专利名称：茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及氨基残余物的定量检测，尤其适应新固相多肽合成中，经茚三酮试剂处置，测得吸光值，制得标准曲线，用于判定未知树脂肽中的残余氨基含量的方法。
背景技术：
在固相法合成多肽的过程中，游离的氨基数量是合成完成度的一种直接体现，但是现在没有一个准确的方法可以得到残余氨基的具体数量，以验证其结果的可信度与准确性；因此制作标准样品与标准曲线用于对未知树脂肽中游离的氨基进行定量分析，有着重要的实践价值。
常规茚三酮检测法用于固相多肽合成中的-NH2残基定量的检测，一般均采用将反应后树脂的吸光值代入公式，通过计算来确定合成率，此结果易受反应时间、加热温度、加热时间等因素影响，而且由于存在试剂配制的批次差异，从而使结果会有较大的浮动，而且由于合成的不断进行，氨基酸的增加，也会使得树脂肽重量发生变化，使得结果判定上的准确度大打折扣，为了避免上述情况的出现，该项目对茚三酮反应试剂进行了改进，可以在短时间内得出一个稳定的结果，并使用脱去保护基后的合成用树脂作为标准品，建立一条标准曲线，使所有的反应均在同一条件下进行，从而保证了结果的可信度，可以更可靠的对游离氨基进行定量。文献检索披露常规茚三酮检测法多是通过颜色的变化来对缩合完成度进行判定；该方法使用2种试剂，试剂A :取O. 66mg/ml氰化钾水溶液2ml加入到98ml吡啶溶液中，再加入4g/ml苯酹乙醇溶液IOml,混勻；试剂B :称取500mg却三酮溶于IOml无水乙醇中；进行合成完成度检测时，取缩合反应完成后的树脂肽3mg，使用无水乙醇清洗3次，真空干燥后，加入试剂A O. 15ml，试剂B O. 05ml, 100°C加热10分钟，看颜色变化来判定缩合完成度，颜色如果为蓝色或绿色就判定为缩合不完全，显黄色判定为缩合完全。本发明构思是改进的固相多肽合成中的残余氨基定量分析方法，用合成的树脂作为标准品，制作标准曲线，对合成率进行一个判断，其解决的主要问题，一是合成树脂标准的建立；二是对游离氨基定量检测范围的确定；三是吸光值的稳定性的确定；四是反应液改进后不加氰化钾，减少反应液配制的危险性，该定量方法有重要的应用推广价值。
发明内容
本发明的目的在于改进的固相多肽合成中的残余氨基定量分析方法，依据标准品树脂的吸光值制作标准曲线，可以得到未知树脂肽样品中的残余氨基含量，实现了准确定量。本发明的目的是这样实现的茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进，用与合成反应相同的Rink_Amide_MBHA树脂作为标准样品，制作标准曲线，对未知的样品进行残余氨基定量检测，其步骤如下其I样品处理
称取Rink_Amide_MBHA树脂2g,计算树脂摩尔数A ;用带Fmoc保护基的氨基酸，每种氨基酸取2A摩尔；将IA摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反应2小时，得到树脂肽；再经25%哌啶溶液26ml，处理30分钟，得到去除保护基后的树脂肽，备用；其中25%哌啶溶液的配制25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀得；其中树脂摩尔数的计算公式
A=M/SD式中A为Rink_Amide_MBHA树脂的摩尔数；m 为 Rink_Amide_MBHA 树脂的克数；SD 为 Rink_Amide_MBHA 树脂取代量值；其2检测步骤I)将取去除保护基后的树脂肽15mg，使用无水甲醇溶液20ml对其清洗3次，经真空干燥机处置，其温度45°C，真空度93. 3 98. 6KPa ;干燥结束，称取I. Omg, I. 5mg, 2. Omg,
2.5mg，3. Omg ;分别加入 300ul Buffer A :和 75ul Buffer B，混和均匀，用 100°C水浴加热15min,并置于15-20°C水中冷却至室温；取25ul的反应后的混合液加入到I. Oml的60%乙醇溶液中，混和均匀后，在0D570下进行吸光值读取，并制作标准曲线；2)称取待测样 2. 0-3. Omg，加入 Buffer A 300ul ；Buffer B :75ul，混匀，100°C7jC浴加热15min，并用冷水冷却，取25ul的反应后的混合液加入到I. Oml的60%乙醇溶液中，混和均匀后，在0D570下测定吸光值；其中Buffer A的配制:5ml卩比唳+1. 185g苯酌· +5ml乙醇混勻；其中Buffer B的配制500mg却三酮+IOml乙醇；3)由于使用未合成的Rink Amide_MBHA树脂作为标准品，所以在计算时需要将由于缩合所增加的分子量减去，以保证计算结果的准确性；去除树脂肽增量的影响公式
V _m^ — 1+SD ^
IOOO式中X :去除增加的氨基酸分子量后的原始肽重量；W :树脂妝理论分子量；m :树脂肽实际称量重量；SD Rink_Amide_MBHA 树脂取代量值；其中4mer树脂肽的理论分子量为541. 73 ；Rink_Amide_MBHA 树脂取代量值为0. 38mmol/g。本发明的作用机理是氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共同加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨基结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，根据溶液中游离氨基的多寡，其颜色也会有深浅变化，可以通过分光光度计测量吸光值，根据吸光值的不同，可以对反应中的氨基含量进行判定。本方法采用与合成反应相同的Rink_Amide_MBHA树脂作为标准样品，制作标准曲线，对于固相合成过程中的氨基残余含量判定更为准确，可以更加直观的对合成的预期结果进行判定，彰显技术进步。
具体实施例方式本发明结合实施例作进一步阐明。本方法的实施步骤(一)反应试剂的制备Buffer A :5ml 卩比唳 +1. 185g 苯酌· +5ml 乙醇混勻；Buffer B 500mg 却三酮 +IOml 乙醇； 25%哌啶溶液25ml哌啶溶液+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀；(二)样品处理I)固相合成过程称取Rink_Amide_MBHA树脂2g，并根据树脂摩尔数的计算公式算出所需的树脂摩尔数A，选用带Fmoc保护基的氨基酸，每种氨基酸取2A摩尔，使用IA摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，在含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反应2小时，得到树脂肽，再经25%哌啶溶液处理30分钟，其中每摩尔树脂肽加入25%的哌啶溶液26ml，得去除脱保护基后的树脂肽，备用；树脂摩尔数的计算公式
illA —式中A为Rink_Amide_MBHA树脂的摩尔数；m 为 Rink_Amide_MBHA 树脂的克数；SD 为 Rink_Amide_MBHA 树脂取代量值；2)标准品制备用与合成反应相同的Rink_Amide_MBHA树脂作为标准样品，经25%哌啶溶液(每摩尔树脂加26ml)处理30分钟，使用无水甲醇溶液(每100毫克树脂使用5ml无水甲醇溶液)清洗3次，之后使用真空干燥机进行干燥(温度45°C，真空度95KPa)。3)样品制备取脱去保护基后的树脂肽8mg，使用无水甲醇溶液15ml对其清洗3次，之后使用真空干燥机进行干燥(温度45°C，真空度93. 3KPa)。4)加入 Buffer A 300ul ；Buffer B 75ul,混匀，100°C水浴加热 15min,并用冷水冷却15min，之后取反应液25ul+l. Oml 60%的乙醇溶液混勻;其中Buffer A :5ml吡啶+1. 185g苯酌· +5ml乙醇混勻；Buffer B 500mg却三丽+IOml乙醇；5)在0D570下进行吸光值读取。(二)检测流程I)对处理后的标准品进行取样,精确称取I. Omg、I. 5mg、2. 0mg、2. 5mg、3. Omg的树脂；2)对处理后的样品进行取样，精确称取3. Omg,并记录重量；3)每管标准品和样品均加入Buffer A 300ul ；Buffer B :75ul，混匀，100°C水浴加热15min，并用冷水冷却15min，取25ul的反应后的混合液加入到I. Oml的60%乙醇溶液中，混和均匀后，在0D570下进行吸光值读取，并制作标准曲线，其验证结果见表I。表I
权利要求
1.茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进，其特征在于用与合成反应相同的Rink_Amide_MBHA树脂作为标准样品，制作标准曲线,对未知的样品进行残余氨基定量检测，其步骤如下 其I样品处理 称取Rink_Amide_MBHA树脂2g,计算树脂摩尔数A ;用带Fmoc保护基的氨基酸,每种氨基酸取2A摩尔；将IA摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反应2小时，得到树脂肽；再经25%哌啶溶液26ml，处理30分钟，得到去除保护基后的树脂肽，备用； 其中25%哌啶溶液的配制25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀得； 其中树脂摩尔数的计算公式
2.按照权利要求I所述的检验方法，其特征在于选用的合成用树脂为RinkAmide_MBHA Resin，购自天津南开和成科技有限公司，货号HCRAm04-l_l ;哌啶购自Sigma，货号110-89-4 ;氮甲基吡咯烷酮购自张家港合泰化工有限公司，货号872504 ;茚三酮购自Sigma，货号N4876;吡啶购自天津市风船化学试剂科技有限公司，货号xkl3-201_00115 ；带Fmoc保护基的氨基酸，购自吉尔生化的上海有限公司。·
全文摘要
本发明提供的茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进，使用合成的Rink_Amide_MBHA树脂作为标准样品，进行连续的重量递增称量，可以得到一组标准样品，经过茚三酮试剂反应，在OD570下读取吸光值，制得一条标准曲线，根据此标准曲线，可以对未知的肽树脂进行游离的氨基定量检测分析。
文档编号G01N1/28GK102928362SQ20121039911
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年7月18日
发明者赵毅, 郑先强, 谢仁军, 肖璐恒, 李延涛, 黄炯, 唐磊 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司