一种紧密连接免疫原多肽及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种紧密连接免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域；一种紧密连接免疫原多肽，其特征在于：所述的多肽序列为SEQ ID NO：1，增强T细胞免疫应答。该氨基酸序列为全新的序列，采用化学合成所述的多肽；本发明的紧密连接免疫原多肽用于卵巢癌肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，增强T细胞免疫应答。本发明的有益效果在于为全新的序列，可用于卵巢癌肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞，（2）促进CD8+免疫应答，（3）能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，（4）在荷瘤小鼠体内，能抑制卵巢癌肿瘤的生长。
【专利说明】
-种紧密连接免疫原多化及其应用
技术领域
[0001] 本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明设及用作抗癌疫苗的紧密连接免 疫原的优化多肤，增强T细胞免疫应答。
【背景技术】
[0002] 卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子 宫体癌而列居第=位。但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位。卵巢恶性肿瘤中W 上皮癌最多见。目前，卵巢恶性肿瘤因病理类型不同而治疗方案不同，多用手术治疗联合化 疗等综合治疗。但对于中、晚期的患者，疗效欠佳。
[0003] 肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免 疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行 体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发或增强机体自身免疫功能，从而达到治 疗肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
[0004] Claudin-4蛋白是细胞间紧密连接的骨架蛋白。研究发现，claudin-4在原发性卵 巢癌中呈显著高表达，其升高的程度与卵巢癌组织分级和临床分期呈正相关。Claudin-4在 卵巢上皮性癌和黏液性囊腺癌等主要的卵巢癌中表达均上调，但在正常卵巢细胞和卵巢囊 腺瘤中无过表达，表明它的表达与恶性肿瘤相关，并且它的高表达与肿瘤恶性程度呈正相 关。claudin-4是恶性卵巢癌的标记物，可W作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，claudin- 4由209个氨基酸残基组成，分子量较大，较难得到纯度高的claudin-4。运样，不仅会给后期 的特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患者的自身免疫。因此，本发明提供了一种特异 性强，纯度较高的小分子多肤作为免疫原。
【发明内容】
[0005] 发明目的
[0006] 本发明提供一种紧密连接免疫原多肤，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞 免疫应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。
[0007] 技术方案
[000引本发明的技术方案在于提供一种紧密连接免疫原多肤，序列为MASM化MMVTG GWAASG化LLGG化化CNCPPRTDKPYSAKYYYSAASSAAASNKK(SEQ ID NO: 1)。采用化学合成所述的 多肤。本发明的紧密连接免疫原多肤用于卵巢癌肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能增强T细 胞免疫应答。
[0009] 有益效果
[0010] 本发明的紧密连接免疫原多肤，为全新的序列，为Claudin-4的类似多肤，可用于 卵巢癌肿瘤免疫细胞技术中的免疫原。有益效果在于（1)促进T细胞，（2)促进CD8+免疫应 答，（3)能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，（4)在荷瘤小鼠体内，能抑制卵巢癌肿瘤的 生长。
【具体实施方式】 [00川实施例1
[0012]采用化学合成方法合成多肤：多肤用化OC化学方法合成。合成反应从C端向N端进 行，Rink介质（可在Advanced化enfTech公司购得)上有自由氨基，按C端向N端的顺序将各个 氨基酸连接。每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由 氨基的皿TU，册化，DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个化晚/醋酸/ N-甲基咪挫的混合物来封闭未连接的自由氨基。每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基 酸连接之前，都要把介质上的化OC-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20 %赃晚的二甲基甲酯 胺。最后，当所有氨基酸残基顺序连接之后，多肤用98%=氣乙酸从介质上切割下来。应用 上述化学条件可合成并获得多肤，纯度大于95%，序列为 MASMGLMMVTGGWAAS化化LGGG1XLCNCPPRTDKPYSAKYYYSAA SSAAASNKK，该序列为可用于肿瘤 细胞免疫的免疫原。
[001引实施例2
[0014] 用肿瘤模型检测紧密连接免疫原多肤的体内活力。
[0015] 6-8龄雌性巧7BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。（1)空白组；（2)实施例1免 疫原多肤低剂量组；（3)实施例1免疫原多肤中剂量组；（4)实施例1免疫原多肤高剂量组。建 立卵巢癌肿瘤模型，在接种卵巢癌肿瘤细胞后的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为:空白组 加入相同体积的溶剂，实验组实施例1多肤(上海生工吉尔合成)设3个剂量:5、10、20mg/Kg， 在肿瘤周围多点注射。28天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，紧密连接免疫原 多肤可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，（1)空白组；（2)实施例1免疫原多肤低 剂量组；（3)实施例1免疫原多肤中剂量组；（4)实施例1免疫原多肤高剂量组依次的存活率 依次为25.2% ,74.1% ,77.3% ,82.6%。
[0016] 实施例5
[0017] 应用竞争性受体-配体亲和法测试多肤与MHC的结合能力：将实施例1得到的多肤 与HLA各型的结合能力由竞争性受体-配体亲和法判断。将固定浓度为50WHO1/L的标记I25I 的MH邱良制性多肤W及不同浓度（1-50皿ol/L)的MHC试剂盒(所述的MHC试剂盒为HLA试剂 盒，购自购自上海泛柯生物科技有限公司），在反应体系中形成两种复合物，即待测多肤MHC 复合物和I25I标记多肤复合物。待测多肤与I25I标记多肤竞争与MHC的结合。用超过滤(产品 型号Microcon 30，Amicon公司）分离游离多肤和多肤MHC复合物，然后测定多肤MHC复合物 的I25I放射量，将此放射量与没有竞争性抑制的多肤MHC复合物(没有加待测多肤的样本)的 放射量比较，求待测多肤在抑制50%标记多肤与MHC结合时的浓度，即I巧0。由此得到，实施 例1得到的多肤对HLA-A1、A2、A3、A11和A24的IC50值分别为《1 OiiM定为3.89、4.22、1.53、7、 32和3.22皿ol/L，均符合阳性多肤的标准。因此，实施例1得到的多肤为具有有效结合能力 的免疫原多肤。
[001引实施例6
[0019] T淋己细胞的增殖作用:无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器忍研磨， 200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离屯、（100化/min，5min)，弃上清，化iS-NH4化破解红细 胞，冰水浴静置3-5min，离屯、（100化/min，5min)，弃上清，用无菌冷PBS洗涂细胞两次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培养液（5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5*106 个/ml，于96孔培养板中培养。
[0020]实验设空白对照组、模型组(刀豆蛋白A)、实施例1得到的多肤各剂量(5、10、20mg/ ml)组。各组分别加入脾脏淋己细胞悬液I(K)山/孔后，空白对照组加入1640培养液I(K)山，模 型组加入ConA(终浓度为扣g/ml)，实施例1得到的多肤各剂量组在加入不同浓度的多肤基 础上加 ConA(终浓度为化g/ml)。37 °C细胞培养箱静止培养4她，培养结束后每孔加入 MTT，继续培养4h，最后弃掉每孔所有溶液，每孔加入10化IDMSO，震荡，用酶标仪检测570nm 处OD值，每孔设5个平行。增殖率公式：增值率（％ ) = (OD样品组-OD模型组）/0D样品组* 100%;
[0021 ]表1实施例1得到的多肤对T淋己细胞的增殖作用
[0022]
[0023] 冲<0.05，*冲<0.0 l与模型组相比。
[0024] 实验结果见表1，与模型组比较，实施例1得到的多肤能促进小鼠脾脏淋己细胞的 增殖，在剂量为5~20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系，W20mg/ml的增殖率最高，为 53.51%。
[0025] 实施例7
[0026] 紧密连接免疫原多肤的免疫原性测定:采用流式细胞技术测定免疫原多肤对CD8+ T细胞的影响。6-8龄雌性C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。（1)空白组；（2)实施例 1免疫原多肤低剂量组；（3)实施例1免疫原多肤中剂量组；（4)实施例1免疫原多肤高剂量 组。在试验的第〇、7、14天，分别进行免疫。方案为:空白组加入相同体积的溶剂，实验组实施 例1多肤(上海吉尔合成)设3个剂量:5、10、20111旨/蛇，在小鼠背部淋己结附近多点注射。30天 后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，将血离屯、后取血细胞层，用红细胞裂解液破解红细胞，洗去 裂解的红细胞，再用巧光标记的单克隆抗CD8+-FITC解育、固定后，进行流式细胞技术测定， 评价免疫原多肤对CD8巧细胞的影响。
[0027] 表2实施例1得到的多肤对CD8巧淋己细胞的作用 [002引
[00巧]冲<0.05，*冲<0.0 l与模型组相比。
[0030]实验结果见表2,与空白组比较，实施例1得到的多肤能促进小鼠 CD8巧淋己细胞， 在剂量为5~20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系，W20mg/Kg的增殖率最高，为 56.82%。
【主权项】
1. 一种紧密连接免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列为SEQ ID NO: 1。2. 根据权利要求1所述的多肽在制备治疗卵巢癌肿瘤药物中的应用。3. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于:采用卵巢癌肿瘤免疫细胞技术中，增强T细 胞免疫应答。
【文档编号】A61P35/00GK105924513SQ201610438527
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月19日
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司