用于预防和治疗过敏的肽免疫原的制作方法

专利名称：用于预防和治疗过敏的肽免疫原的制作方法
1．领域本发明涉及肽免疫原，用于抑制相互作用，此相互作用通常导改由与过敏原相连的细胞结合的IgE诱导产生的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的激发，导致药理活性介体的释放和控制过敏及炎症发生中所涉及的细胞因子的从头合成。本发明涉及包含BSW17模拟型肽(BSW17 mimotopepeptide)组分的免疫原分子和它们的用途。2．背景过敏症状由药理活性介体，公认的有组胺、白细胞三烯和一些酶类，从细胞释放到周边组织和血管结构中引起。这些介体通常在称为肥大细胞和嗜碱性粒细胞的特殊细胞中贮存或从头合成。肥大细胞分布在整个动物组织中而嗜碱性粒细胞分布在血管系统内。这些细胞在细胞内合成并贮存介体，除非特定次序的事件发生激发其释放。
免疫球蛋白(IgE)抗体在介导过敏反应中的作用已是众所周知的。IgE是由一组多肽链复杂排列形成，象其他免疫球蛋白一样，包含了两条轻链和两条重链，它们由二硫键连接形成“Y”形构型。每条轻链有两个结构域，一个可变区(VL)连着一个氨基酸序列相对不变的恒定区(CL)。相对地，重链有一个可变区(VH)和IgE中有四个恒定区(CH1,CH2,CH3,CH4,也称作Cε1,Cε2,Cε3,Cε4)。抗体的两“臂”与抗原结合有关，其上有多肽结构变化的区域，称为Fab’片段或者F(ab)2片段，F(ab’)2代表2个Fab’臂由二硫键连接。抗体的“尾部”或中轴包含一段固定或恒定的肽序列，称为Fc片段。Fc片段含有相互作用的位点，使抗体能够与其他免疫系统分子或细胞通过与它们的Fc受体结合相互联系。
Fc受体是能够特异地与免疫球蛋白Fc区域内活性分子位点结合的分子。Fc受体可以在一个细胞的细胞质外膜中以整合膜蛋白形式存在或者以在血浆或其他体液中自由循环的自由“可溶性”分子形式存在。在人体系统中，IgE与其受体FcεRI高亲和性结合伴随着一个复杂的蛋白-蛋白间相互作用，此相互作用有IgE的第三个重链恒定区结构域(Cε3)的不同部位和FcεRIα亚基的近膜免疫球蛋白样的区域(α2)参与。
尽管IgE重链恒定区Cε3结构域中的一些氨基酸残基和属于FcεRIα受体的α2结构域的一些区域，已经被确定对结合是重要的，但是结合过程的详细机理仍不清楚。荧光能量转移测定、X-射线和中子散射实验提供了实验的证据表明，人类IgE有一个弯曲结构，推测其与IgE对FcεRI的独特的高亲和性(Kd～10-10M)有关，而且尽管IgE分子为受体结合提供两个Cε3结构域上的相同抗原决定基，但推测这个弯曲保证了IgE与细胞结合的或可溶的FcεRI之间形成等摩尔复合物。这种单价性在功能上是保证在缺乏过敏原的情况下避免受体激发所必需的(

图1)。相互作用位点根据它们的功能可能已经暴露从而能够与细胞受体结合。或者，它们可能在抗体与抗原结合之前是隐藏的，在结合时抗体在结构上发生改变继而暴露其他活性位点，然后该活性位点能够激发特异的免疫活性。根据从圆二色谱分析得到的数据，有一种影响Cε3结合到受体上的构象重排可用来解释细胞表面上Fcε/FcεRI复合物1∶1的化学比。
对生物体内组胺从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中过敏性(免疫性)释放来说，IgE分子必须以它的Fc部分锁定或粘附在细胞的Fc受体位点上，导致IgE分子固定在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上。与细胞结合的IgE分子的Fab部分必须与一个特定相容性抗原(过敏原)交叉连接。当上述相互作用发生时，肥大细胞或嗜碱性粒细胞被自动激发释放组胺到周围环境中，表面出熟悉的过敏症状。在后期反应中随着其他生化反应的发生导致了细胞因子和其他介体的从头合成和释放[Ravetch,J.V.,and J.P.Kinet,Ann．免疫学年鉴9(1991)457-492].
传统的治疗过敏症的方法包括用抗组胺剂或类固醇的系统治疗或使病人脱敏的尝试，这些方法不是针对基本的IgE与肥大细胞/嗜碱性粒细胞相互作用。其他的方法是关于多肽链的合成，合成的多肽链能够阻断IgE抗体与细胞表面的Fc受体结合和从已经结合了IgE的结合位点上转移IgE。而且，为了确定IgE Fc区域内假定的“效应物”位点的性质已经进行了研究，推测此位点提供了一个激发肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体的免疫信号。
已经尝试使用重组的IgE片段作为免疫原，产生保护性的抗IgE疫苗，并证明有效。反对这种疫苗的主要理由是担心使用大的IgE片段来免疫接种不仅会引起抑制性抗体的产生，而且会在病人体中产生交叉连接从而产生过敏原的抗体(图2)。
对这个问题的解决策略是以确定可能的最小的IgE片段为目标，这个小片段理想地仅包含受体结合位点，在结合后包埋在IgE/FcεRI复合物中，因此通过疫苗引起的免疫应答中不再产生交叉连接。但是考虑到在IgE/FcεRI相互作用中涉及的不同的Cε3区域的空间距离，重建这样一种复杂的分子实体的尝试可能未必会成功。3．发明概述现已发现，使用BSW17模拟型肽作自动免疫能解决与“经典”疫苗方法有关的本质问题，BSW17模拟型肽或者以与适当的载体偶联的化学合成的肽形式，或者以重组融合构建体(例如和卵白蛋白、IgG等)的形式存在。
BSW17是一个单克隆抗体，能够识别其至少一部分位于Cε3内部的Fcε上的构象抗原决定基。依据关于微生物保存的布达佩斯条约规定，产生单克隆抗体BSW17的杂交瘤细胞系已于1996年12月19日保藏在ECACC库中，保藏号为96121916。如图3中所示，这种抗体显示生物活性的有趣分布。循环于血管系统内的BSW17或BSW17样的抗体通过以下的方式防止过敏反应a)通过竞争性抑制IgE/IgERI相互作用来抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞的激发和b)通过B细胞水平的IgE合成的负调节来降低血清IgE水平。
BSW17“模拟型”肽目前已通过随机肽噬菌体展示(Phagedisplay)文库筛选得到鉴定，即模拟IgE分子上复杂构象的抗原决定基的至少一部分的肽。化学合成的模拟型肽与一种免疫原的载体蛋白偶联可以用于，例如作为疫苗，使过敏的宿主中特异地产生抗体，通过阻断IgE/FcεRIα结合和/或IgE合成来抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞激发。作为一种抗IgE抗体的模拟型肽，它们诱导一种免疫应答，使宿主内产生BSW17样的抗体。既然已证明BSW17为非过敏原性，并对B细胞上IgE/FcεRI结合和IgE的合成有抑制作用，那么针对以BSW17模拟型肽为基础的疫苗而产生的这些抗体具有相似的保护特性。与“经典的疫苗方法”相比，这种免疫应答是非常特异的，因为不存在IgE衍生的蛋白片段来导致免疫的病人体内产生交联的抗体(图4)。
因此本发明涉及免疫原分子包括(a)至少一种BSW17模拟型肽组分和(b)能够针对此肽引起免疫应答的组分。在下文中简称为“本发明的免疫原”。
组分(a)优选地包含最多5个，优选1个或2个，尤其是一个BSW17模拟型肽组分，组分(b)正如下文所述，优选地是一种传统的免疫原载体，尤其是BSA或者KLH。
组分(a)的BSW17模拟型肽优选总共最多15个氨基酸的，例如下文中序列(A)到(Q)(Seq.id.no.1 to no.17)之一。但是它们能适当地包括用于半抗原-载体结合的其他组分，例如促进与组分(b)偶联或进一步加工的组分。因此，当BSW17模拟型肽是环状时，两端可以，例如通过两个附加的半胱氨酸残基形成二硫键而结合在一起或者末端被化学交联，例如与赖氨酸；或者当BSW17模拟型肽是线型时，羧基端的氨基酸可以方便地通过酰胺化作用封闭，和/或氨基端的氨基酸可以容易地通过乙酰化作用封闭。此外，组分(a)的BSW17模拟型肽组分，例如下文中优选的组分(A)至(Q)，可以在本发明的免疫原中侧接几个，优选1或2个，附加的辅助基团，如乙酰基，半胱氨酸或赖氨酸和/或附加的偶联基团，如DC或BSS，例如在下文提到的实施例8中所揭示的本发明的特定免疫原中作为偶联物(2)到(4),(6)到(11),(13)和(14)。
与杂交瘤BSW17产生的抗体相比，本发明的免疫原诱导产生的抗体是内源的；因此它们在病人中能起到预防治疗的作用。
它们能够通过适当地按上述解释的方法偶联组分(a)和(b)制备得到。4．详细描述本发明的免疫原例如以一种多聚肽或一种重组融合蛋白的形式存在，靠多聚肽中的单体化合物成融合蛋白中的一个配偶体构成BSW17模拟型肽组分(a)，而多聚肽或融合蛋白的剩余部分构成引发免疫应答的组分(b)。
特别地，它们以至少一种BSW17模拟型肽组分(a)和免疫原的载体组分(b)形成的偶联物的形式存在。
优选的BSW17模拟型肽组分，即本发明的免疫原的组分(a)，基本上包括或包含选自下面的氨基酸序列Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) (Seq.id.no.1),Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (B) (Seq.id.no.2),Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (C) (Seq.id.no.3),Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (D) (Seq.id.no.4),Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (E) (Seq.id.no.5),Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (F) (Seq.id.no.6),Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (G) (Seq.id.no.7),Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (H) (Seq.id.no.8),Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (I) (Seq.id.no.9),Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (J) (Seq.id.no.10),Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (K) (Seq.id.no.11),Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (L) (Seq.id.no.12),Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (M) (Seq.id.no.13),Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (N) (Seq.id.no.14),Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (O) (Seq.id.no.15),Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) (Seq.id.no.16), orVal-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (Q) (Seq.id.no.17).
更优选的是上述(A),(D)和(G)，尤其是(A)和(D)。
本发明也涉及药物组合物，特别是疫苗，包含上面描述的免疫原分子和佐剂。
本发明也涉及配体，即在“被动免疫”中使用的针对BSW17模拟型肽的抗体或由抗体衍生的片段(见下面)，由此抗体或抗体片段也能识别对应于BSW17的人类IgE上的天然抗原决定基；也就是说，本发明涉及配体，如上面描述的包含了对BSW17模拟型肽组分特异的一个抗体结构或这个抗体结构域也能与IgE重链上的氨基酸序列反应，这部分氢基酸序列包含了被BSW17识别的天然抗原决定基，这些配体可作为多克隆或单克隆抗体在哺乳动物中产生；它们的优选形式为单克隆抗体，更优选的是它们的Fab片段或者F(ab’)2片段。
本发明进一步涉及本发明的免疫原的制备方法，包括共价偶联a)至少一种BSW17模拟型肽组分与b)能对上述肽发生免疫应答的组分本发明也涉及上面描述的免疫原分子，用作一种药物，例如用于治疗IgE介导的疾病如过敏症和遗传过敏性皮炎。
本发明进一步涉及在药物组合物，尤其是疫苗的制备中，上述免疫原分子抵抗IgE介导的疾病特别是过敏症和遗传过敏性皮炎的应用。
本发明更进一步涉及抵抗IgE介导的疾病如过敏症和遗传过敏性皮炎的预防或治疗免疫的方法，包括当需要这种治疗时，给病人施用治疗有效量的上面所描述的免疫原分子。
本发明的免疫原，实质上不能介导非细胞溶解的组胺释放，能够诱导抗体产生，该抗体具有与IgE的Fc区域的靶氨基酸序列强血清学的交叉反应性。因此，它们在疫苗中或作为疫苗是有用的。
免疫原的初始用量(例如大约0.2mg到5mg，特别是1mg)例如是以肌内用药，接着14到28天后，重复(加强剂量)同样的剂量。剂量当然要在一定程度上视病人的年龄、体重和一般健康状况而定。免疫可以是“自动的”或“被动的”。
在“自动”免疫中，病人接受了本发明的免疫原，并且通过它的抗hIgE应答是由病人的免疫系统自动产生的。
“被动”免疫是通过给患IgE介导的疾病的病人施用抗BSW17模拟型肽的抗体(或者是多克隆的或者是单克隆的抗体)来获得的，给药的方式优选注射。
多克隆抗BSW17模拟型肽的抗体制备可以通过给非人类哺乳动物施用本发明的免疫原，优选使用佐剂，并且收集生成的抗血清。通过在一段时间内重复注射可以得到更高的效价。用来制备抗体的哺乳动物品种没有特别的限制；但一般倾向于使用兔或豚鼠，但马、猫、狗、山羊、猪、大鼠、牛、绵羊等动物也可使用。生产抗体时，一定量的本发明的免疫原可用例如生理盐水稀释到一个合适的浓度，得到的稀释液再与完全弗氏佐剂混合得到一种悬浮液。此悬浮液用于给哺乳动物用药，例如腹腔内，例如给兔子用药，每次用药为从大约50μg到大约2500μg本发明的免疫原。此悬浮液用来实现免疫接种，优选大约每隔两个星期用药，时期为长达大约2-3个月，优选的是大约一个月。在最后一次用药后经过1到2周传代，从免疫的动物中收集血液，并将血液离心从血液中分离血清得到抗体。
单克隆抗BSW17模拟型肽的抗体可以是例如人或小鼠的。优选地，病人用从小鼠单克隆抗体或者人-鼠嵌合抗体(包含人的Fc区域和鼠的Fab’区域)制备得到的Fab’片段进行治疗以减小对外来的动物免疫球蛋白的任何不良反应。小鼠单克隆抗体可用Khler和Milstein的方法制备(Kohler，G.and Milstein，C.，自然256495)，例如超免疫小鼠的脾细胞与适合的鼠骨髓瘤细胞系融合。很多方法可以用来得到人类单克隆抗体，包括用以下方法的生产(1)Epstein-Barr病毒(EB病毒，非洲淋巴细胞瘤病毒，EBV)转化的B细胞(2)用于B淋巴细胞杂交的细胞系(3)人-鼠杂交瘤(4)人-人杂交瘤(5)人×人-鼠异源杂交瘤；和
(6)所有组成成分克隆(噬菌体展示)人×人-鼠异源杂交瘤是最优选的，包括组合人及鼠亲本细胞型的有利特征。已使人-鼠异源杂交瘤细胞系适合于做B细胞融合(Teng,N.N.M.等，美国科学院院报807308)。
当用来进行免疫接种时，抗体可以通过最方便的肌肉注射的方法导入宿主体内。传统的液体或固体载体也可运用，只要它们能被宿主接纳，对宿主没有不利的副作用且对疫苗没有有害的影响。磷酸盐缓冲液(PBS)可以单独或与合适的佐剂如以氢氧化铝为基础的佐剂一起用来作为一种载体，PBS应在生理的PH值范围内，例如大约PH6.8到7.2，优选大约PH7.0。免疫原性抗原的浓度可以在大约50μg到大约500μg的范围内变动，优选每次注射大约20μg到300μg，溶剂的量一般从大约0.25ml到大约1ml，优选大约0.5ml。初次注射后需要多次注射，可以例如以一年的间隔。
就“自动”免疫来说，更适合人类使用，但其他哺乳动物品种例如狗也可以用与这些品种的IgE相对应的相似的模拟型肽同样治疗。“免疫原的载体”这个术语在此包括这样一些物质，这些物质有独立在宿主动物中引起免疫应答的性质并能与多肽共价偶联，偶联或者直接通过肽的形式或者在多肽的自由羧基、氨基或羟基与免疫原的载体物质的相应基团之间形成酯键，或者选择性地通过常规的双功能连接基团结合，或者作为融合蛋白。
这些载体的例子包括白蛋白，比如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲状腺球蛋白；血红蛋白；血蓝蛋白[特别是匙孔血蓝蛋白(KLH)]；从蛔虫中提取的蛋白，例如蛔虫提取液，如免疫学杂志111260-268，免疫学杂志122302-308，免疫学杂志98893-900，和Am.J.Physiol.199575-578文章中所描述的或者从蛔虫提取液中得到的纯化产物；聚赖氨酸；聚谷氨酸；赖氨酸-谷氨酸共聚物，包含赖氨酸或者鸟氨酸的共聚物等。最近，疫苗的生产也采用白喉类毒素或破伤风类毒素作为免疫原的载体物质(Lepow M.L.等，传染病杂志150402-406；Coen Beuvery,E.等，感染和免疫4039-45)而这些类毒素物质也可用于本发明。提纯的结核菌素蛋白衍生物(PPD)尤其优选在“自动”免疫方案中应用，因为(1)它本身不诱导T细胞应答(即它实际上是T细胞半抗原)，然而表现为完全加工的抗原，并象一个完全加工的抗原被T细胞识别；(2)被认为是交联识别模式中最有效的半抗原“载体”之一；和(3)它可以不经进一步测试而在人体中应用。
作为半抗原-载体结合剂，那些传统上在制备抗原时使用的试剂都可以使用，例如上面所述，或以下实施例中提到的。
本发明共价偶联组分(a)和组分(b)的方法可以用已知的方式实施。因此，举例来说，对于直接共价偶联，优选使用双-N-琥珀酰亚胺衍生物，更优选双磺基琥珀酰亚胺辛二酸(BSS)作为偶联剂。戊二醛或碳二亚胺，更优选地二环己基碳二亚胺(DC)或者1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，也可以用于肽(a)与免疫原的载体物质(b)的共价偶联。
半抗原和半抗原-载体结合剂[即组分(a)]和载体[即组分(b)]的用量可以用常规的方法容易地得到确定。载体使用量优选为大约1到大约6倍，更优选为大约1到大约5倍于半抗原的重量，而半抗原-载体结合剂的使用量为半抗原摩尔当量的大约5到大约10倍。反应后，载体通过半抗原-载体结合剂结合到半抗原上，得到包括肽-载体复合物的所需抗原。所得到的本发明的免疫原可以容易地用常规的方法分离出来，例如通过透析，凝胶过滤，分级沉淀，等。
起始材料的制备也可用常规的方法实现。用来作为组分(a)的适当的肽可以例如通过随机肽噬菌体展示文库鉴定，和例如通过传统的固相程序容易地合成，例如对环状肽来说，可通过使用广为所知的“F-moc”程序的固相程序，或者可以选择性地使用通过随机合成肽的筛选的拟肽策略来鉴定。图解图1:IgE与其高亲和性受体IgERI之间的相互作用图2 “经典的”抗IgE疫苗方法图3:BSW17生物活性显示4 以BSW17模拟型肽为基础的免疫治疗图5 噬菌体展示的BSW17模拟型肽特异地识别BSW17图6 噬菌体展示的BSW17模拟型肽抑制IgE/BSW17结合图7 化学合成的BSW17模拟型肽与BSW17结合图8a 环状BSW17模拟型肽GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH(BSS)偶联物(SDS 236和Fcε(500-509)-KLH(BSS)偶联物(SDS 237)被BSW17识别图8b 不用BSW17模拟型肽偶联物被BSW17识别图9a: BSW17模拟型肽偶联物[BSA(DC)]和Fcε(500-509)偶联物[KLH(戊二醛]被BSW17特异识别图9b: BSW17模拟型肽偶联物[KLH(DC)；赖氨酸]被BSW17特异识别图10a 用BSW17模拟型肽偶联物(1)免疫接种后兔中诱导的抗人类IgE免疫应答图10b 用BSW17模拟型肽偶联物(2)免疫接种后兔中诱导的抗人类IgE免疫应答图11 通过免疫接种在兔中产生的抗BSW17模拟型肽的抗体的血清效价图12 在BSW17模拟型肽免疫的兔中抗人类IgE应答的同型特异性图13 对于IgE结合抗BSW17模拟型肽的血清与BSW17的竞争图14 亲和纯化的抗BSW17模拟型肽的抗体与hIgE结合图15 免抗BSW17模拟型肽的血清和亲和纯化的抗BSW17模拟型肽的抗体对人类血细胞的过敏原性检测-R2/0,R4/0在BSW17模拟型肽接种之前兔R2和R4的免疫前血清-R2/SDS214,R4/SDS213初次免疫接种65天后，兔R2和R4的血清-抗SDS213，抗SDS214亲和纯化的抗BSW17模拟型肽的抗体-R2/O PC,R4/O PC加了兔血清的阳性激发对照(PC)样品浓度A=0.1μg抗BSW17模拟型肽的抗体(或者相当于兔全血清中的量)每毫升B=1.0μg抗BSW17模拟型肽的抗体(或者相当于兔全血清中的量)每毫升C=5.0μg抗BSW17模拟型肽的抗体(或者相当于兔全血清中的量)每毫升缩写Ac 乙酰基AMS 硫酸铵BSA 牛血清白蛋白BSS 双磺基琥珀酰亚胺辛二酸BSW17 抗天然IgE的CH3抗原决定基的IgG单克隆抗体(J.Knutti-mller et al.，过敏41457-465；S.Miescher et al.,Int.Arch.Allergy Immunol.10575)BSW17 mimotope peptide模仿人类IgE上天然抗原决定基的肽，能被单克隆的抗人类IgE抗体BSW17识别cfu 集落形成单位DC二环己基碳二亚胺EBV EB病毒，非洲淋巴细胞瘤病素ELISA 酶联免疫吸附测定FcεRI IgE恒定区的高亲和性受体ⅠFCS 胎牛血清gam 羊抗鼠gar 羊抗兔h 人类HEPES N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙基磺酸HRP 辣根过氧化物酶(=POX)HSA 人血清白蛋白IgE 免疫球蛋白EIPTG 异丙基-B-D-硫代半乳糖苷KLH 匙孔血蓝蛋白Le27 单克隆的抗-人类IgE抗体(过敏,Supra；Int.Arch.Allergy Immunol.supra)LB-plates Luria-Bertani培养基平板mimotope peptide模仿抗体分子至少部分的构象抗原决定基的肽PBS 磷酸盐缓冲液PEG 聚乙二醇POX 辣根过氧化酶(=HRP)PPD 纯化的强结核菌素蛋白衍生物rhIL-3 重组的人类白细胞介素-3RIA plates 放射免疫分析平板RPMI1640标准细胞培养基(Sigma，圣路易斯，美国)SB-medium Na-Bacto培养基(Pharmacia,Uppsala,瑞典)sLt 可溶的白细胞三烯TBS Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲盐水VCS VCS M13辅助噬菌体(stratagene，美国)5．实施例在下列实施例中，阐明了本发明但在任何方面都不限制本发明的范围，有关的温度是指摄氏温度。实施例1抗hIgE单克隆抗体BSW17的抗过敏潜力通过以BSW17模拟型肽进行自动免疫，在病人中建立了测试BSW17和BSW17样抗体抗过敏能力的模型，BSW17对人类嗜碱性粒细胞样细胞释放组胺的影响，可从骨髓细胞与rhIL-3共培养中得到，说明如下。
单核细胞是用亲本股骨头的骨髓通过Ficoll-Hypaque密度沉降(1.077g/ml；400g)置换制备得到。5×105细胞/ml在包含15％FCS和2ng/ml人rhIL-3的RPMI1640培养基中培养。在37℃和5％CO2中培养6天后，加入含rhIL-3的等量培养基。在第12天，收获细胞用于被动敏化和组胺释放测定。在1ml的总体积中，大约5×105个培养的骨髓细胞培养在HA缓冲液(20mM HEPES；PH7.4；0.3mg/ml HSA)中，缓冲液中含有500ng/ml人IgE，含有或缺失50倍过量的单克隆的抗IgE抗体。37°培养2小时后，细胞上清在被动敏化中用来测定组胺。细胞沉淀用来激发组胺释放。为确定直接组胺释放的程度，被动敏化的骨髓细胞悬浮于0.3ml HCM缓冲液中(HA缓冲液含有0.6M CaCl2和1mM MgCl2，并与0.1μg/ml过敏原的单克隆的抗IgE抗体Le27共培养)。在上清和细胞沉淀物中的组胺含量由Technicon自动分析仪Ⅱ(Technicon,Tarrytown,New York,USA)测量。计算组胺释放的百分根据公式组胺释放(％)=(上清中的组胺/上清中的组胺+细胞沉淀中的组胺)×100。计算在被动敏化过程中的组胺释放的百分比根据公式组胺释放(％)=〔上清中的组胺(被动敏化后)/上清中组胺(激发后)+上清中组胺(敏化后)+细胞沉淀中组胺〕×100。计算抗IgE抗体特异的组胺释放根据公式特异的组胺释放(％)=总组胺释放(％)一自发组胺释放(％)。
三个独立实验的结果总结在表1中表1抗IgE抗体对敏化的骨髓细胞组胺释放的影响
*)与rhIL-3(2ng/ml)一起培养的人骨髓细胞由IgE(0.5μg/ml)或者IgE和抗IgE抗体(0.25μg/ml)一起被动敏化**)A敏化过程中组胺释放B用单克隆抗IgE抗体Le27(0.1μg/ml)激发后组胺释放表1的数据清楚地显示，骨髓细胞与IgE和BSW17一起培养在敏化过程中不释放组胺，但抑制随后Le27的激发。骨髓细胞与IgE和Le27一起培养，在被动敏化过程中已经被激发到一定程度，这样在与这种免疫原的单克隆抗体第二次培养时，不再释放组胺。骨髓细胞在缺乏任何一种单克隆抗IgE抗体时被动地敏化，然而在随后的Le27激发后有效地释放组胺。
可以总结出a)BSW17本身是非免疫原的和b)BSW17保护人的嗜碱性粒细胞免于受诱导剂诱导导致组胺释放。因此，通过用BSW17模拟型肽自动免疫，在过敏病人中产生BSW17样抗体。可预期保护宿主免于过敏反应的发展。实施例2随机肽噬菌体展示文库筛选和选择阳性克隆被BSW17特异识别的噬菌体颗粒通过展示线型或环状随机肽的噬菌体文库生物筛选得到鉴定，随机肽长度从6到15个氨基酸残基并分别与噬菌体肽PⅢ和PⅧ融合。为扩增噬菌体文库，2ml大肠杆菌XL-Ⅰblue在SB培养基中生长到OD600=1.0的液体培养物，与1010个噬菌体在室温下培养15分钟，再加入含10μg/ml四环素和20μg/ml羧苄青霉素的10mlSB培养基，分别取10μl,1μl和0.1μl涂在含100μg/ml羧苄青霉素的LB平板上。培养液在37°剧烈振荡培养1小时，再加入含10μg/ml四环素和50μg/ml羧苄青霉素的100mlSB继续培养1小时，再加入1012cfu的VCSM13辅助噬菌体。在37℃剧烈振荡2小时后，加入卡那霉素到终浓度70μg/ml，培养过夜。在4°,4000g下离心20分钟后，将上清与38ml 12％NaCl和16％PEG 8000的冰冷的无菌过滤溶液混合，冰上冷却30分钟，4°,10000g离心30分钟。噬菌体沉淀溶于含15％酪蛋白的2ml TBS中，在4℃下保存。为生物筛选，用溶于0.1M碳酸盐缓冲液(PH9.0)浓度为20μg/ml的BSW17在4°涂敷CostarRIA平板(Costar 3690)过夜，之后用含1.5％酪蛋白的TBS封闭。加入2×1011cfu噬菌体，37°培养2小时，用PBS/0.1％Tween 20洗10遍。用水洗加样孔，结合的噬菌体用总共200μl0.1M HCl(PH2.2)洗脱10分钟。洗脱的噬菌体用2M Tris碱中和并如上所描述的进行扩增。为筛选阳性克隆，在三轮筛选后，用50μl大肠杆菌XL-Ⅰblue在SD培养基中生长到OD600=1.0的液体培养物，与1μl 10-8稀释度的扩增噬菌体一起在室温下培养15分钟，然后在含100μg/ml羧苄青霉素的LB平板上涂板生长过液，随机挑选菌落在含100μg/ml羧苄青霉素的LB平板上划板。37°4小时后，浸泡于10mM IPTG的硝酸纤维素滤膜置于其上，32℃接着过液培养。揭下滤膜，在CHCl3-大气中37℃培养30分钟。将滤膜放置于50mM Tris(PH8),150mM NaCl,5mM MgCl2,3％BSA，每100ml 100U DNA酶Ⅰ和40mg溶菌酶培养1小时，去除细菌碎片，用含1.5％酪蛋白的TBS封闭，与溶于含1.5％酪蛋白的TBS中的BSW17-POX(BSW17与POX偶联)一起培养过液，用TBS,TBS/0.5％Tween 20,TBS各洗滤膜10分钟。为显色，将滤膜条于1ml含600μg 4-氯-1-萘酚和0.042％过氧化氢的TBS中。实施例3鉴定展示模仿天然BSW17抗原决定基的肽(BSW17模拟型肽)的噬菌体颗粒分别展示由7,8或9个氨基酸组成的环状肽和由10和15个氨基酸残基组成的线形肽的不同的噬菌体颗粒，已发现与BSW17结合。编码这些肽的DNA核苷酸序列已经确定。根据它们之间的同源性和Fcε内的同源区域，展示被BSW17识别的肽的3组噬菌体可以从DNA序列推断出来。在表2中显示了一个总结表2由BSW17模拟型肽噬菌体展示的肽序列A组
=带正电荷的p=不带电有极性的o=非极性的n=表达相应序列的克隆数目+(++),+/-=被BSW17识别的强度(分别为Seq id.no.18,no.19,no.20和No.21)上述A组的第二个肽(Seq.id.no.19)是肽(A)(Seq.id.no.1)和二个附加的用来环化的Cys。其他三个肽，Seq.id.no.18,seq.id.no.20和seq.id.no.21分别是进一步相似制备的肽。B组
以上B组的三个肽分别为肽(G)(Seq.id.no.7),(H)(Seq.id.no.8)和(Ⅰ)(Seq.id.no.9)。C组
上述C组的7个肽分别为，肽(O)(seq.id.no.15),肽(J)(Seq.id.no.10),肽(P)和二个附加的Cys(Seq.id.no.22)，肽(L)和二个附加的Cys(Seq.id.no.23)，肽(M)和二个附加的Cys(seq.id.no.24)，肽(N)与二个附加的Cys(Seq.id.no.25)，和肽(K)和二个附加Cys(Seq.id.no.26)，包括侧翼Cys的C组的肽是强BSW17结合物。整个C组不表达与Fcε同源的序列；这些肽是仅仅从结构上模仿BSW17抗原决定基的真正的模拟型肽。
如从表2中可以看到的，A组中肽的羧基端是高度保守的，而氨基端，尽管更加简并，都包含了带正电的，极性的氨基酸。这种电荷的分布似乎对BSW17识别是必须的，因为在氨基端的这个特性不同的一个克隆证明仅仅能与BSW17很弱地结合。在Fcε中没有发现具有明显序列同源性的连续的一段氨基酸。然而模式相似性排列，可以将这些肽定位到Cε4结构域内500到508位的一段氨基酸上。Stanworth等[Lancet336(1990)1279]推测Fcε500-509十肽参与了通过受体结合的IgE激发肥大细胞。
属于B组的肽互相之间高度同源。而且，它们的氨基端几乎与Fcε370-375位氨基酸相同。这个序列是Cε3的一部分，并包含或邻近一个已显示参与了IgE与它的高亲和性受体结合的区域。这一发现解释了BSW17对IgE/IgERI相互作用的抑制。
可以总结出，被BSW17识别的复杂的构象抗原决定基包含了IgE分子的500-508(Cε4内)和370-375(Cε3内)氨基酸片段提供的构象结构〔编号按照E.A.Padlan and D.R.Davies，分子免疫学23(1986)1063〕。上述A和B组中的模拟型肽与一个免疫原的载体分子偶联，免疫个体产生的抗体因而将通过阻断IgE结合到它的高亲和性受体和/或引发靶细胞的脱粒来避免过敏反应。
表中的C组总结出的肽互相之间和与Fcε之间没有表现出明显的同源性。因此，它们代表模拟被BSW17识别的三维结构的“真正的模拟型肽”。用这些模拟型肽作为免疫原，因而将导致抗过敏性的BSW17样的抗体在免疫的宿主中产生。
对选择的模拟型肽，在以下实施例4到6中表明了BSW17样免疫应答的产生，其特异性地针对人类IgE上的BSW17抗原决定基。实施例4展示BSW17模拟型肽的噬菌体被BSW17特异地识别噬菌体颗粒展示的模拟型肽(表2的A组第一个克隆=图5中克隆1=Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys=Seq.id.no.18；第二个克隆=Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys=Seq.id.no.19)与BSW17的抗原特异的高变区域的结合通过ELISA证明。按照标准的ELISA程序，将10μgBSW17和不同的单克隆抗体涂敷到COSTAR板的加样孔中，用BSA封闭后，在100μl包含噬菌体颗粒的ELISA温育缓冲液中温育，噬菌体颗粒从噬菌体侵染的细胞培养物上清中得到，噬菌体滴度为109cfu/ml。冲洗后，平板加入含5μg辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗M13抗体的温育缓冲液温育。所有的温育在室温下持续1小时，最后冲洗后，噬菌体颗粒与涂敷的抗体结合由HRP结合的抗M13血清通过按标准ELISA程序中的生色底物显色变为可见的，图5表示了模拟型肽噬菌体非常特异地与BSW17结合并不与其他抗体如8E7,3G9和5H10结合，这些抗体也是单克隆的抗Cε3抗体并通过使用重组的Cε3作为免疫原产生的，不与5H5/F8结合，5H5/F8代表另一种针对人FcεRIα的胞外部分的单克隆抗体。作为阴性的非抗体对照的重组FcεRIα链和作为阳性对照的涂敷了多克隆抗M13抗血清的加样孔也包括在实验中。实施例5展示BSW17模拟型肽的噬菌体竞争性抑制BSW17结合到IgE上模拟型肽-BSW17相互作用的特异性已通过证明展示模拟型肽的噬菌体颗粒的吸附干扰了BSW17/IgE结合得到进一步证明。细菌细胞在含有100μg/ml四环素和50μg/ml羧苄青霉素的SB中生长到OD600=0.4，然后加入VCSM13辅助噬菌体，37°连续温育2小时。然后加入卡那霉素到终浓度70μg/ml。连续温育过夜，噬菌体颗粒用聚乙二醇沉淀。用溶于0.1M碳酸盐缓冲液(PH9.6)的20μg/ml的BSW17涂敷柔软的RIA平板，并用含1.5％酪蛋白的TBS封闭。人IgE用氯胺-T方法进行125Ⅰ-标记，分别地，在浓度不断增加的非标记IgE(标准曲线)或噬菌体颗粒存在下，每孔用100000cpm Ⅰ125-标记的IgE与涂敷到RIA平板上的BSW17结合。所有的实验在室温下进行，平板用0.9％NaCl+0.05％ Tween20洗三遍，切成块，每个加样孔在γ-计数器中测量1分钟。
模拟型肽噬菌体(图6中的phBSW.6-9=图5中的克隆1=CRRHNYGFWVC=Seq.id.no.18；图6中的PHBSW.29-8=图5中的克隆18=CINHRGYWVC=Seq.id.no.19)(见上述实施例4)抑制了BSW17结合到IgE上。图6表示了在展示BSW17模拟型肽的噬菌体克隆存在时，125Ⅰ标记的IgE与BSW17结合。封闭的圆圈表示了未标记的IgE的标准抑制曲线，用来估计在1011cfu/ml噬菌体颗粒存在时标记的IgE结合的抑制。噬菌体克隆产生的抑制分别相当于浓度为1μg/ml和1.7μg/ml的非标记的IgE。实施例6用展示模拟型肽的噬菌体克隆免疫兔诱导抗原决定基特异的免疫反应为测试以BSW17模拟型肽为基础的疫苗方法的实用性，用展示BSW17模拟型肽的噬菌体颗粒和作为参照的辅助噬菌体分别免疫接种兔。1012cfu新制备的噬菌体颗粒在4℃PBS中透析。取1mL用完全弗式佐剂乳化进行第一次免疫，或用1ml不完全弗式佐剂进行加强免疫，每隔14天重复皮下免疫。在第三次加强免疫后，取出12ml血，室温下在玻璃瓶中凝结4小时，2000g离心10分钟。上清用ELISA测定抗人体IgE抗体的存在。来自三个不同个体的人类IgE(SUS11-IgE；PS-IgE；WT-IgE)在PBS中稀释到50μg/ml浓度，取1μl小份滴在硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜在含1.5％酪蛋白的TBS中封闭1小时。兔血清在含1.5％酪蛋白的TBS中1∶200稀释，温育过夜。用TBS,TBS-0.05％Tween20和TBS各洗10分钟。显色的羊抗免HRP在含1.5％酪蛋白的TBS中1∶1,000稀释并温育4小时。冲洗和显色按上述的进行。正如表3中所示的，用VCSM13噬菌体免疫接种的对照兔和未免疫接种的兔在它们的血清中只表现很弱的对人类IgE的反应，假设反映的是天然存在的抗兔IgE自动抗体与人IgE发生交联反应。然而，除了对噬菌体PⅧ外壳蛋白的大量的免疫应答外，用BSW17模拟型肽噬菌体免疫的兔血清中还包含了对人IgE特异识别的大量增加的抗体水平表3用展示BSW17模拟型肽的噬菌体免疫的兔中抗IgE应答
线这些抗血清中BSW17抗原决定基的特异性可用竞争性ELISA证明硝酸纤维素膜块如上述制备，在兔血清与含1.5％酪蛋白的TBS 1∶50的稀释液中温育过夜。冲洗后，用含1.5％酪蛋白的TBS按1∶50000稀释度稀释辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体BSW17(BSW17-HRP)，加入此抗体稀释液，放置4小时。随后的冲洗和显色如上述操作。正如从表4中可以看到的，BSW17-HRP与不同来源的IgE制备物的结合受到了用BSW17模拟型肽噬菌体免疫的兔血清的抑制，而同时用辅助噬菌体免疫的兔血清不显示任何抑制效应表4用BSW17模拟型肽噬菌体免疫的兔血清对BSW17/IgE相互作用的抑制
<p>在以下的实施例7和8中，表明了用化学合成的模拟型肽与载体蛋白偶联作为免疫原来制备抗过敏疫苗的实用性。实施例7化学合成的BSW17模拟型肽高亲和性地与BSW17结合为了确定BSW17模拟型肽噬菌体的由噬菌体衍生的部分可以省略且并不破坏模拟型肽序列的生物学活性，以下的肽由化学方法合成，包含了环状BSW17模拟型十肽(A)[在表2,A组中表示为线型，即第二个克隆为肽(A)和2个附加的Cys(Seq.id.no.19)，这里包含7个附加的邻近的噬菌体衍生的氨基酸残基Gly-Glu-Phe-和-Gly-Asp-Pro-Ala作为侧翼序线列，加入这些序列是为促进环状模拟型肽的正确折叠]用标准技术合成后，此肽通过2个半胱氨酸环化并用R hodol绿荧光标记。在ELISA条件下，此肽与固定在微量滴定板的加样孔上依次增加浓度的BSW17的结合用荧光测量的方法测定，表示在图7中。实施例8与载体蛋白偶联的化学合成的BSW17模拟型肽被BSW17特异识别不同的模拟型肽经化学合成，并与免疫原的载体蛋白偶联。偶联反应按肽与载体蛋白1∶1质量比，并按标准程序操作(Shans.Wong.蛋白质偶联和交联化学，CRC出版社)。偶联物可以由以下偶联剂制备得到-戊二醛偶联-DC(二环己基碳二亚胺)偶联-BSS(双磺基琥珀酰亚胺辛二酸)偶联-赖氨酸交联得到的模拟型肽偶联物是(1)P1=线型KTKGSGFFVF-BSA戊二醛(2)P4=线型AcINHRGYWVC-BSA(DC)(3)P5=线型AcRSRSGGYWLWC-BSA(DC)(4)SAF1-KLH=环状GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH(DC)(5)SAF2-KLH=线型KTKGSGFFVF-KLH(DC)(6)SAF3-KLH=线型VNLPWSFGLE-KLH(DC)(7)SAF3-Lys=线型VNLPWSFGLE-赖氨酸交联(8)SAF4-KLH=线型VNLTWSRASG-KLH(DC)(9)SAF5-KLH=VNLTWS-KLH(DC)(10)SDS214=环状GEFCRRHNYGFWVCGDPA-KLH(BSS)(11)SDS213,SDS227,SDS236,SDS252=环状GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH(BSS)(12)SDS237,SDS253=线型KTKGSGFFVF-KLH(BSS)(13)SDS242,SDS254=线型VNLPWSFGLE-KLH(BSS)(14)SDS243=线型VNLTWSRASG-KLH(BSS),由此(1),(5)和(12)是分别用戊二醛、DC和BSS偶联制备的参考免疫原分子；因此(1)，即P1，其人类IgE的氨基酸500-509,Seq.id.no.28，见The LancetSupra，用戊二酸偶联的方法与BSA偶联(5)，即SAF2-KLH，是同样的肽，Seq.id.no.28，用DC偶联的方法与KLH偶联；和(12)，即SDS237和SDS253，是同样的肽，Seq.id.no.28，用BSS偶联的方法与BSS偶联。
其它的肽是本发明的免疫原，也就是说-(2)(P4)是N-乙酰化的肽(A)(Seq.id.no.1)，在C端的有一个附加的Cys(Seq.id.no.29)，通过DC偶联的方法与BSA偶联；-(3)(P5)是N-乙酰化的肽(C)(Seq.id.no.3)，在C端有一个的附加的Cys(Seq.id.no.30)，通过DC偶联的方法与BSA偶联；-(4)(SAF1-KLH)是实施例7的肽(Seq.id.no.31)通过由二个侧翼Cys形成的二硫键环化，用DC偶联的方法与KLH偶联；-(6)(SAF3-KLH)是肽(G)(Seq.id.no.7)，与KLH通过DC偶联的方法偶联；-(7)(SAF3-Lys)是肽(G)(Seq.id.no.7)，通过赖氨酸交联的方法偶联；-(8)(SAF4-KLH)是肽(D)(Seq.id.no.4)，与KLH通过DC偶联的方法偶联；-(9)(SAF5-KLH)是肽(Q)(Seq.id.no.17)，与KLH通过DC偶联的方法偶联；-(10)(SDS214)是表2A组中第一个肽，具有与实施例7中肽(Seq.id.no.32)相同的7个相邻的噬菌体衍生的氨基酸残基；-(11)(SDS213,SDS227,SDS236,SDS252)是以上(4)中肽(Seq.id.no.31)相同的肽的环化，并用BSS偶联的方法与KLH偶联；-(13)(SDS242,SDS254)是肽(G)(Seq.id.no.7)用BSS偶联的方法与KLH偶联；和-(14)(SDS243)是肽(D)(Seq.id.no.4)用BSS偶联的方法与KLH偶联；图8a表明，环状BSW17模拟型肽-KLH(BSS)偶联物(11)即SDS236，和Fcε衍生的“原始的”抗原决定基基元(12)，即SDS237，即Fcε(500-509)与KLH(BSS)偶联为线型肽，都能以剂量依赖的方式被BSW17识别，而自由的KLH不表现任何结合。以各1μg SDS236,SDS237或自由的KLH涂敷微量滴定板的加样孔，与不断增加浓度的BSW17一起温育。同羊抗鼠IgG-HRP(gamIgG-HRP)检测结合的抗体，所示数据代表了减去在未涂敷抗体的(BSA封闭的)加样孔中的背景结合的重复实验的平均值。
图8b总结了一些ELISA数据，这些数据来自用几种化学偶联方法偶联在载体蛋白上的不同的BSW17模拟型肽偶联物。微量滴定板的加样孔以各5μg每种模拟型肽偶联物，或自由的KLH涂敷，与10μg BSW17一起温育。结合的抗体用gamIgG-HRP检测。所示的数据代表了减去未吸附抗体的(BSA封闭的)加样孔中的背景结合的重复实验的平均值。与自由的KLH相比发现每一个BSW17模拟型肽偶联物都被BSW17识别。然而，从几个星期重复进行的实验中，有一点发现变得更清楚，那就是通过DC偶联的KLH偶联物不太稳定并逐渐地失去了它们与BSW17结合的能力。相反，通过BSS偶联得到的BSW17模拟型肽偶联物被证明即使在+4°也是稳定的。
在图9a和9b中表明，与KLH或BSA偶联的BSW17模拟型肽被BSW17特异，并不被无关的单克隆抗体3G9(抗人体Cε3)和5H5/F8(抗人体RIα)识别。另外，微量滴定板加样孔以各5μg的每个所示的模拟型肽偶联物涂敷，并与10μg相应的单克隆抗体一起温育。结合的抗体以gamIgG-HRP检测，所示的数据代表了减去未加样的(BSA封闭的)孔中的背景结合后，重复实验的平均值。实施例9用BSW17模拟型肽偶联物免疫兔导致体内抗人类IgE抗体的产生为确定BSW17模拟型肽偶联物免疫原性的特异性，用如以下所列的一系列模拟型肽/载体制备物对兔进行免疫接种兔的编号 免疫原 偶联物型R1 (10)SDS214R2 (10)SDS214Cε4模拟型肽R3 (11)SDS213R4 (11)SDS2131 KLH(Pierce)2 KLH-BSS接头 KLH对照4 (12)SDS23711 (12)SDS237Cε4(500-509)7 (6)SAF3-KLH13 (7)SAF3-Lys14 (13)SDS242Cε3模拟型肽16 (13)SDS24217 (13)SDS25418 (7)SAF3-Lys5 (8)SAF4-KLHCε3(370-379)8 (8)SAF4-KLH19 (14)SDS24320 (14)SDS24312 (4)SAFI-KLH15 (4)SAFI-KLHCε4模拟型肽200μg相应的偶联物制备物溶于总体积为500μl的磷酸盐缓冲液(PBSdef)中，通过皮下注射对兔进行免疫接种。第一次免疫接种的样品以1∶1的比例与完全弗氏佐剂(兔R1-R4)或TiterMax(sigma；兔1-20)混合。在起始免疫接种前，取出5ml血样。加强免疫在第一次注射后第21和28天用不完全弗式佐剂进行。血样在第28和49天提取，从所有血样中制备血清。
抗人类IgE免疫应答在免疫的兔子中的产生用ELISA监测微量滴定板的加样孔以5μg人体IgE(SUS-11；JW8)涂敷，与100μl血清样品(1∶50用ELISA温育缓冲液稀释)一起温育。与固定的人类IgE结合的兔抗体通过与羊抗免IgG-HRP(garIgG-HRP)一起温育来检测。测量的OD405值由每一个对应的兔子的免疫前的血清得到的读出值来校正，血清稀释度也为1∶50。图10a和10b给出的数据代表重复测量的平均值。图10a和图10b清楚地证明了用不同的BSW17模拟型肽偶联物免疫的兔子中针对人类IgE的抗体的诱导产生。
通过ELISA，分别与KLH载体，用作免疫原的肽和人类IgE相关的新产生的抗体的血清滴度得到确定。使用一系列的血清稀释度分别与固定的KLH，模拟型肽-BSA偶联物和人类IgE一起温育。这样的血清滴度鉴定的两个例子表示在图11中，分别为(11)，即SDS213，和(10)，即SDS214。
上述的例子证明了BSW17模拟型肽偶联物作为免疫原来诱导抗人类IgE反应的实用性。实施例10用BSW17模拟型肽偶联物免疫的兔中诱导的抗hIgE应答是同型特异的，在与IgE结合中与BSW17竞争免疫的兔中的抗人类IgE免疫应答的同型特异性通过ELISA监测微量滴定板的每个加一样孔分别以3μg的人类IgE(SUS-11),IgA,IgG和IgM涂敷，再加100μl血清样品(在ELISA温育缓冲液中1∶50稀释)温育。由固定的人类抗体结合的兔抗体通过与羊garIgG-HRP一起温育来测定。测出的OD405值通过从每一只相应的兔子的1∶50稀释的免疫前血清得到的读出值来校正。图12中所给出的数据代表了重复实验的平均值。如可见的，用BSW17模拟型肽偶联物免疫的兔中产生的免疫应答对IgE特异，除了用(10)，即SDS214，免疫的兔血清对人类IgM的部分识别。
在竞争性ELISA中可更进一步表明，兔抗SDS214抗血清能够不完全地与BSW17竞争和IgE的结合。每个微量滴定板加样孔以1μg人类IgE(SUS-11)涂敷，并与含5μg BSW17或无BSW17的温育缓冲液一起温育。冲洗后，以1∶50用ELISA温育缓冲液稀释抗SDS213抗血清，加入100μl进行第二次温育，由未处理的固定的人类IgE和预先与BSW17温育的IgE结合的兔抗体通过加羊garIgG-HRP温育来测定。在图13中给出的数据代表了重复实验的平均值。实施例11用BSW17模拟型肽偶联物免疫的兔中产生的抗hIgE抗体可以通过用与Sepharose偶联的模拟型肽作为亲和剂的亲和层析纯化这个实施例证明，用BSW17模拟型肽偶联物免疫在兔中诱导的抗hIgE应答与特异的抗模拟型肽的应答相同。
兔多克隆抗BSW17模拟型肽的抗体的免疫亲和纯化a)硫酸铵沉淀在22ml兔抗血清(根据Bradford,60mg/ml总蛋白，BSA标准，BIO-RAD)中加入5.5g固体AMS(25％W/V)，混合物搅拌3小时，并在室温下放置过夜。沉淀通过18000rpm(Sorvall)离心45分钟分离，用25ml25％AMS水溶液(W/V)洗。洗了的沉淀在同样条件下再次离心，并在10mlPBS(含0.05％NaN3,PH7.2)中溶解，在5l同样的缓冲液中+4°透析过夜。b)免疫亲和层析被透析物在0.2μm Millex-GV滤膜器(Millipore)上过滤，并上样到Pharmacia XK 16/30柱上，此柱中已充入了与5mg BSW17模拟型肽SDS227共价偶联的CH-Sepharose 4B，以PBS,0.05％NaN3为层析缓冲液，流速为1ml/min。上样和洗去未结合的蛋白组分后，特异结合的抗体用0.1M甘氨酸/盐酸缓冲液(PH2.8)洗脱。洗脱液(组分第12-20在9ml溶液中)边收集边搅拌用3.3M Tris/HAc,0.8％NaN3,PH8.0溶液(50μl/ml)立即中和到PH7.4，最后在3lPBS,0.05％NaN3,PH7.2溶液中4°透析过夜。根据Bradford,BIgG标准(BIO-RAD)，总蛋白量大约为1mg/ml。从上样的总蛋白中的回收率为0.7％。
亲和纯化的IgG组分与hIgE的结合用ELISA检测。
以逐步增加浓度的人体IgE(JW8)涂敷微量滴定板的加样孔，并分别与5μg纯化的抗SDS-213抗血清和抗SDS214抗血清一起温育。用garIgG-HRP检测结合的抗体。图14所示的数据代表重复实验的平均值。如从图中可见到的，在抗BSW17模拟型肽亲和柱上纯化的IgG抗体被人类IgE剂量依赖性地识别。用亲和柱的流出液样品，只观察到较低背景结合活性。这些数据证明在兔中诱导的抗hIgE活性与针对模拟型肽的抗体相同。实施例12用BSW17模拟型肽偶联物免疫后，兔中产生的抗人类IgE抗体对人血细胞是非过敏原的此例证明通过用BSW17模拟型肽偶联物免疫在兔中产生的抗IgE抗体对人血中嗜碱性粒细胞是非过敏原的。作为检测系统，可使用商业上有售的CAST sLt ELISA试剂盒(Bühlmann AG,Allshwil，瑞士)。在这个实验中，从人嗜碱性粒细胞中可溶的白细胞三烯(sLt)的释放作为细胞受过敏原试剂激发的结果，可用供应商提供的实验方法来测定。在将细胞与检测样品共培养后，实验的读出值给出了每ml人白血细胞上清中存在的sLt的pg量，读出值通过与标准曲线比较确定。标准曲线是用一系列稀释度的标准sLt在竞争ELISA中得到。在每一次检测中都包括了正、负对照，正和负对照分别是从所给的血细胞制备物(PC=“病人对照”；用交联的抗IgERIα抗体激发细胞样品后得到样器)所能释放的最多sLt和从血细胞制备物(PB=“病人空白”)自发sLt释放的sLt背景水平。
从用实施例11中所述的BSW17模拟型肽偶联物和亲和纯化的抗BSW17模拟型肽的抗体免疫的兔中得到完全血清，来检测嗜碱性粒细胞激发的存在，因而检测了非过敏原的抗hIgE抗体。从一个健康的供体新取出的人全血用来作为嗜碱性粒细胞的来源并严格地按CAST ELISA试剂盒的方法加工。图15中总结的结果表明无论是包含了用BSW17模拟型偶联物免疫产生的抗hIgE抗体的非纯化血清，还是亲和纯化的抗BSW17模拟型肽的抗体，都没有激发人体血细胞释放白细胞三烯的能力；因此他们是非过敏原的。这是BSW17模拟型肽在人的抗过敏疫苗中应用的绝对前提。
序列表(1)基本信息(ⅰ)申请人(A)名称Novartis AG(B)街名Schwarzwaldallee 21 5(C)城市巴塞尔(D)国家瑞士(E)邮政编码(ZIP):CH-4058(F)电话61-3245269(G)传真61-3227532(ⅱ)发明名称肽免疫原(ⅲ)序列数目32(ⅳ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(ⅴ)目前申请资料申请号WO PCT/EP97/...
(ⅵ)在先申请资料(A)申请号GB9604412.8(B)递交日1996年3月1日(ⅶ)在先申请资料(A)申请号GB 9617702.7(B)递交日1996年8月22日(2)关于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:1Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val1 5(3)关于SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:2Arg Asn His Arg Gly Tyr Trp Val1 5(4)关于SEQ ID NO:3的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:3Arg Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Leu Trp1 5 10(5)关于SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:4Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10(6)关于SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征
(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:5Val Asn Leu Pro Trp Ser Arg Ala Ser Glyl 5 10(7)关于SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:6Val Asn Leu Thr Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10(8)关于SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:7Val Asn Leu Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10(2)关于SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:8Val Asn Arg Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10(10)关于SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:9Val Lys Leu Pro Trp Arg Phe Tyr Gln Val1 5 10(11)关于SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:10Val Trp Thr Ala Cys Gly Tyr Gly Arg Met1 5 10(12)关于SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:11Gly Thr Val Ser Thr Leu Ser1 5(13)关于SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:12Leu Leu Asp Ser Arg Tyr Trp1 5(14)关于SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型
(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:13Gln Pro Ala His Ser Leu Gly1 5(15)关于SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:14Leu Trp Gly Met Gln Gly Arg1 5(16)关于SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽
(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO15Leu Thr Leu Set His Pro His Trp Val Leu Asn His Phe1 5 10Val Ser15(17)关于SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:16Ser Met Gly Pro Asp Gin Thr Leu Arg1 5(18)关于SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是
(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:17Val Asn Leu Thr Trp Ser1 5(19)关于SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:18Cys Arg Arg His Asn Tyr Gly Phe Trp Val Cys1 5 10(20)关于SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否
(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:19Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys1 5 10(21)关于SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:20Cys Thr Arg Leu His Thr Gly Tyr Trp Val Cys1 5 10(22)关于SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的
(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:21Cys Thr Leu Ser Val Phe Gly Tyr Trp Val Cys1 5 10(23)关于SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:22Cys Ser Met Gly Pro Asp Gln Thr Leu Arg Cys1 5 10(24)关于SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:23
Cys Leu Leu Asp Ser Arg Tyr Trp Cys1 5(25)关于SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:24Cys Gln Pro Ala His Ser Leu Gly Cys1 5(26)关于SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:25
Cys Leu Trp Gly Met Gln Gly Arg Cys1 5(27)关于SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:26Cys Gly Thr Val Ser Thr Leu Ser Cysl 5(28)关于SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:27Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys1 5 10Gly Asp Pro Ala15(28)关于SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟否(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:28Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe1 5 10(30)关于SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:29Ile Asn His Arg Gly Tyr Tro Val Cys1 5(31)关于SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:30Arg Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Leu Trp Cys1 5 10(32)关于SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两种(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:31Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys1 5 10Gly Asp Pro Ala15(33)关于SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构两种(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)假拟是(ⅳ)反义否(ⅴ)片段类型内部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:32Gly Glu Phe Cys Arg Arg His Asn Tyr Gly Phe Trp Val1 5 10Cys Gly Asp Pro Ala1权利要求
1．一种免疫原分子包括a)至少一种BSW17模拟型肽组分和b)能引发对上述肽的免疫应答的组分
2．根据权利要求1所述的免疫原分子，其中的BSW17模拟型肽是环状的，由此其末端通过两个附加的半胱氨酸残基形成二硫键而结合在一起或者其末端用化学方法交联；或者其中BSW17模拟型肽是线型的，由此其羧基端氨基酸可以通过酰胺化作用方便地封闭和/或其氨基端氨基酸可以通过乙酰化方便地封闭。
3．根据权利要求1所述的免疫原分子，所说的分子以一种多聚肽或一种重组融合蛋白的形式存在，靠多聚肽中的单体化合物或融合蛋白中的一个配偶体构成BSW17模拟型肽组分，而多聚肽或融合蛋白的剩余部分构成引发免疫应答的组分。
4．根据权利要求1所述的免疫原分子，所说的分子以BSW17模拟型肽和免疫原载体的偶联物的形式存在。
5．根据权利要求1所述的免疫原分子，其中BSW17模拟型肽组分基本上包括选自以下的氨基酸序列Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val(A),Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val(B),Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp(C),Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly(D),Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly(E),Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu(F),Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu(G),Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu(H),Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (I),Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (J),Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (K),Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (L),Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (M),Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (N),Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (O),Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P),Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (Q).
6．一种药物组合物，该组合物包括了据权利要求1-5的任何一项所述的免疫原分子和佐剂。
7．一种配体，该配体包括对如权利要求1-5的任何一项所述的BSW17模拟型肽组分特异的抗体结构域，因此此抗体结构域也与IgE重链上的氨基酸序列反应，IgE包含了被BSW17识别的天然抗原决定基。
8．根据权利要求7所述的配体，该配体以单克隆的抗体或其Fab’或F(ab)2片段形式存在。
9．根据权利要求1所述的免疫原分子的制备方法，该方法包括适当偶联(a)BSW17模拟型肽组分和(b)能引发对此肽的免疫应答的组分。
10．如权利要求1-5中任何一项所述的免疫原分子，用作一种药物来治疗IgE介导的疾病。
11．如权利要求1-5中任何一项所述的免疫原分子在制备一种抗过敏疫苗中的应用。
全文摘要
免疫原分子包含(a)至少一种模拟被单克隆的抗人类IgE抗体BSW17识别的人类IgE上天然抗原决定基的肽组分,和(b)能够针对此肽引发免疫应答的组分。它们在,或对药物组合物的制备,特别是对IgE介导的疾病如过敏症和遗传过敏性皮炎的治疗有用,例如抵抗过敏的疫苗。
文档编号C07K16/44GK1213380SQ97192671
公开日1999年4月7日 申请日期1997年2月28日 优先权日1996年3月1日
发明者F·克里克, B·斯塔德勒 申请人:诺瓦提斯公司