一种海鞘多肽cs5931的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药学科学领域，具体地涉及一种海鞘多肽CS5931的制备方法
【背景技术】
[0002] 玻璃海鞘广泛分布于山东沿海地区，它是发育与进化生物学研宄的重要生物，且 近年来研宄发现它具有抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、免疫调节以及生物催化等作用，因而引 起人们广泛关注。玻璃海鞘具有广泛的应用价值，因此被《Science》杂志称为生物学研宄 的后起之秀，具有良好的应用前景。
[0003] 从萨氏海鞘（Ciona savignyi)中分离出的一种新型多肽CS5931具有显著的抗肿 瘤活性，N-末端序列分析发现，CS5931与人颗粒体蛋白（granulin，GRN)有同源性。本课 题组已成功通过大肠杆菌原核表达系统表达了重组萨氏海鞘多肽CS5931，其同样具有显著 的抗肿瘤活性。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题在于提供一种海鞘多肽CS5931的制备方法，本发明方 法对现有的通过大肠杆菌原核表达系统表达了重组萨氏海鞘多肽CS5931的发酵、分离纯 化和变性复性方法进行了进一步改进，从IPTG的浓度、IPTG添加时间、诱导时间、接种量、 装液量、培养温度等方面优化表达体系的发酵条件，发酵条件优化后表达收率达〇. 703g/L， 与优化前相比提高了 2. 01倍，且抗肿瘤活性增强。
[0005] -种海鞘多肽CS5931的制备方法，包括重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵、海鞘 多肽CS5931的分离纯化和变性复性；
[0006] 所述的重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵：克隆编码多肽CS5931的基因连 接入含有分子伴侣PG-KJE8的质粒PET-21a载体上，导入表达菌BL21 (DE3)构成工程菌 BL21 (DE3) /pET21a-CS5931 (简称 pET21a-CS5931,下同），将 pET21a-CS5931 接种在含有氨 苄的培养基上进行活化，活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养，接种后4-5h 时加入L-阿拉伯糖、四环素及IPTG进行诱导，继续发酵培养4. 5-8. 5h ;
[0007] 所述的IPTG添加的终浓度为0. 4mM-0. 7mM ;所述的活化后的种子液转接入含有氨 苄的LB培养基中的接种量在3-6% ;所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基中发 酵的装液量在20-45% ;所述IPTG加入后的发酵温度为23°C -30°C ;
[0008] 所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化：通过镍离子金属螯合层析方法纯化重组萨 氏海鞘多肽CS5931的可溶性表达组分；利用组氨酸侧链上的咪唑基与金属离子Ni 2+螯合的 特性，使带有His标签的重组萨氏海鞘多肽CS5931得到分离，并利用60-75mM咪唑缓冲液 洗涤杂蛋白，优选为65mM，250-350mM咪唑缓冲液洗脱目的多肽CS5931，优选为300mM ;使目 的蛋白得到纯化；
[0009] 所述的变性复性：向洗脱得到的目的蛋白溶液中分次缓慢加入8M尿素，l_3mM L-半胱氨酸，0. 3-0.6mM L-精氨酸，0. 3-0.6mM EDTA，反应3-5h;多肽样品变性完成后，将 变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24-30h，期间换1次复性液；复性完成后，将复性 液更换为透析液，透析3-5h，将透析完成的样品加入1-2倍于样品多肽的甘露醇后冻干得 到纯化后的多肽CS5931。
[0010] 进一步，所述IPTG添加的终浓度为0. 6mM时诱导表达效果最好；所述IPTG的添加 时间为接种后4. 5h ;所述活化后的种子液转接入含有氨节的LB培养基中接种量在4%，加 入IPTG后发酵培养温度30°C，所述的pET21a-CS5931活化后接种入LB培养基发酵的装液 量在20% ;
[0011] 进一步，所述的复性液的成份及其终浓度为〇. 3-0. 6mM L-精氨酸、0. 5M尿素、 l-3mM L-半胱氨酸或还原型谷胱甘肽作为还原剂，0. 1-0. 3mM L-胱氨酸或氧化型谷胱甘肽 作为氧化剂，还原剂和氧化剂两者摩尔比为10:1，上述物质溶解在TGE缓冲液中。
[0012] TGE 缓冲液的成份及其终浓度为是：0. 05-0. 15M Tris，0. 25-0. 75mM EDTA， 0. 05-0. 15M NaCl，加 1.0 L蒸馏水，IM盐酸调pH到8. 0,加20-100mL甘油，混匀后定容至 2L。透析液的成份及其终浓度为：0. 05-0. 15MTris，0. 3-0. 6mM L-精氨酸、加600mL蒸馏水， IM盐酸调PH到8. 0,溶解后定容到1000mL。
[0013] 进一步，重组多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：取-80 °C保存的甘油菌 pET21a-CS5931 于含 lOOyg/mL Amp 的 3mL LB 培养基中，37°C，200r/min 培养过夜后涂 平板，37°C倒置培养12h，从平板上挑含有目的基因的表达菌BL21 (DE3)的单菌落接于含 100 μ g/mL Amp的IOmL LB培养基中，37°C，200r/min活化培养12h，将活化的种子液以4% 的接种量转接入50mL LB培养基中，培养基中含有100 μ g/mL的Amp和20 μ g/mL的氯霉素， 装液量为20 %，37°C，200r/min培养，待OD6tltl达到0. 6左右时加入500 μ g/mL的L-阿拉伯 糖、1 μ g/mL的四环素及IPTG进行诱导，继续培养6. 5h ;
[0014] 进一步，所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化：
[0015] (1)将发酵所得菌体离心，收集菌体沉淀，称量菌重；
[0016] (2)冰上融解菌体沉淀，按每克菌加3_5mL细菌裂解液的比例加细菌裂解液，冰上 裂解40-60min ;超声波破碎菌体后，离心，取上清，用滤膜过滤；
[0017] (3)利用蛋白纯化系统，安装镍柱后用超纯水洗10-15个柱床体积，流速为3_5mL/ min ；
[0018] (4)用结合缓冲液平衡10-15个柱床体积，流速为3-5mL/min ;
[0019] (5)将细菌裂解液上清液以流速为l-2mL/min上柱；
[0020] (6)用IOmM咪唑缓冲液洗10-15个柱床体积，洗去未结合蛋白，流速为3-5mL/ min，直至基线水平；
[0021] (7)用60-75mM咪唑缓冲液洗涤杂蛋白，流速为l-2mL/min，比较各洗涤峰的大小， 直至基线水平；
[0022] (8)用250_350mM咪唑缓冲液对目的蛋白进行梯度洗脱，收集洗脱峰，用12 % SDS-PAGE胶检测目的蛋白的纯度，将达到纯度要求的蛋白样品变性；
[0023] 进一步，所述的细菌裂解液的成分及终浓度是：15-25mM Tris，0. 5-1. 5MNaCl， 5-15mM咪唑，0. 5-lg溶菌酶，加600mL蒸馏水，IM盐酸调PH到8. 0,溶解后定容到1000mL。
[0024] 本发明与现有技术相比的有益效果
[0025] 本发明人通过研宄发现影响发酵条件的3个关键因素是IPTG浓度、IPTG加入时 间和诱导温度，IPTG浓度0. 6mM，添加 IPTG时间在接菌后4. 5h，诱导温度30°C。优化后表 达收率达到0. 703g/L，与现有技术相比提高了 2. 01倍。
[0026] 本发明经分离纯化条件优化实验得出，最佳分离纯化条件是65mM咪唑缓冲液 洗涤杂蛋白、300mM咪唑缓冲液洗脱目的多肽CS5931 ;将纯化得到的多肽样品使用本 发明复性液进行透析复性，可得到具有较好的肿瘤细胞体外增殖抑制作用的重组多肽 CS5931，对人结肠癌细胞HCT116的抑制作用增强，IC5tl值由现有技术的1.94yM(Zha〇 jin, Cloning, characterization and expression of a acDNA encoding agranulin-1 ike polypeptide in Ciona savignyi.Biochimie)降低到了 1.41 μΜ，对人膜腺癌细胞Panc28、 人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人肝癌细胞BEL-7402等也具有增殖抑制作用
【附图说明】
[0027] 图1不同IPTG浓度诱导的菌体电泳：M :蛋白marker ;1-6 :IPTG浓度分别为0、 0. 1、0. 4、0. 7、1.0、1.3mM时菌体电泳图，方框中为目的蛋白条带；
[0028] 图2不同IPTG浓度的表达收率；（表达收率=干菌重*表达率）
[0029] 图3不同IPTG添加时间的表达收率量；（表达收率=干菌重*表达率）
[0030] 图4不同诱导时间的表达收率量；（表达收率=干菌重*表达率）