上100 %的固定肤添加氨基酸残基。在某些实施方案中，本发明的方法和 系统的使用可W允许向固定肤添加一个W上氨基酸相对快速地（包括在上文或本文其他 地方所公开的任何时间范围内）发生，同时保持了高的反应产率。
[0056] 在某些实施方案中，可W进行一个或更多个氨基酸添加步骤，而很少有或没有双 渗入（即，在单个添加步骤期间添加所需氨基酸（例如，单个氨基酸残基或肤）的多份拷 贝）。例如，在某些实施方案中，在第一（和/或第二、第=、第四、第五和/或随后的）氨 基酸添加步骤期间，少于约1% (或少于约0. 1 %、少于约0.01%、少于约0.001 %、少于约 0.OOOl%、少于约0.OOOOl%或基本上没有）的固定肤结合了所需氨基酸的多份拷贝。
[0057] 在一些实施方案中，可进行多个氨基酸添加循环。进行多个氨基酸添加循环可导 致向肤添加一个W上的单氨基酸残基（或一个W上的肤，和/或至少一个单氨基酸残基和 至少一个肤）。在某些实施方案中，向固定肤添加一个W上氨基酸的方法可包括进行第一 氨基酸添加循环W添加第一氨基酸和进行第二氨基酸添加循环W添加第二氨基酸。在某些 实施方案中，可进行第=、第四、第五和随后的氨基酸添加循环W产生任何期望长度的固定 肤。在一些实施方案中，进行至少约10个氨基酸添加循环、至少约50个氨基酸添加循环或 至少约100个氨基酸添加循环，从而导致向固定肤添加至少约10个氨基酸残基、至少约50 个氨基酸残基或至少约100个氨基酸残基。在某些运样的实施方案中，可WW高产率（例 如，至少约99%、至少约99. 9%、至少约99. 99%或基本上100% )进行相对高百分比的氨 基酸添加循环（例如，至少约50%、至少约75%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的 此类氨基酸添加循环）。在一些运样的实施方案中，可W在例如，上文或本文其他地方所指 定的任何时间范围内，快速地进行相对较高百分比的氨基酸添加循环（例如，至少约50%、 至少约75%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的此类氨基酸添加循环）。在一些运 样的实施方案中，可W在有限的或没有双渗入的情况下，例如，在上文或本文其他地方所指 定的任何双渗入范围内，进行相对高百分比的氨基酸添加循环（例如，至少约50%、至少约 75%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的此类氨基酸添加循环）。
[0058] 在其中具有一个W上添加循环的实施方案中，一个氨基酸添加循环结束与随后的 氨基酸添加循环之间经过的总时间量可W相对短。例如，在其中使用巧基甲氧幾基保护基 团的某些实施方案中，第一氨基酸添加循环结束和第二氨基酸添加循环结束之间的总时间 量为约10分钟或更短、约9分钟或更短、约8分钟或更短、约7分钟或更短、约6分钟或更 短、约5分钟或更短、约4分钟或更短、约3分钟或更短、约2分钟或更短、约1分钟或更短、 约10秒至约10分钟、约10秒至约9分钟、约10秒至约8分钟、约10秒至约7分钟、约10 秒至约6分钟、约10秒至约5分钟、约10秒至约4分钟、约10秒至约3分钟、约10秒至约 2分钟或约10秒至约1分钟。在其中使用包括巧基甲氧幾基、叔下氧幾基和/或任何其他 合适的保护基团之保护基团的某些实施方案中，氨基酸添加循环结束与随后的氨基酸添加 循环之间的总时间量可为约5分钟或更短、约4分钟或更短、约3分钟或更短、约2分钟或 更短、约1分钟或更短、约10秒至约5分钟、约10秒至约4分钟、约10秒至约3分钟、约10 秒至约2分钟或约10秒至约1分钟。
[0059] 如上所述，某些方面设及使一个或更多个添加循环所需的总时间比之前的固相肤 合成方法显著减少的方法和系统。自从连续固相肤合成在30年前出现W来，持续不断的努 力集中在改进其效用和适用性上。虽然运些改进都促进了自动化固相肤合成仪的商业成 功，但是减少合成时间仍然是一个重大的障碍。该领域30多年的研究和开发已无法产生快 速的合成技术。使用Fmoc或Boc保护基团的典型连续固相肤合成添加单个氨基酸需要30 至90分钟。在本发明的上下文中，已经发现了解决减少合成时间的长期需求的某些方法和 技术。例如，可通过采用混合、加热和/或控制压降的专口技术来达到快速的合成时间。
[0060] 在氨基酸添加循环中的某些步骤可能需要使试剂混合。在一些常规的系统中，在 暴露于固定肤之前很长时间混合试剂，运可能会导致在暴露于固定肤之前的不期望的副反 应和/或试剂降解。在一些情况下，副反应和/或降解会对氨基酸添加循环中的一个或更 多个步骤（例如，氨基酸暴露步骤）的产率和动力学产生不良的影响。在一些常规的系统 中，在固定肤存在下混合试剂，运可导致例如较慢的反应动力学。用于实现迅速肤合成的一 种技术可设及在到达固定肤之前但在很短的时间量内合并试剂流，如图1中所示。
[0061] 在一些实施方案中，用于向肤添加氨基酸残基的方法包括使包含氨基酸的第一流 流动，使包含氨基酸活化剂（例如，碱性液体、碳二亚胺和/或脈鐵活化剂）的第二流流动。 例如，再参考图1，试剂储存器25可容纳氨基酸。在一些运样的实施方案中，试剂储存器26 可容纳氨基酸活化剂。可合并第一流和第二流W形成包含活化氨基酸的混合流体。例如， 参考图1，来自储存器25的氨基酸可流入第一流30,而氨基酸活化剂可流入第二流32。可 混合第一流30和第二流32,例如，在流40的点34处。由于通过氨基酸活化剂而使氨基酸 活化，因此混合流体可包含活化氨基酸。
[0062] 在某些实施方案中，在活化氨基酸之后，在相对短的时间段内可使固定肤暴露于 混合流体。例如，在某些实施方案中，在合并第一流和第二流W形成混合流体之后约30秒 内（或约15秒内、约10秒内、约5秒内、约3秒内、约2秒内、约1秒内、约0. 1秒内或约 0.Ol秒内）可使固定在固体支持物上的多个肤暴露于混合流体。
[0063] 在某些实施方案中，合并试剂流可用于如本文所述的氨基酸添加循环中。例如，在 使活化氨基酸暴露于固定在固体支持物上的肤之前约30秒内，可合并包含氨基酸的第一 流体流和包含氨基酸活化剂的第二流W形成包含活化氨基酸的混合流体。在其中进行一个W上氨基酸添加循环的一些实施方案中，一个或更多个氨基酸添加循环（例如，第一氨基 酸添加循环和第二氨基酸添加循环）可包括在使氨基酸暴露于固体支持物之前约30秒内 合并包含氨基酸的第一流体流和包含氨基酸活化剂的第二流W形成包含活化氨基酸的混 合流体。应当理解的是，合并试剂流可与添加循环中的任何合适步骤结合使用并且可与氨 基酸添加循环中的一个或更多个步骤结合使用。
[0064] 一般而言，可使用本领域技术人员已知的任何合适的技术来合并流。在一些实施 方案中，可通过基本上同时使第一流和第二流流入单股流中来合并流（例如，通过合并所 述流在其中流动的通道）。也可使用其他的合并方法。
[0065] 用于实现快速的合成时间的另一种技术可能设及在到达反应器之前但在短时期 段内加热流。将经加热的流供给反应器可改变反应器中发生的过程的动力学。例如，使固 定肤、固体支持物或其他合成组件暴露于经加热的流可改变氨基酸添加过程的反应动力学 和/或扩散动力学。例如，使肤暴露于包含活化氨基酸的经加热的流可提高向肤添加氨基 酸的速率。在一些实施方案中，在到达反应器之前，但在短时间段内加热流可明显减少或消 除向反应器提供辅助热（即，不是来自一个或更多个预加热的流的热）的需要。在一些情 况下，大部分或基本上所有的供给反应器的热都源于预加热的流。例如，在一些实施方案 中，源于预加热的流之用于加热反应器的热能的百分比可大于或等于约50%、大于或等于 约60%、大于或等于约70%、大于或等于约80%、大于或等于约90%、大于或等于约95% 或者大于或等于约99%。在一些运样的实施方案中，W运种方式加热系统可减少加热反应 器、固定肤、固体支持物、活化氨基酸、去保护试剂、洗涂流体和/或其他合成组分至期望反 应溫度的所需时间。
[0066] 因此，在一些实施方案中，用于将氨基酸残基添加至肤的方法可包括加热包含活 化氨基酸的流W使得在使经加热的氨基酸暴露于固定肤之前，使所述活化氨基酸的溫度提 高至少约TC(或至少约2°C、至少约5°C、至少约10°C、至少约25°C、至少约50°C，和/或小 于或等于约450°C、小于或等于约300°C、少于或等于约200°C、小于或等于约100°C和/或 小于或等于约75°C)。在某些实施方案中，在使流内容物暴露于固定肤之前，可将包含任何 其他组分（例如，洗涂剂、去保护试剂或任何其他组分）的流加热W使得所述流内容物的溫 度提高至少约rC(或至少约2°C、至少约5°C、至少约10°C、至少约25°C、至少约50°C，和/ 或小于或等于约450°C、小于或等于约300°C、小于或等于约200°C、小于或等于约100°C和 /或小于或等于约75°C)。在一些情况下，可在使流内容物（例如，经加热的活化氨基酸） 暴露于固定肤约30秒内（或约15秒内、约10秒内、约5秒内、约3秒内、约2秒内、约1秒 内、约0. 1秒内或约0.Ol秒内）进行加热步骤（例如，加热活化氨基酸和/或加热在流内 被运输到固定肤的任何其他组分）。在一些运样的实施方案中，并且如图1中示例性的实施 方案所示，可通过加热固定肤的上游位置来实现运样的加热。在一些运样的实施方案中，在 使氨基酸暴露于固定肤之前至少约0.Ol秒、至少约0. 05秒、至少约0. 1秒、至少约0. 5秒、 至少约1秒、至少约5秒或至少约10秒开始加热氨基酸。在某些实施方案中，在使氨基酸 暴露于固定肤之前至少约0. 1秒、至少约1秒、至少约5秒或至少约10秒加热氨基酸至少 约TC(或至少约2°C、至少约5°C、至少约10°C、至少约25°C、至少约50°C，和/或小于或 等于约450°C、小于或等于约300°C、小于或等于约200°C、小于或等于约100°C和/或小于 或等于约75°C)。
[0067] 再参考图I，例如，系统5可包括加热区42,在其中可加热流40的内容物。加热区 42可包含加热器。一般而言，任何适合的加热方法都可用来提高流的溫度。本文描述的某 些系统和方法的一个优点是使用简单和/或廉价的加热方法和/或仪器的能力。例如，加 热区42可包含液浴（例如，水浴）、电阻加热器、基于气体对流的加热元件或任何其他合适 的加热器。在一些实施方案中，用于加热入口流（和/或反应器）的相对低百分比的热能 可源于电磁福射（例如，微波福射）。例如，在一些实施方案中，源于电磁福射的用于加热入 口流和/或反应器的热能百分比可W小于或等于约20%、小于或等于约15%、小于或等于 约10%、小于或等于约5%、小于或等于约1%或者小于或等于约0. 5%。在一些实施方案 中，可W不使用电磁福射而加热入口流和/或反应器。在某些实施方案中，源于微波福射的 用于加热入口流和/或反应器的热能百分比可W小于或等于约20%、小于或等于约15%、 小于或等于约10%、小于或等于约5%、小于或等于约1%或者小于或等于约0. 5%。在一 些实施方案中，可W不使用微波福射而加热入口流和/或反应器。在一些情况下，加热机构 可W在固定肤的短距离内，例如，约5米内、约1米内、约50cm内或约IOcm内。
[0068] 在一些实施方案中，包括图1中所示的那些，可在使氨基酸与固定肤接触之前和 相对短的时间内进行加热氨基酸W及合并氨基酸和氨基酸活化剂（例如，碱性液体、碳二 亚胺和/或脈鐵活化剂）二者。可在合并包含氨基酸的流与包含氨基酸活化剂的流之前、 期间和/或之后进行氨基酸加热。
[0069] 在某些实施方案中，刚好在使流暴露于固定肤之前加热流（与之相反，在将流内 容物运输到固定肤之前很长时间加热流）可W最小化所述流中一种或更多种试剂（例如， 将要被添加至肤的氨基酸和/或去保护试剂）的热降解。当然，如上面所讨论的，在流成分 到达之前加热流可提高进行反应或洗涂步骤的速度。
[0070] 在一些实施方案中，如本文所述，可在氨基酸添加循环中使用加热步骤。例如，可 在使活化氨基酸暴露于固定肤之前且在约30秒内（或在其他地方提及的任何其他时间范 围内）进行所述活化氨基酸加热W使得所述活化氨基酸的溫度提高至少约rc。应当理 解的是，可在氨基酸添加循环的任何步骤（例如，去保护试剂暴露步骤、去保护试剂除去步 骤、活化氨基酸暴露步骤、活化氨基酸除去步骤）之前且在30秒内使用加热步骤。在一些 实施方案中，氨基酸添加循环可包括一个W上的加热步骤。例如，可在去保护试剂暴露步骤 和活化氨基酸暴露步骤之前进行加热步骤。 阳071]在其中进行一个W上氨基酸添加循环的某些实施方案中，在一个或更多个氨基酸 添加循环（例如，第一氨基酸添加循环和第二氨基酸添加循环）可包括在进行步骤（例如 去保护试剂暴露步骤、去保护试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤、活化氨基酸除去步骤） 之前且在约30秒内（或在其他地方提及的任何其他时间范围内）的一个或更多个加热步 骤。例如，一个或更多个氨基酸添加循环（例如，第一氨基酸添加循环和第二氨基酸添加循 环）可包括在使活化氨基酸暴露于固定肤之前且在约30秒内（或在其他地方提及的任何 其他时间范围内）加热活化氨基酸。一般而言，加热步骤可与添加循环中的任何合适的步 骤结合使用，并且可与任何单独添加循环中的一个或更多个步骤或与一系列添加循环中的 所有步骤结合使用。
[0072]如上所述，在一些实施方案中，加热流可将流内容物的溫度提高（例如，可提高流 内氨基酸的溫度）至少约rc、至少约2°C、至少约5°C、至少约10°C、至少约25°C或至少约50°C。应当理解的是，对于不同的添加循环步骤和/或添加循环，加热后流的溫度可W相 同或不同。在一些情况下，对于一个或更多个添加循环步骤和/或添加循环，加热后流的 溫度可W相同。在一些情况下，加热流可使流的内容物的溫度提高（例如，可提高流内氨基 酸的溫度）小于或等于约450°C、小于或等于约300°C、小于或等于约200°C、小于或等于约 ioo°c或者小于或等于约75°c。上面提及的范围的组合也是可能的（例如，至少约rc且小 于或等于约l〇〇°C、至少约TC且小于或等于约450°C等）。
[0073] 根据某些实施方案，可使用用于降低整个固定肤之压降的方法和系统来改善肤合 成的速度。在一些实施方案中，整个固定肤的试剂的流量可影响肤合成的速度。例如，氨基 酸添加循环中的一个或更多个步骤（例如，去保护试剂暴露步骤、去保护试剂除去步骤、活 化氨基酸暴露步骤、活化氨基酸除去步骤）所需的时间可随着流量增加而减少。一般而言， 使用高流量确保了靠近固定肤的试剂浓度没有像在采用低流量时可观察到的那么严重的 损耗。在许多传统的连续固相肤合成系统中，流量受到整个反应器的压降的限制。压降可 能由于在合成期间固体支持物的膨胀和/或由于工艺设备的不合适尺寸而发生。在某些实 施方案中，在氨基酸添加循环期间，在超过约5% (或超过约1%)的进行该循环的时间段 期间整个固体支持物的压降不超过7(K)psi。例如，在某些实施方案中，在进行氨基酸添加循 环的每个步骤（去保护试剂暴露步骤、去保护试剂除去步骤、活化氨基酸暴露步骤和活化 氨基酸除去步骤）期间，在超过约5% (或超过约1% )的进行该步骤的时间段期间整个固 体支持物的压降不超过约7(K)psi。在其中进行一个W上添加循环的实施方案中，在一个或 更多个添加循环（例如，第一氨基酸添加循环和第二氨基酸添加循环）期间，在超过约5% (或超过约1% )的进行该循环的时间段期间，压降可不超过约7(K)psi。 阳074] 在一些实施方案中，在一个氨基酸添加循环的每个步骤期间和/或在一个或更多 个添加循环期间，在超过约5% (或超过约1% )的进行该步骤的时间段期间，整个反应器 的压降不超过约70化si、约60化si、约50化si、约40化si、约25化si、约10化si或约50psi。 [00巧]在某些实施方案中，可通过用具有期望纵横比的加工容器（例如，填充柱的柱）来 降低整个反应器的压降。一般而言，加工容器的纵横比是容器长度（基本上平行于通过该 容器的流的方向）与容器最短宽度（垂直于容器的长度测量）的比。例如，在圆筒形容器 的情况下，纵横比将是圆筒高度与圆筒截面直径的比。再参考图1，例如，反应器10的纵横 比将是尺寸A长度与尺寸B长度的比（即，A:B)。在一些实施方案中，反应器的纵横比可 W小于或等于约20 : 1、小于或等于约10 : 1、小于或等于约5 : 1、小于或等于约3 : 1、 小于或等于约2 : 1、小于或等于约1 : 1、小于或等于约0.5 : 1、小于或等于约0.2 : 1 或者小于或等于约0.1 : 1(和/或在某些实施方案中，低至0.01 : 1或更低）。
[0076]在一些实施方案中，通过使用本文所描述的一种或更多种技术，可W实现具有高 产率和/或有限的双渗入和/或没有双渗入的相对短的添加循环。例如，本文所描述的某 些系统和方法可允许在约1分钟或更短的时间内（例如，约30秒或更短、约15秒或更短、 约10秒或更短、约7秒或更短或者约5秒或更短，和/或在某些实施方案中，在低至1秒内 或更短）进行氨基酸暴露步骤（即，使活化氨基酸暴露于固定肤的步骤）（例如，同时实现 了本文所描述的高产率和/或避免任何程度的双渗入）。在一些情况下，本文所描述的某 些系统和方法可允许在约2分钟或更短的时间内（例如，约1. 5分钟或更短、约1分钟或更 短、约45秒或更短、约30秒或更短、约15秒或更短、约10秒或更短、约5秒或更短，和/或 在某些实施方案中，在低至1秒内或更短）进行去保护试剂除去步骤和/或活化氨基酸除 去步骤。在某些实施方案中，本文所描述的某些系统和方法可允许在约20秒或更短的时间 内（例如，约15秒或更短、约10秒或更短、约8秒或更短、约5秒或更短、约1秒或更短，和 /或在某些实施方案中，在低至0. 5秒内或更短）进行去保护试剂暴露步骤（即，使固定肤 暴露于去保护试剂的步骤）。
[0077] 在某些情况下，用于肤合成所需的时间可能受保护基团的选择的影响。例如，通常 理解使用Fmoc保护基团需要更长的合成循环时间。然而，本文所描述的系统和方法可用于 即使采用Fmoc保护基团化学品时也进行快速的氨基酸添加。在一些实施方案中，不管正在 使用的保护基团的类型如何，氨基酸添加循环的总时间可能低。
[0078] 一般而言，可使用本领域普通技术人员已知的任何保护基团。保护基团（例如， N-末端保护基团）的非限制性实例包括巧基甲氧幾基、叔下氧幾基、締丙氧幾基（alloc)、 簇基苄基和光不稳定保护基团。在某些实施方案中，固定肤包含巧基甲氧幾基保护基团。在 一些实施方案中，固定肤包含叔下氧幾基保护基团。
[0079]如其他地方所述，在使氨基酸暴露于固定肤之前，可使用氨基酸活化剂来活化氨 基酸或完成氨基酸的活化。可使用任何合适的氨基酸活化剂。在某些实施方案中，氨基酸 活化剂包括碱性液体。在一些实施方案中，氨基酸活化剂包括碳二亚胺，例如N，N'-二环 己基碳二亚胺值CC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺巧DC)等。在某些实施方 案中，氨基酸活化剂包括脈鐵活化剂，例如0-(苯并立挫-1-基）-N，N，N'，N'-四甲基脈 鐵六氣憐酸盐（皿TU)、2-(7-氮杂-IH-苯并S挫-1-基）-1，1，3，3-四甲基脈鐵六氣憐酸 盐（HATU)、1-[(1-(氯基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基）二甲基氨基吗嘟代）]脈鐵 六氣憐酸盐（COMU);等等。
[0080] 如其他地方所述，肤可固定在固体支持物上。一般而言，可在本文所描述的任何添 加循环中使用任何固体支持物。固体支持物材料的非限制性实例包括聚苯乙締（例如，W 树脂的形式，例如微孔聚苯乙締树脂、中孔聚苯乙締树脂、大孔聚苯乙締树脂）、玻璃、多糖 (例如，纤维素、琼脂糖）、聚丙締酷胺树脂、聚乙二醇或共聚物树脂（例如，包含聚乙二醇、 聚苯乙締等）。 阳081] 固体支持物可具有任何合适的形状（formfactor)。例如，固体支持物可W是珠、 颗粒、纤维或W任何其他合适的形状的形式。
[0082] 在一些实施方案中，固体支持物可W是多孔的。例如，在一些实施方案中，可将大 孔材料（例如，大孔聚苯乙締树脂）、中孔材料和/或微孔材料（例如，微孔聚苯乙締树脂） 用作固体支持物。当设及肤合成的固体支持物使用时，术语"大孔"、"中孔"和"微孔"是本 领域普通技术人员已知的并且与W与其在国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC)化学术语 概略，2. 3. 2版，2012年8月19日（非正式地称为"金色书"）中的描述相一致的方式在本 文中使用。通常，微孔材料包括具有截面直径小于约2纳米之孔的那些材料。中孔材料包 括具有截面直径约2纳米至约50纳米之孔的那些材料。大孔材料包括具有截面直径大于 约50纳米且大到1微米之孔的那些材料。
[0083] 本文描述的发明系统和方法的一个优点是它们可与标准固体支持物材料使用而 不降低性能。例如，在某些实施方案中，可使用标准的商业聚苯乙締树脂支持物。在许多 之前的系统中，当用于基于流动的固相肤合成系统中时，运种支持物巧塌，从而引起压降增 加。在合成期间，随着树脂膨胀，支持物变得越来越有可能巧塌，运导致整个树脂的压降增 加，从而需要提高施加的压力W保持恒定的流量。增加施加的压力可导致树脂更严重的塌 陷，从而导致其中施加到流体的压力必须反复增加的正反馈效应。在足够高的压力下，可通 过任何玻璃料或用于限制其的其他系统挤出树脂。本文所描述的系统和方法可用于管理压 降W使得树脂（包括标准的聚苯乙締树脂和其他标准树脂）在合成期间不会巧塌或仅巧塌 至不引起上述正反馈效应的程度，从而导致更稳定且可控的系统。在某些实施方案中，固体 支持物包含在填充柱内。
[0084] 一般而言，可使用本文描述的方法和系统合成任何肤和/或蛋白质。可使用本文 描述的方法和/或系统合成的肤和/或蛋白质的非限制性实例包括膜高血糖素样肤（例 如，GLP-1)、艾塞那肤、利拉鲁肤、GLP-I类似物（例如，ZPlO)、普兰林肤、肤YY(Peptide YY)、膜高血糖素、替度鲁肤、地米肤值elmitide)、降巧素（例如，娃鱼降巧素）、甲状旁腺 激素、棚替佐米、西仑吉肤、亮丙瑞林、组氨瑞林、戈舍瑞林、Stimuvax、Primovax、奈西立肤、 依替己肤、比伐卢定、艾替班特、