专利名称：一种改进的茚三酮对固相多肽合成的检测方法
技术领域：
本发明涉及对茚三酮检测法的改进，既对固相合成中的多肽进行游离氨基的定量测定，与传统方法相比较，该判定结果直接反应可缩合的程度及产率。
背景技术：
在多肽合成领域对肽树脂合成过程是否完全的判定，直接影响到合成产率的多少，常规方法是对缩合完成后的肽树脂直接进行检测，从而粗略的判定合成完成度。但由于合成中存在着一些可能会造成合成反应不能继续的情况，如树脂和氨基酸的保护基去除不全，合成后为避免错误序列的出现而进行的加保护处理等，这些若使用常规方式都会被 判定为合成完全，而实际操作中正是由于这种误判，造成了我们没能及时作出有效的不就措施，致使最终产品中的完整肽链数量相对减少。文献检索披露原茚三酮检测法是针对于多肽合成领域的缩合完整度的定性实验，主要靠缩合后的树脂与茚三酮试剂发生反应，通过颜色的变化来对缩合完成度进行判定。这种方法使用2种试剂,试剂A :取0. 66mg/ml氰化钾水溶液2ml加入到98ml批唳溶液中，再加入4g/ml苯酹乙醇溶液IOml,混勻；试剂B :称取500mg却三酮溶于IOml无水乙醇中。进行合成完成度检测时，取缩合反应完成后的肽树脂3mg，使用无水乙醇清洗3次，真空干燥后，加入试剂A 0. 15ml，试剂B 0. 05ml, 100°C加热10分钟，看颜色变化来判定缩合完成度，颜色如果为蓝色或绿色就判定为缩合不完全，显黄色判定为缩合完全。本发明构思是对合成完成的肽树脂，先经去除保护基以后再进行检测，来确定可用来进行下一步缩合的-NH2数量，从而可以得到一个对合成产率比较精确的预估，而且进行了试剂配方的改进，在不需要添加氰化钾的情况下依旧可以保持颜色变化的稳定性，其应用价值在于通过对合成产率的预估，尽早发现合成中可能出现的影响合成产率的因素。
发明内容
本发明的目的在于改进的茚三酮对固相多肽合成检测法，替代了传统茚三酮检测法判定缩合完成度，结果即准确又便于操作。本发明的目的是这样实现的一种改进的茚三酮对固相多肽合成的检测方法，采用新的茚三酮法，对固相多肽合成的产率得到准确的判定，步骤如下其I试剂配制还原型茚三酮的配制取茚三酮500mg，用12. 5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液；在搅拌下加入维生素C溶液，其中该溶液用500mg维生素C用25ml温蒸馏水溶解制得；出现沉淀继续搅拌15min，移至冰箱中冷却到4°C，取出过滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤2_3次，经真空干燥机，在温度45°C，真空度93. 3 98. 6KPa下处置，置于五氧化二磷真空干燥器中保存；Buffer A的配制:5ml卩比唳+1. 185g苯酌 +5ml乙醇混勻；Buffer B的配制487. 5mg却三酮+12. 5mg还原型却三酮+IOml乙醇；
25%哌啶溶液的配制25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀；其2样品处理称取适量的Rink_Amide_MBHA树脂2g，并根据树脂摩尔数的计算公式算出所需的树脂摩尔数A，选用带Fmoc保护基的氨基酸，每种氨基酸取2A摩尔，使用IA摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，在含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反应2小时，可以得到肽树脂，再经25%哌啶溶液处理30分钟，其中每摩尔肽树脂加入25%的哌啶溶液26ml，得去除保护基后的肽树脂；树脂摩尔数的计算公式
权利要求
1.一种改进的茚三酮对固相多肽合成的检测方法，其特征在于采用新的茚三酮法，对固相多肽合成的产率得到准确的判定，步骤如下 其I试剂配制 还原型茚三酮的配制取茚三酮500mg，用12. 5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液；在搅拌下加入维生素C溶液，其中该溶液用500mg维生素C用25ml温蒸馏水溶解制得；出现沉淀继续搅拌15min，移至冰箱中冷却到4°C，取出过滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤2_3次，经真空干燥机，在温度45°C，真空度93. 3 98. 6KPa下处置，置于五氧化二磷真空干燥器中保存； Buffer A的配制:5ml卩比唳+1. 185g苯酹+5ml乙醇混勻； Buffer B的配制487. 5mg却三酮+12. 5mg还原型却三酮+IOml乙醇； 25%哌啶溶液的配制25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀； 其2样品处理 称取Rink_Amide_MBHA树脂2g，并根据树脂摩尔数的计算公式算出所需的树脂摩尔数A,选用带Fmoc保护基的氨基酸，每种氨基酸取2A摩尔，使用IA摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，在含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反应2小时，得到肽树脂，再经25%哌啶溶液处理30分钟，其中每摩尔肽树脂加入25%的哌啶溶液26ml，得去除保护基后的肽树脂； 树脂摩尔数的计算公式
2.按照权利要求I所述的检验方法，其特征在于选用的合成用树脂为RinkAmide-MBHA Resin,购自天津南开合成有限公司；哌卩定、却三酮购自Sigma;氮甲基批咯烷酮购自张家港合泰化工有限公司；吡啶购自天津市风船化学试剂科技有限公司；FmoC保护基的氨基酸，购自吉尔生化有限公司。
全文摘要
本发明提供的一种改进的茚三酮对固相多肽合成的检测方法，1)取茚三酮500mg，用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液；在搅拌下加入维生素C溶液，出现沉淀继续搅拌15min，移至冰箱中冷却到4℃，用纯净水洗涤2-3次，经真空干燥机处置，得还原型茚三酮；2)称取Rink_Amide_MBHA树脂2g,计算摩尔数，选用带Fmoc保护基的氨基酸，在含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液作用下反应2小时，可以得到肽树脂，再经25%哌啶溶液处理30分钟，得去除保护基后的肽树脂；3)取去除保护基后的肽树脂5-10mg，用无水甲醇溶液15ml对其清洗3次，经真空干燥机处置；称取肽树脂2-5mg，加入300ulBufferA和75ulBufferB，混和均匀，用100℃水浴加热15min，并置于15-20℃水中冷却至室温；加1.2ml的60%乙醇溶液，混合均匀后，测定吸光值并读取。
文档编号G01N21/78GK102680463SQ20121015412
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者唐磊, 朱长动, 李延涛, 肖璐恒, 谢仁军, 赵毅, 郑先强, 黄炯 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司