸的混合流体。38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述氨基酸活化剂包括碱性液体、碳二亚胺和/ 或脲鑰活化剂。39. 根据权利要求30至38中任一项所述的方法，其中在所述暴露步骤期间，少于约 1 %的所述固定肽结合了所述氨基酸残基的多份拷贝。40. 根据权利要求30至39中任一项所述的方法，其中向所述固定肽添加氨基酸残基包 括向所述固定肽添加单个氨基酸残基。41. 根据权利要求30至40中任一项所述的方法，其中向所述固定肽添加氨基酸残基包 括向所述固定肽添加包含两个或更多个氨基酸残基的肽。42. 根据权利要求30至41中任一项所述的方法，其中至少约99. 9%的所述固定肽在 约1分钟或更短的时间内添加了氨基酸残基。43. 根据权利要求30至42中任一项所述的方法，其中至少约99%的所述固定肽在约 30秒或更短的时间内添加了氨基酸残基。44. 根据权利要求30至43中任一项所述的方法，其包括加热包含氨基酸的流以使得所 述氨基酸的温度提高至少约1°C，其中在使经加热的氨基酸暴露于所述固定肽之前且在约 30秒内进行所述加热步骤。45. 用于向肽添加氨基酸残基的方法，其包括： 使包含氨基酸的第一流流动； 使包含氨基酸活化剂的第二流流动； 合并所述第一流和所述第二流以形成包含活化氨基酸的混合流体；以及 在合并所述第一流和所述第二流以形成所述混合流体之后约30秒内，使所述混合流 体暴露于固定在固体支持物上的多个肽。46. 根据权利要求45所述的方法，其中所述氨基酸活化剂包括碱性液体、碳二亚胺和/ 或脲鑰活化剂。47. 根据权利要求45至46中任一项所述的方法，其包括加热氨基酸以使得所述氨基酸 的温度提高至少约1°C，其中在使所述氨基酸暴露于固定肽之前且在约30秒内进行所述加 热步骤。48. 根据权利要求47所述的方法，其中在合并步骤之前进行所述加热步骤。49. 根据权利要求47至48中任一项所述的方法，其中在所述合并步骤期间进行所述加 热步骤。50. 根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中在所述合并步骤之后进行所述加 热步骤。51. 根据权利要求45至50中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含聚苯乙烯和 /或聚乙二醇。52. 根据权利要求45至51中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含树脂。53. 根据权利要求52所述的方法，其中所述固体支持物包含微孔聚苯乙烯树脂。54. 根据权利要求45至53中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含在填充柱和 /或流化床内。55. 根据权利要求45至54中任一项所述的方法，其中在使所述混合流体暴露于所述固 定肽之后，至少约99%的所述固定肽添加了氨基酸残基。56. 根据权利要求45至55中任一项所述的方法，其中在使所述混合流体暴露于所述固 定肽之后，少于约1 %的所述固定肽结合了所述氨基酸残基的多份拷贝。57. 根据权利要求55至56中任一项所述的方法，其中向所述固定肽添加氨基酸残基包 括向所述固定肽添加单个氨基酸残基。58. 根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其中向所述固定肽添加氨基酸残基包 括向所述固定肽添加包含两个或更多个氨基酸残基的肽。59. 根据权利要求45至58中任一项所述的方法，其包括加热包含氨基酸的所述第一流 以使得所述氨基酸的温度提高至少约1°C，其中在使经加热的氨基酸暴露于所述多个固定 肽之前且在约30秒内进行所述加热步骤。60. 用于向肽添加氨基酸残基的方法，其包括： 提供多个包含保护基团的肽，每个肽固定在固体支持物上； 使去保护试剂暴露于固定肽以从至少一部分的所述固定肽中除去保护基团； 除去至少一部分的所述去保护试剂； 使活化氨基酸暴露于所述固定肽以使得至少一部分的所述活化氨基酸与所述固定肽 结合以形成新结合的氨基酸残基；以及 除去至少一部分不与所述固定肽结合的活化氨基酸； 其中在氨基酸暴露步骤期间至少约99%的所述固定肽添加了氨基酸残基；并且 其中： 进行所有的去保护试剂暴露步骤、去保护试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化 氨基酸除去步骤的组合所花费的总时间量为约10分钟或更短，并且所述保护基团包括芴 基甲氧羰基保护基团，和/或 进行所有的去保护试剂暴露步骤、去保护试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化 氨基酸除去步骤的组合所花费的总时间量为约5分钟或更短。61. 根据权利要求60所述的方法，其中所述保护基团包括芴基甲氧羰基保护基团。62. 根据权利要求60所述的方法，其中所述保护基团包括叔丁氧羰基保护基团。63. 根据权利要求60至62中任一项所述的方法，其中进行所有的去保护试剂暴露步 骤、去保护试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化氨基酸除去步骤的组合所花费的总 时间量为约10秒至约10分钟，并且所述保护基团包括芴基甲氧羰基保护基团。64. 根据权利要求60至63中任一项所述的方法，其中进行所有的去保护试剂暴露步 骤、去保护试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化氨基酸除去步骤的组合所花费的总 时间量为约5分钟或更短。65. 根据权利要求60至64中任一项所述的方法，其中进行所有的去保护试剂暴露步 骤、去保护试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化氨基酸除去步骤的组合所花费的总 时间量为约10秒至约5分钟。66. 根据权利要求60至65中任一项所述的方法，其中在去保护试剂暴露步骤、去保护 试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化氨基酸除去步骤的每个步骤期间，在超过约5% 的进行所述步骤的时间段期间整个所述固体支持物的压降不超过约700psi。67. 根据权利要求60至66中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含在填充柱和 /或流化床内。68. 根据权利要求60至67中任一项所述的方法，其包括加热氨基酸以使得所述氨基酸 的温度提高至少约1°C，其中在使所述氨基酸暴露于所述固定肽之前且在约30秒内进行所 述加热步骤。69. 根据权利要求60至68中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含聚苯乙烯和 /或聚乙二醇。70. 根据权利要求60至69中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包含树脂。71. 根据权利要求70所述的方法，其中所述固体支持物包含微孔聚苯乙烯树脂、微孔 聚乙二醇树脂和/或微孔共聚物树脂。72. 根据权利要求60至71中任一项所述的方法，其包括：在使所述氨基酸暴露于所述 固体支持物之前约30秒内，合并包含所述氨基酸的第一流体流与包含氨基酸活化剂的第 二流以形成包含活化氨基酸的混合流体。73. 根据权利要求72所述的方法，其中所述氨基酸活化剂包括碱性液体、碳二亚胺和/ 或脲鑰活化剂。74. 根据权利要求60至73中任一项所述的方法，其中在所述氨基酸暴露步骤期间，少 于约1 %的所述固定肽结合了所述氨基酸残基的多份拷贝。75. 根据权利要求60至74中任一项所述的方法，其中向所述固定肽添加氨基酸残基包 括向所述固定肽添加单个氨基酸残基。76. 根据权利要求60至75中任一项所述的方法，其中向所述固定肽添加氨基酸残基包 括向所述固定肽添加包含两个或更多个氨基酸残基的肽。77. 根据权利要求60至76中任一项所述的方法，其包括加热包含氨基酸的第一流以使 得所述氨基酸的温度提高至少约1°C，其中在使经加热的氨基酸暴露于多个所述固定肽之 前且在约30秒内进行所述加热步骤。
【专利摘要】一般性描述了用于进行固相肽合成的系统和方法。固相肽合成是其中向已固定在固体支持物上的肽添加氨基酸残基的已知方法。在某些实施方案中，本发明的系统和方法可用于快速地进行固相肽合成同时保持高产率。某些实施方案涉及可用于以减少进行固相肽合成所需的时间量的方式来加热、运输和/或混合试剂的方法和系统。
【IPC分类】C07K1/04
【公开号】CN105164145
【申请号】CN201480022269
【发明人】马克·大卫·西蒙, 布雷德利·L·彭泰卢特, 安德烈亚·阿达莫, 帕特里克·路易斯·海德尔, 克拉夫斯·F·詹森
【申请人】麻省理工学院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2014年2月24日
【公告号】CA2904355A1, US9169287, US20140275481, WO2014149387A2, WO2014149387A3, WO2014149387A8