多肽药物DiaPep277 的合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肽的合成方法，更具体而言，涉及DiaPep277的合成方法。
【背景技术】
[0002] 以色列安多米达生物技术公司的合成肽--DiaP印277是源自人热休克蛋白60 序列上的一段含24个氨基酸的肽段，其序列如下：
[0003] H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pr〇-Ala-Leu-Asp-Ser -Leu-Thr-Pr〇-Ala-Asn-Glu_Asp-〇H
[0004] 多项临床前试验结果显示，DiaPep277能通过诱导Th2和Treg的产生来抑制致糖 尿病免疫反应，从而有效阻止0细胞的破坏，并保留其胰岛素分泌功能，进而有可能改善 血糖控制，减少胰岛素用量。更重要的是，DiaPep277的免疫调节作用具有特异性，不会干扰 其他免疫功能，因此在临床试验中表现出极佳的安全性。这种药物可以明显提高I型糖尿 病患者的生存质量，延缓或阻止各种并发症的发生，以提高患者的预期寿命。目前，FDA已 授予DiaPep277孤儿药地位，用于治疗有残余0细胞功能的I型糖尿病患者。
[0005] 鉴于DiaPep277在治疗I型糖尿病中的特殊地位和广泛的应用前景，其合成方法 的开发也变得日趋紧要。由于DiaPep277肽段中存在大量的疏水残基，会引起树脂收缩严 重，如采用标准的固相逐步偶联缩合技术难以顺利偶联，导致纯度很低，特别是偶联片段 Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val时容易产生缺损肽及增加或减少Gly的杂质。
[0006] 因此，需要开发一种新的合成DiaP印277的方法，其具有改进的纯度和收率。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足，本发明通过采用片段固相缩合手段，可有效的避免树脂收 缩带来的偶联不完全的缺损肽及增加或减少Gly的杂质，进而提高DiaPep277粗肽的纯度 与收率。
[0008] 本发明的目的是提供一种DiaP印277的合成方法，具体提供一种DiaP印277的片 段固相合成方法，其包括下述步骤：
[0009] (1)以王树脂或2-CTC树脂为载体合成Fmoc-Asp(OtBu)-树脂，然后采用固相多肽 合成方法将其从C端到N端逐一偶联氨基酸、然后脱除Fmoc保护基，得到肽树脂A:
[0010] H-Val-Ala-Leu-Leu-Arg(pbf)-Val-Ile-Pr〇-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Leu -Thr(tBu) -Pro-Ala-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-树脂；
[0011] (2)以2-CTC树脂为载体合成Fmoc-Gly-2-CTC树脂，然后采用固相多肽合成方法 将其从C端到N端逐一偶联氨基酸，得到肽树脂B:Fm〇C-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-2-CTC树 脂；
[0012] (3)将肽树脂B进行裂解，得多肽片段b:
[0013] Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-〇H；
[0014] (4)将多肽片段b与肽树脂A进行固相偶联得到肽树脂C:
[0015] Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg(pbf)-Val-Ile-Pr〇-Ala-Leu -Asp(OtBu)-Ser(tBu) -Leu-Thr(tBu) -Pro-Ala-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-树脂；
[0016] (5)将肽树脂C裂解得到DiaPep277 :
[0017] H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pr〇-Ala-Leu-Asp-Ser -Leu-Thr-Pr〇-Ala-Asn-Glu_Asp-〇H〇
[0018] 本发明的DiaPep277的片段固相合成方法相对于传统的固相逐步偶联缩合法不 仅保持了操作简便、后处理容易等优点，还具有收率高、纯度好的优势，为DiaPep277的大 规模生产提供了一种全新的思路。
【具体实施方式】
[0019] 术语解释
[0020] 本文通篇的术语"固相多肽合成方法"、"固相偶联"是指多肽合成领域已知的 Fmoc固相合成方法，例如记载于FmocSolidPhasePeptideSynthesis:APractical Approach,W.C.Chan,PeterD.White著，March2, 2〇00(ISBN-10:0199637245)，英国Oxford UniversityPress。
[0021] 本文通篇的术语"片段固相合成"是一种运用Fmoc固相合成方法来合成多个多肽 片段，然后将该多个多肽片段固相偶联的方法。
[0022] 本文通篇的术语"肽树脂"是指多肽的C端连有树脂的多肽树脂。
[0023] 本文通篇的术语"多肽片段"是指上文提及的"肽树脂"脱除C端树脂而露出游离 羧基的多肽。
[0024] 说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下表中：
[0025]
[00：
【主权项】
1. 一种合成DiaP印277的方法，包括下述步骤： (1) 以王树脂或2-CTC树脂为载体合成Fmoc-Asp (OtBu)-树脂，然后采用固相多肽合成 方法将其从C端到N端逐一偶联氨基酸、然后脱除Fmoc保护基，得到肽树脂A: H-Val-Ala-Leu-Leu-Arg(pbf)-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Ser (tBu)-Leu-Thr (tBu) -Pro-Ala-Asn (Trt) -Glu (OtBu) -Asp (OtBu)-树脂； (2) 以2-CTC树脂为载体合成Fmoc-Gly-2-CTC树脂，然后采用固相多肽合成方法将其 从C端到N端逐一偶联氨基酸，得到肽树脂B: Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-2-CTC树脂； (3) 将肽树脂B进行裂解，得多肽片段b: Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-OH ； (4) 将多肽片段b与肽树脂A进行固相偶联得到肽树脂C : Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg(pbf)-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp (OtBu) -Ser (tBu) -Leu-Thr (tBu) -Pro-Ala-Asn (Trt) -Glu (OtBu) -Asp (OtBu)-树脂； (5) 将肽树脂C裂解得到DiaPep277 : H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu -Thr-Pr〇-Ala-Asn-Glu-Asp-〇H〇
2. 权利要求1的方法，其中，步骤（1)中的树脂为王树脂；所得的Fmoc-Asp (OtBu)-树 脂的替代度为〇. 4~0. 7mmol/g。
3. 权利要求1的方法，其中，步骤（2)中所述2-CTC树脂的替代度范围为0.6~ I. 2mmol/g，优选为 0· 8 ~1.0 mmol/g。
4. 权利要求1的方法，其中，步骤（1)和（2)中的固相多肽合成方法在偶联剂的存在 下进行，所用的偶联剂为以下成分的组合物：DIP⑶I和HOBt ;PyB0P、HOBt和DIPEA ;TBTU、 HOBt 和 DIPEA ;或 HBTU、HOBt 和 DIPEA。
5. 权利要求1的方法，其中，步骤（1)和（2)中的固相多肽合成方法在偶联剂的存 在下进行，所用的偶联剂为DIPCDI和HOBt的组合物，其中各成分的比例以摩尔比计为 DIPCDI:H0BT=1:1 ~1. 2。
6. 权利要求1的方法，其中，步骤（4)中的固相偶联在偶联剂的存在下进行，所用的 偶联剂为以下成分的组合物：PyB0P、HOBT和DIPEA ;PyB0P和DIPEA ;DIPCDI和HOAT ;或 DIPCDI 和 HOBT。
7. 权利要求1的方法，其中，步骤（4)中的固相偶联在偶联剂的存在下进行，所用的偶 联剂为PyBOP、HOBT和DIPEA的组合物，其中偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为PyBOP : HOBT :DIPEA=L 0:L 2:2. 0。
8. 权利要求1的方法，其中，步骤（3)中的裂解过程在裂解液的存在下进行，所述裂解 液为以体积计为TFE :DCM=1:99的混合物。
9. 权利要求1的方法，其中，步骤（5)中的裂解过程在裂解液的存在下进行，所述裂解 液为以体积计为TFA :TIS :H20=95 :5 :5的混合物。
10. 权利要求1-9中任一项的方法，还包括DiaPep277的纯化步骤，所述纯化步骤采用 反相高压液相色谱法，包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以〇. 2%三氟乙酸/乙腈为流动 相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
【专利摘要】本发明涉及DiaPep277的片段固相合成方法：构建肽树脂A:H-Val-Ala-Leu-Leu-Arg(pbf)-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Pro-Ala-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-树脂和肽树脂B:Fmoc-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-2-CTC树脂，然后将两个片段偶联。所述方法收率高且纯度好，为DiaPep277的工业规模生产提供了一种新的思路。
【IPC分类】C07K14-47, C07K1-04, C07K1-06
【公开号】CN104650209
【申请号】CN201310585416
【发明人】张文治, 刘建, 马亚平, 袁建成
【申请人】深圳翰宇药业股份有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年11月19日