专利名称：新型多肽以及由其制备的抗人类免疫缺陷病毒制剂的制作方法
1.本发明的领域本发明涉及一种或多种对类脂多糖类、尤其是对内毒素具有很强亲合性的新型多肽及其可药用的盐。该多肽可以作为抗病毒剂(例如抗HIV制剂)用于药物组合物中。
2.本发明的背景从王蟹中已经分离出两族对内毒素具有亲合性的抗微生物多肽(参见，例如，shigenaga et al.，1990，J.Biol。Chem.26521350-21354；Kawano et al.，1990，J.Biol.Chem.26515365-15367； Muta et al.，1990，J. Biochem.108261-266；Japanese Laid-Open Patent Publication No.167230/1990；Japanese Laid-Open Patent Publication No.152987/1990；Japanese Laid-Open Patent Publication No.53799/1990；Published Searched Application 500194/1990； Miyata et al.，1989，J. Biochem.106663-668；Akaji et al.，1989，Chem.Pharm. Bull.372661-2664；Tokunaga and Iwanaga，1989，Taisha(Metabolism)26429-439；Shieh et al.，1989，FEBS Lett.252121-124；and Nakamura et al.，1988，J.Biol.Chem.26316709-16713).
其中一族，即鲎素(tachyplesin)族已经从日本王蟹鲎中分离出，已鉴定出三种鲎素，即I、II和III。第二族，即大眼 鲎素(polyphemusin)族已经从美洲王蟹、大眼 鲎中分离出，已鉴定出两种大眼 鲎素，即I和II；其氨基酸顺序如
图1所示。
这两族的多肽都是由17或18个氨基酸残基构成的，其中包括4个共同的不变区和两个二硫键(见图1)。
已经发现在低浓度时鲎素和大眼 鲎素均能抑制革兰氏阴性和阳性细菌以及诸如白假丝酵母等真菌的生长，并与细菌类脂多糖类形成复合物(Shigenaga et al.，1990，J.Biol.Chem.26521350-21354 and Muta et al.，1990，J.Biochem.108261-266)。此外，鲎素族多肽还表现出对诸如流感病毒、泡疹性口炎病毒(Murakami et al.，1991，Chemotherapy，37，327-334)或人类免疫缺陷病毒(Morimoto，et al.，1991，Chemotherapy，37，206-211)等病毒的某种抑制活性。十分有趣的是具有上述特性的这种多肽可能是一种重要物质使得王蟹能够适应其外界环境的变化，并且作为一种古老的生物由古至今保持其种属。
另一方面，就高度进化的人类的生存而言，对于由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)具有预防或治疗作用的药物的研制极为迫切。
考虑到这些多肽与王蟹长期保持其种属有关，本发明人和合作研究者对于组分中具有氨基酸改变或修饰的多肽已经进行了分子结构与抗HIV活性之间关系的研究。结果我们在本发明之前就已经发明了新的多肽，它与王蟹的这些已知多肽的一般结构完全不同。
令人惊奇的发现是那时发明的这些新的多肽具有极高的生物学活性，其抗HIV值要比王蟹已知的多肽高至少5倍以上。
参考了下列文献，Nakashima et al.，1992，Antimicrob.Agents Chemother.，36，1249-1255；Masuda et al.，1992，Biochem.Biophys.Res.Commun.，189，845-850；Tamamura et al.，1993，Chem.Pharm.Bull.，41，978-980；Tamamura et al.，1993，Biochim.Biophys.Acta，1163，209-216；Masuda et al.，1992，J.Pharmacobio.Dyn.，15，s-90；International Laid-Open Publication WO92/04374；JapaneseLaid-Open Patent Publication No.163298/1993。(在下文中，化合物T-22是指在所述新的多肽中代表化合物的具有最佳形式的化合物)正如T-22化合物所示，新的多肽由16至18个氨基酸组成，在研究了表现该多肽活性所必需的结构之后，本发明人和合作研究者得出了有关最低限度基本结构的一些创新的见解。
一般来讲，当服用分子量相对较大的外源性肽进入人体时，人体的自身防御功能通常将其识别为一种异己物质。因此该外源性肽可能变为抗原物质。当用于医疗方面时以肽为基础的生物活性物质可以是低分子量化合物，以便减小被识别为异己物质的可能性，这是很可取的。此外该物质也需要具有高效力。
已知T-22化合物是由18个氨基酸残基组成的多肽。本研究的目的是在减少氨基酸残基数量的同时保持与T-22化合物同等水平的抗HIV效力。结果我们成功地将残基数量减少了4个。只要该化合物具有基本结构，即使是特定的区域发生改变，其活性也不会降低。此外，通过上述改变我们发现了具有这样的基本结构的新型多肽，以致所述结构能提供多种物理化学特性，同时还能提供在治疗方法中的广泛的选择，即亲水性和亲脂性(对脂类的亲合性)的增加/降低、在特定的器官和/或细胞中选择性蓄积和延长/缩短在人体内的潴留时间，以及可能的各种不同的制剂。
3.本发明简述本发明涉及一种或多种新型多肽，它是由根据已知的内毒素高亲和性王蟹多肽发明的具有高抗HIV活性的原新型多肽而衍生的，但两者具有显著的差别。原有的新型多肽由16-18个氨基酸、4个半胱氨酸或2个胱氨酸以及具有以β折回作为转弯位置的β-反向平行片层结构组成。与原有的新型多肽一样，本发明的多肽也具有β-反向平行片层结构，但其β折回可能位于第7位的X处。然而，在本发明的多肽中氨基酸残基和半胱氨酸的数量分别减少了4个和2个。此外，即使是特定的区域有改变，其生物学活性也不会下降。本发明的多肽可以用作抗HIV剂和用作基因治疗的DNA转染系统的一种成份。正如下文中第6部分所详述的那样，本发明多肽的抗HIV值显著高于由已知内毒素高亲合性王蟹多肽衍生出来的原新型多肽。
3.1定义用下面的3个字母的缩写来表示本文中定义的肽顺序中的氨基酸残基和替代氨基酸残基Ala(丙氨酸)；Arg(精氨酸)；Leu(亮氨酸)；Lys(赖氨酸)；Orn(鸟氨酸)；Phe(苯丙氨酸)；Pro(脯氨酸)；Trp(色氨酸)；Tyr(酪氨酸)；Val(缬氨酸)；DArg(D-精氨酸)；DLys(D-赖氨酸)；DOrn(D-鸟氨酸)；Ac-Arg(N-α-乙酰基精氨酸)；FTC-Arg(N-α-荧光素硫代氨基甲酰基精氨酸)；Laur-Arg(N-α-月桂酰基精氨酸)；Mvr-Arg(N-α-肉豆蔻酰基精氨酸)；Nicot-Arg(N-α-烟酰基精氨酸)；Oct-Arg(N-α-辛酰基精氨酸)；Parm-Arg(N-α-软脂酰基精氨酸)；Parm-Orn(N-α-软脂酰基鸟氨酸)；PTC-Arg(N-α-苯基硫代氨基甲酰基精氨酸)；ε-N-Ac-DLys(ε-N-ω-氨基乙酰基-D-赖氨酸)和ε-N-But-DLys(ε-N-ω-氨基丁酰基-D-赖氨酸)。
本文所用的下列术语具有所示的含义HIV＝人类免疫缺陷病毒(包括所有变异株)MOI＝多重感染SI＝选择性指数(CC50对EC50的比值)4.图的简介图1表示鲎素I、鲎素II、鲎素III、大眼 鲎素I和大眼 鲎素II的氨基酸顺序。保留氨基酸用方框标出。Cys-3或-4与Cys-16或-17之间和Cys-7或-8与Cys-12或-13之间的二硫键用实线表示。
图2表示合成本发明多肽的合成方案。
5.本发明的详细描述根据以上几个方面完成了本发明，而且本发明涉及由下式表示的多肽或其盐A1-Trp-Cys-A2-A3-A3-X-A2-A3-A3-Cys-A3-A4SEQ CD NO.1-4)………(I)其中A1是碱性氨基酸残基或具有至少一个或两个选自赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的碱性氨基酸的肽残基；在所述的碱性氨基酸残基或肽残基中，所述氨基酸残基的氨基末端的N-α氢原子可以被酰基或取代的硫代氨基甲酰基所取代，形成N-α酰基取代的碱性氨基酸残基、N-α酰基取代的肽残基、N-α取代的硫代氨基甲酰基取代的碱性氨基酸残基或N-α取代的硫代氨基甲酰基取代的肽残基；A2是酪氨酸或苯丙氨酸残基；A3是赖氨酸或精氨酸残基；A4是-OH(由羧基衍生的)或-NH2(来自酸性酰胺)；X是一种选自由D-鸟氨酰-脯氨酸、脯氨酰-D-鸟氨酸、D-赖氨酰-脯氨酸、脯氨酰-D-赖氨酸、D-精氨酰-脯氨酸、脯氨酰-D-精氨酸、甘氨酰-鸟氨酸、鸟氨酰-甘氨酸、甘氨酰-赖氨酸、赖氨酰-甘氨酸、甘氨酰-精氨酸和精氨酰-甘氨酸代表的肽的肽残基，其中D-赖氨酸、L-赖氨酸、D-鸟氨酸和L-鸟氨酸的ω-氨基的氢原子可以被ω-氨酰基所取代，且所述的肽残基在第6位和第8位上通过本身的肽键与氨基酸残基相连；Trp是色氨酸残基；Cys是半胱氨酸残基；和在第3和第11位的半胱氨酸残基可以通过二硫键相连。
由式(I)表示的本发明的多肽的具体实例见表1，其编号为(1)至(25)。
按照国际上承认的三字母表示法(见上文中3.0部分)，每个符号均表示相应的氨基酸残基。
表11 2 3 4 5 6 7 89 10 11 12 13(I)A1-Trp-Cys-A2-A3-A3- X - A2- A3-A3-Cys- A3-A4(1)Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(2)Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(3)Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys- Lys-Gly-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(SEQ ID NO.5)(4)Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys- Lys-Gly-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(SEQ ID NO.6)(5)Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Pro-DLys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(6)Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DOro-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(7)Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-pro-DArg-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(8)Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys- Gly-Lys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(SEQ ID NO.7)(9)Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys- Arg-G1y-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(SEQ ID NO.8)(10)Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys- Gly-Arg-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(SEQ ID NO.9)(11)Lys-Arg-Trp-Cys-Tyr-Lys-Arg-DLys-Pro-Tyr-Lys-Arg-Cys-Arg-NH2(12)Lys-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Lys-DLys-Pro-Phe-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(13)Arg-Lys-Trp-Cys-Tyr-Lys-Arg-DLys-Pro-Tyr-Arg-Arg-Cys-Lys-NH2(14) Ac -Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(15) Oct -Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(16) Lanr -Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(17) Myr -Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(18) Parm -Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(19) FTC -Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(20) PTC -Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2(21) Nicot-Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-DLys-Pro-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2
具有抗HIV高活性的上述多肽由16-18个氨基残基组成。在最佳形式的化合物(在下文中缩写为“n-18多肽”或T-22)中，认为对于表现出高活性的结构因子必需有4个半胱氨酸残基。4或5个芳香族氨基酸残基、8个碱性氨基酸残基和一个甘氨酸残基存在。此外，关于下面式(A)中所示的n-18多肽的位置关系方面，第2位至第17位的氨基酸残基的特性是固定不变的。在n-18多肽的第1位上发现了构效关系，即随着氨基酸残基数量的增加，抗HIV活性的相对值也升高。
n-18多肽表示为下式(A)A1-A2-Cys-A2-A3-A3-Cys-A2-A3-Gly-A2-Cys-A2-A3-A3-Cys-A4-A5(SEQ ID NO.10-12)……(A)其中，A1不超过两个氨基酸，选自赖氨酸和精氨酸；A2是酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸残基；A3是精氨酸或赖氨酸残基；A4是至少1个而且不超过2个氨基酸，选自赖氨酸和精氨酸；A6是-OH(来自羧基)，或-NH2(来自酰胺基)；Cys是半胱氨酸残基；和Gly是甘氨酸残基。
在一个具体实施例中，在第3和第16位的半胱氨酸残基和/或在第7位和第12位的半胱氨酸残基可以通过二硫键(-S-S-)相连。
在n-18多肽中，具有可能的β折回结构的转弯位置位于第9和第10位，因此第3位至第8位的肽部分与第11位至第16位的肽部分是面对面的。
如n-18多肽一样，由于分子内氢键和半胱氨酸残基间的二硫键(-S-S-)的存在，本发明的多肽也具有反向平行β-片层结构。但是在本发明的多肽中，具有可能的β折回结构的转弯位置位于第7位的X，所以第3位至第6位的肽部分与第8位至第11位的肽部分是面对面的。
在本发明中，在本发明结构式的第一位上的氨基酸残基的数量关系与n-18多肽是相同的。
已经证实在上述位置上，N末端氨基酸残基的α-氨基的氢原子被酰基或取代的硫代氨基甲酰基所取代，对于由所述代表式所表示的新型多肽表现出抗HIV高活性是很重要的。通过选择不同特性的酰基或取代的硫代氨基甲酰基使本发明新型多肽具有亲水性、亲脂性、明显的荧光特性等，这已经成为可能。例如，本发明多肽中荧光素取代的硫代氨基甲酰基的荧光特性可作为高敏感的显示染料用于各种目的。参见，例如Brand and Witholt in“Methods in Enzymology”，Vol.11，page 776-856，ed.by Hits，Academic Press，New York，New York(1967)；Brand andGohlke，1972，Annu.Rev.Biochem.41843-868；Stryer，1978，Annu.Rev.Biochem.47819-846。
此外，本发明的荧光素取代的硫代氨基甲酰基化多肽能够表现出更高的抗HIV活性，这一点很重要也很有用。具有荧光特性的上述本发明多肽在阐明本发明多肽抗HIV活性的表现机理方面可以作为重要的工具。例如，可以用荧光显微镜法检测用药后受HIV感染或未感染的机体、器官、组织或细胞内该多肽的寿命、代谢或分布。采用该多肽的体内荧光探针可以从分子水平上获得有关该多肽细微的构型变化与细胞内受体分子相互作用方面的信息。采用荧光探针也有可能分离和鉴定受体分子本身。
此外，通过酰基或取代的硫代氨基甲酰基，使新型多肽具有诸如糖链化合物、脂化合物、核酸化合物、其它种类的肽或蛋白质等化合物的生物活性，这已经成为可能。在本发明的代表式的第4至第6位和第8至第10位上的氨基酸残基的特性是相同的重复，这一点在本发明新型多肽的活性表现方面发挥重要的作用。至于本发明新型多肽立体结构的形成，肽的氨基酸顺序很重要，它很容易在相反方式的同一平面结构中形成在第3至第7位和第7至11位上所表现出来的肽结构部分，而且容易形成由作为转弯点的第7位上的X所代表的两个氨基酸组成的肽残基。当第3位和第7位上的半胱氨酸以二硫键相连时，由本发明新型多肽的肽主干形成的下述的三维立体结构是本发明的重要特征。也就是说，在第7位上的肽残基X的折返结构对于形成具有β-片层结构的同一平面结构是必需的要素，其中肽残基X由一对甘氨酸和碱性氨基酸或者一对脯氨酸和D-构型的碱性氨基酸(原则上讲可用具有相同作用的脯氨酸来替代羟脯氨酸)组成。连接第3位和第11位上半胱氨酸残基的二硫侧链和在第5位及第9位上的碱性氨基酸残基的碱性侧链位于主干平面的同一侧，而第4位和第8位上的芳香族氨基酸残基的芳香族侧链和第6位及第10位上的碱性氨基酸残基的碱性侧链却位于主干平面的对侧。上述的这些立体结构的形成很重要。因此，发明了具有这样的立体结构的上述代表式所表示的新型多肽，与n-18多肽相比减少了4个氨基酸残基。
此外，与n-18多肽一样，本发明多肽表现出强碱特性。因为本发明多肽是碱性的，通过酸加成可以生成盐。例如，本发明多肽可与无机酸或有机羧酸形成盐。无机酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸等；有机羧酸包括醋酸、卤代乙酸、如三氟乙酸、丙酸、马来酸、琥珀酸、苯果酸、柠檬酸、酒石酸、水杨酸。本发明多肽还可与酸性糖、酸性多糖或有机磺酸形成盐。酸性糖包括葡糖醛酸、半乳糖醛酸、葡糖酸、抗坏血酸等；酸性多糖包括玻璃葡醛酸、软骨素硫酸酯、藻酸等；有机磺酸包括甲磺酸、对-甲苯磺酸等，还包括诸如软骨素硫酸酯这样的磺酰糖酯。
下面是本发明新型多肽的更详细介绍。
5.1多肽的制备本发明新型多肽可以用本技术领域内所熟知的方法来制备，例如在“Solid-Phase Peptide Synthesis”，Stewart&Young，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)介绍的固相合成技术。也就是说，将第12位上N-保护的精氨酸的羧基与不溶性树脂相连便可获得具有上式(I)的本发明的直链多肽，其中不溶性树脂含有直接相连的氨基，或者含有通过具有能与羧基相连的功能基团(例如，能将精氨酸的羧基转变成对-羧甲基苄酯的功能基团)的隔离物相连的氨基。具有第12位精氨酸(Arg)的不溶性树脂的氨基在N-保护基去保护之后按照固相法能够依次地与由下式(I)表示的氨基酸顺序中第11位至第1位的各自的被保护氨基酸相连接12 3 4 56 7 8 9 10 11 12 13A2-Trp-Cys-A2-A3-A3-X-A2-A3-A3-Cys-A3-A4(SEQ ID NO.1-4)………(I)其中A1、A2、A3、A4、Cys、Trp和X的定义同上述式(I)。
当A1选用N-α酰基氨基酸残基或N-α酰基肽残基(这时氨基末端氨基酸残基的N-α位置上的氢原子被酰基取代)时，所述的肽树脂的N末端氨基通过使用缩合剂相应的酸酐或相应的酸使其酰基化形成N-酰基肽树脂。然后裂解不溶性树脂和氨基酸上的保护基团，即可获得具有上式(I)的本发明直链多肽。当上述式(I)中的A1选用N-α-取代的硫代氨基甲酰基氨基酸残基或者N-α-取代的硫代氨基甲酰基肽残基(这时氨基末端氨基酸的N-α位置上的氢原子被取代的硫代氨基甲酰基所取代)时，通过在弱碱条件下与取代的异硫氢酸酯化合物反应即可获得本发明的N-末端N-α-取代的硫代氨基甲酰基多肽。
在本例中，第12位氨基酸残基的羧基末端可以是游离的(A对应于-OH)或者是被转变成酰胺(A4对应于-NH2)形式。此外，在获得的多肽中，第3和第11位上两个半胱氨酸可用通过其两个巯基形成二硫键(-S-S-)。
例如，这些二硫键可以通过空气氧化或者用Atherton，E.，etal.，1985，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1,2065的方法形成。
除非另外说明，在上述固相合成法中所用的单个氨基酸均是L-构型，用X表示的与第7位上的脯氨酸偶联的碱性氨基酸仅限于D-构型。
任何含有氨基的不溶性树脂均可用于本发明新型多肽的合成，只要它能够通过本身的氨基与C-末端上N-保护的精氨酸或赖氨酸的羧基相连，或者在某些情况下与隔离物的羧基相连，并且在其后能够被除去。这些不溶性树脂的例子包括(但并不局限于)氨甲基树脂(氨甲基化的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)、二苯基甲胺树脂、甲基二苯基甲胺树脂和氨甲基苯氧甲基树脂及它们的衍生物。当采用二苯基甲胺树脂、甲基二苯基甲胺树脂、二甲氧基二苯基甲胺(DMBHA)树脂或氨甲基苯氧甲基树脂时，裂解后便可直接获得酰胺，但是考虑到产量，氨甲基树脂是优选的。
作为含有能与羧基相连的功能基或含有羧基的隔离物，例如，一个实例是能将精氨酸的羧基转变成对-羧甲基苄酯的隔离物，但是对于隔离物并没有特别的限制。
保护的氨基酸是指其功能基可以采用本专业熟知的方法用保护基加以保护的氨基酸，或者在市场上也可以买到的各种保护的氨基酸。专业技术人员都知道在多肽合成方法中需要采用保护基来稳定氨基酸的不稳定侧链，以防止侧链在合成过程中发生化学改变。
用于氨基酸α氨基的保护基选自下列基团，它们包括(但不限于)Boc(特丁氧基羰基)或Fmoc(9-芴甲氧基羰基)。用于精氨酸(Arg)胍基的保护基选自下列基团，它们包括(但并不局限于)Tos(甲苯磺酰基)、NO2(硝基)、Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)或Pmc(2，2，5，7，8-五甲基-色满-6-磺酰基)。用于半胱氨酸(Cys)巯基的保护基可以选自下列基团，它们包括(但并不局限于)Bzl(苄基)、MBzl(4-甲氧基苄基)、4-MeBzl(4-甲基苄基)、Acm(乙酰氨基甲基)、Trt(三苯甲基)、Npys(3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)、t-Bu(特丁基)或t-Bus(特丁硫基)；其中MBzl、4-MeBzl、Trt、Acm和Npys是优选的。用于酪氨酸(Tyr)羟基的保护基选自下述基团，它们包括(但并不局限于)Bzl、C12Bzl(2，6-二氯苄基)或t-Bu。该羟基也可以不保护。用于赖氨酸(Lys)ε-氨基的保护基选自下述基团，它们包括(但并不限于)Z(苄氧基羰基)、CIZ(2-氯-苄氧基羰基)、Boc或Npys。在第7位上含有X的D-或L-赖氨酸侧链ε-氨基的氢原子的情况下，该氨基可以用上述的ZCIZ、Boc或Npys基团来保护。优选的是从这些保护基中选择一个已知适用于该合成条件的适宜保护基。
保护的氨基酸的偶联可以按照本领域熟知的缩合方法进行，例如DCC(二环己基碳化二亚胺)法、DIPCDI(二异丙基碳化二亚胺)法[Tartar，A.et al.，1979，J.Org.Chem.445000]、活性酯法、混合或对称酸酐法、羰基二咪唑法、DCC-HOBt(1-羟基苯并三唑)[knig W.et al.，1970，Chem.Ber.，103788，2024，2034]或二苯膦酰基叠氮化物法。优选的是使用DCC法、DCC-HOBt法、DIPCDI-HOBt法或对称酸酐法。缩合反应可以在诸如二氯甲烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或它们的混合溶剂等的有机溶剂中进行。采用诸如三氟乙酸/二氯甲烷、HCl/二噁烷、呱啶/二甲基甲酰胺(DMF)或NMP这些去保护剂除去α-氨基的保护基。采用E.Kaiser et al.，1970，Anal.Biochem.，34，595(水合茚满三酮反应法)的方法来监测合成中每一步骤的缩合反应进行程度。
按照上述方法可以获得具有所需氨基酸顺序的保护的肽树脂。当氨甲基树脂衍生物用作不溶性树脂时，可以采用例如在适当的溶剂中用氨处理保护的肽树脂的方法将保护的多肽从树脂上分离。然后将所得的保护的肽用氟化氢处理便获得上式表示的多肽酰胺，并且使所有的保护基游离。当将二苯基甲胺树脂、甲基二苯基甲胺树脂、氨甲基苯氧甲基树脂或DMBHA树脂[Funakoshi，S.et al.，1988，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，382]用作不溶性树脂时，可以将保护的肽树脂用氟化氢、TFMSA(三氟甲磺酸)[Yajima，H.et al.；“The Peptides”Vol.5，page 65(1983)，published by Academic Press，edited by E.Gross；]，TMSOT f(三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸)[Fujii，N.et al.，1987，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，274]或TMSBr(三甲基甲硅烷基溴)[Fujii，N.et al.，1987，Chem，Pharm.Bull.，35，3880]等处理，使多肽从树脂上分离，并可以同时从多肽上除去保护基团。
在优选的实施例中，将所得的多肽用2-巯基乙醇、DTT(二硫代-苏糖醇)等还原，以确保半胱氨酸的巯基处于还原形式。继而可以将巯基氧化，获得环状多肽。
可以采用熟知的方法进行氧化处理，通常采用如空气或氰铁酸盐(例如，氰铁酸钾)这样的氧化剂。
本发明多肽还可以采用另一种方法生产，即重组DNA技术。因此，可以用本专业熟知的技术将本发明多肽的核苷酸编码序列进行克隆和表达。参见，例如，Maniatis et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSprmg Harbor，NY，1991.
本发明多肽可以用多肽领域中熟知的方法来分离和纯化，例如，萃取法、重结晶法、各种色谱法(凝胶过滤、离子交换、分配、吸咐、反相等色谱片)、电泳法、逆流分配法等，其中反相高效液相色谱最为有效。
5.2多肽的用途由式(I)表示的本发明多肽具有与内毒素结合的能力，抗菌活性以及使内毒素敏感血细胞溶血的活性。此外，本发明多肽还具有抗病毒活性。在一个具体的实施例中，本发明多肽具有抗HIV活性。在下文的第6部分中将会详述，本发明多肽所表现出的抗HIV活性要显著高于已知的内毒素高亲合性多肽(例如，鲎素I、II或III，或者大眼 鲎素I或II)。
能够将DNA有效地导入靶细胞的转运系统方面最新进展已经使遗传病、癌症、AIDS病等的人类基因治疗成为现实[Morganand Anderson，Annu.Rev.Biochem.，62,191-217(1993)]。
DNA转染系统包括采用多聚阳离子、磷酸钙、脂质体融合、逆转录病毒、显微注射、电穿孔和原生质体融合。然而，所有这些方法均存在关于细胞毒性、增殖性差、不方便或DNA转运效率低等方面的一个或多个问题[Flegner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413-7417(1987)]。
近来已经报道了使用阳离子脂类-DNA复合物或环状两歧性肽-DNA复合物的高效DNA转染方法[Legendre and Szoka，Jr.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，893-897(1993)]。能与DNA形成转染复合物的肽包括苏联克杀汀S、短杆菌酪素、多粘菌素B、聚赖氨酸和蜂毒素，均具有阳离子特性。其中最为有效的阳离子肽是苏联克杀汀S，现已知它是具有β-片层构型的两歧性环状十肽抗生素，并且能穿透和分解细胞膜。带正电荷的和具有两歧特性的苏联克杀汀S对于高效转染均认为是很重要的。考虑到这些结构特征，本发明多肽在用于具有高效转染能力的DNA复合物时可以作为苏联克杀汀S的一种替代备选物，这是因为该多肽具有β-片层构型并表现出强阳离子性和两歧特性。
实际上，鲎素I是本发明多肽的一种亲本分子，它能够像苏联克杀汀S一样穿透细胞膜以及与DNA结合[Matsuzaki et al.，Biochem.Biophys.Acta，1070，259-264(1991)and Yonezawa etal.，Biochemistry，31，2998-3004(1992)]。此外，T-22(一种本发明多肽(1))的溶液结构已被证实具有两歧性反向平行β-片层结构，与鲎素I结构十分相似[Tamamura et al.，Biochem.Biophys.Acta，1l63，209-216(1993)]。
因此，本发明多肽可以用作基因治疗中DNA-转染系统的一种成份。
因此本发明多肽可以用于药物组合物中所述药物组合物含有本发明多肽或其盐和根据该药物组合物的服用方法和服用形式而选择的药用载体。药用载体可以是诸如Hank′s或Ringer′s液、生理盐水、盐水葡萄糖混合液和肝素化柠檬酸钠-柠檬酸-右旋糖溶液这样的生理性缓冲液。该药物组合物根据治疗目的可以是口服或非肠道给药，根据服药方法采用适当的药用载体可以将其制备成诸如粉剂、粒剂、注射或口服用溶液、片剂、栓剂、阴道栓剂、软膏、乳剂或雾剂等制剂。
当药物组合物作为注射剂直接为病人给药时，本发明多肽或其盐可作为生理盐水中的溶液连续或间歇地静脉点滴给药，其用量为每日每公斤体重10至5,000mg。
6.实施例用下列实施例进一步具体说明本发明，而不是限制本发明。
在本文的实施例中，介绍了多肽(1)的合成。此外，公布了本发明多肽和已知的高内毒素亲合性多肽的抗HIV活性检测的结果。本发明多肽的抗HIV活性要显著高于已知的高内毒素亲合性多肽。
用于下述实施例的仪器和试剂如下HPLC仪器Shimadzu Corporation，Model LC-6AD仪器的柱Asahipak ODP-90(Asahi ChemicalIndustry Co.，Ltd.
Fmoc氨基酸和氨基树脂由WatanabeChemical Industries，Ltd.生产缩合剂由日本Peptide Institute INC.andApplied Biosystems生产FAB-MS(FAB-质谱仪)VC CO.(USA)，Model ZAB-SE6.1.实施例1多肽(1)的合成在下文的6.1.1-6.1.7部分介绍具有下式的多肽(1)的合成。用相似的方法合成多肽(2-13，22，23)和多肽的前体肽(14-21，24，25)(见上文说明结构的表1)。 在上面的式(1)中，Arg、Trp、Cys、Tyr、Lys、DLys和Pro代表前述的氨基酸残基，第3和第11上的Cys之间的实线代表二硫键。
6.1.1.将Fmoc-DMBHA-CH2CH2COOH导入氨甲基树脂[(3-(α-Fmoc-氨基-4-甲氧苄基)-4-甲氧苯基)丙酸]将270mg(0.2mM)的氨甲基树脂(0.74meq/g)和268.5mg(0.5mM，2.5eq)的Fmoc-DMBHA-CH2CH2COOH(MW537)装入固相合成柱中，按照Guo L.et al.[Chem.Pharm.Bull.，36，4989(1988)]的方法采用DIPCDI-HOBt法在DMF中进行缩合反应2小时。
缩合反应完成后，采用乙酸酐进行偶联(DMBHA树脂)以保护的游离的氨基。
6.1.2.将第12位上的精氨酸引入DMBHA树脂用20％的哌啶/DMF将Fmoc基从上述6.1.1.部分中制备的DMBHA树脂上除去之后，加入2.5当量(eq)的Fmoc-Arg(Pmc)-OH(按DMBHA树脂计算)，再按照DIPCDI-HOBt法在DMF中进行缩合反应。
按照Kaiser，E.et al.[Anal.Biochem.，34,595(1970)的水合茚三酮试验通过测定来监测缩合反应的进行程度。
6.1.3.第11位上半胱氨酸的导入用20％的哌啶/DMF将Fmoc基从上述6.1.2中制备的DMBHA树脂上除去之后，加入2.5(eq)(按DMBHA树脂计)的Fmoc-Cys(Trt)-OH，采用DIPCDI-HOBt法在DMF中进行缩合反应。与上述6.1.2相似，按照水合茚三酮试验通过测定来监测缩合反应的进行程度。
6.1.4.第10位至第1位的氨基酸的导入如上述，将Lys(Boc)、Arg(Pmc)、Tyr(tBu)、Pro、DLys(Boc)、Lys(Boc)、Arg(Pmc)、Tyr(tBu)、Cys(Trt)、Trp、Arg(Pmc)和Arg(Pmc)顺序导入DMBHA树脂获得保护基-保护的肽(1)树脂。
固相合成中的每一个氨基酸的缩合反应均按照表2的操作条件进行。表2
6.1.5.通过除去保护基、从树脂上分离多肽(1)和部分纯化来制备多肽(1)
保护基-保护的多肽(1)树脂经20％的哌啶/DMF处理除去Fmoc基，然后在每100mg该树脂1M TMSOTf-苯硫基甲烷/TFA(三氟乙酸)系统[在间甲酚(100eq)和乙二硫醇(300eq)存在下，10ml三氟醋酸]中于25℃进行反应2小时。从反应混合液中滤去树脂，用1ml三氟乙酸洗涤两次。继而向滤液和洗涤液的混合液中加入100ml冰冷却的无水乙醚。将形成的沉淀离心，用倾析法将剩余物与上清液分离。所得剩余物用冷乙醚洗涤，并溶解于10ml的4N AcOH中，再加入830mg，(80eq)二硫代苏糖醇。混合液在室温下搅拌过夜。
将反应溶液离心，用Sephadex G-10(3.7×5cm)和用4N乙酸(AcOH)凝胶过滤处理上清液，收集流过Sephadex的组分作为流出液的主要部分，将其冻干获得粉末状物，即部分纯化的非环化的多肽(1)。
6.1.6.用空气氧化法制备多肽(1)用浓缩氨水将Sephadex凝胶过滤的半量流出组分调整至pH7.5，充气进行空气氧化完成环化反应。空气氧化完成之后将环化的多肽(1)吸咐到10g Diaion HP-20树脂上，继而用60％CH3CN(在1NAcOH中)洗脱。洗脱液在窒温下减压浓缩以除去CH3CN，然后冻干形成粉末。将粉末溶解于少量水中，并将溶液倾入Asahipak ODP-90柱中用高效液相色谱法(HPLC-Model LC-6AD，由Shimadzu Corp.制造)经CH3CN进行梯度洗脱来纯化，获得产量为27％[按保护基-保护的多肽(1)树脂计算]的单峰多肽(1)。
6.1.7.多肽的分析按照Liu et al.[J.Biol.Chem.，251，1936(1976)]的方法酸水解后的氨基酸成份和6.1.6.部分中纯化的多肽经亮氨酸氨基肽酶消化而得到的氨基酸成份与根据式(1)氨基酸顺序计算的成份值的范围十分符合。
此外，由FAB－MS得出的分子量数值为1996.3，而[M＋H]+的计算值为1996.1。
所得多肽的特异性旋转[α]20D为-17.2°[C＝0.11，1N醋酸]。
6.2实施例3多肽(14)的合成[多肽(1)的氨基末端氨基酸残基的N-α-酰基化]在6.2.1-6.2.2部分中介绍下式(9)的多肽(14)的合成[式9] 在以上式(14)中，Ac-Arg、Arg、Trp、Cys、Tyr、Lys、DLys和Pro代表前述的氨基酸残基，第3和第11位上Cys之间的实线代表二硫键。
6.2.1部分保护基-保护的肽(1)树脂的酰基化取1.301g(0.25mM)的上述实施例1的步骤(4)(6.1.4部分)中获得的保护基-保护的肽(1)树脂置于手工固相合成反应器中。除去Fmoc基后，按照Hudson法[J.OrgChem.，53，617(1988)]将N-末端氨基酰基化，获得1.241g N-末端α-氨基酸-酰基化的保护基-保护的肽(1)树脂(干重产量为100％)。该方法总结于下表3。
表3 *1BOP试剂六氟磷酸-笨并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-盐重复以上操作1至3进行酰基化，直至水合茚三酮反应不再显阳性。
6.2.2通过除去N-末端氨基酸-酰基化的保护基-保护的肽(1)树脂的保护基和树脂部分纯化和氧化来制备肽(14)用与上文中6.1.5和6.1.6介绍的相同的方法制备多肽(14)。多肽(14)的旋光度为[α]20D为-18.3°(C＝0.08，1N醋酸)。按照Liu et al.[J.Biol.Chem.，251,1936(1976)]的方法在含有0.2％色胺的4M甲磺酸中于115℃将多肽(14)酸水解24小时。氨基酸分析结果与计算值十分符合。
6.3实施例4多肽(19)的合成[N-α-荧光素硫代氨基甲酰基多肽(1)]通过多肽(1)的氨基末端氨基酸残基的N-α-荧光素硫代氨基甲酰化来合成下式(10)的多肽(19)。[式10] 在以上式(19)中，FTC-Arg、Arg、Trp、Cys、Tyr、Lys、DLys和Pro代表上述的氨基酸残基，第3和第11位上的Cys之间的实线代表二硫键。
将10mg(3.9μM)6.1.6中获得的多肽(1)的乙酸盐溶解于1ml PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.5)中。将溶解于1ml DMSO中的2.8mg(7.2μM)的荧光素异硫氰酸酯(FITC)异构体-I(Wako Pure Chemical Inc.，Ltd.)在冰冷却条件下加入上述溶液中。在室温下搅拌6至7小时后游离氨基被荧光素硫代氨基甲酰基化。
将反应混合液装入Sephadex G-25(细)柱[用50mM PB(磷酸盐缓冲液)，pH4.2预平衡]，预先除盐和分馏肽组分吸咐于带有ENV滤芯柱的Sep-Pak C18(Millipore Co.)上，用80％的乙腈/乙酸水溶液(pH4.2)洗脱，然后冻干，获得3.93mg的多肽(19)的乙酸盐(产量，35％)。
获得的多肽(19)的乙酸盐的旋光值为[α]20D-5.9°(C＝0.06，H2O)。
按照Liu的方法进行的该化合物酸水解物的氨基酸分析表明精氨酸残基的观察值低于多肽(1)的计算值。
该化合物在三氟乙酸中的部分酸水解物(室温2小时)进行薄层色谱分析(正丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1)，检出一主斑点，它对应于FTH-Arg(荧光素精氨酸硫代海因)的斑点。
这些分析结果表明N-未端精氨酸残基的α-氨基选择性地被荧光素硫代氨基甲酰基化。
6.4实施例2和对照实施例1和2对人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗病毒活性按照下列方法测定和评价了实施例1中合成的多肽(1)对HIV的抗病毒活性。
经感染后的HIV感染MT-4细胞(2.5x 104个细胞/孔，多重感染(MOI)0.001)与各种不同浓度的检测物质一起立即加入96孔微量滴定板中。CO2培养箱中37℃培养5天后用MTT法[Pauwels et al.；J.Virol.Methods，20，309-321(1998)]测定存活细胞的数量。抗病毒活性用化合物能抑制50％由HIV感染造成的细胞死亡时的浓度(EC50；50％有效浓度)来表示。另一方面，为了解检测物质对MT-4细胞的细胞毒性，将未经病毒感染的细胞与各种不同浓度的检测化合物一起按上法培养。细胞毒性表示为由检测物质造成的50％细胞毒性的浓度(CC50)。此外，CC50对EC50的粗比值(CC50/EC50)作为有效比值(SI)。
下面的式8代表用于与多肽(1)进行比较的肽抗病毒剂式8(Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH2......T-22)表4给出了多肽(1)、上述肽(T-22)和抗-HIV剂AZT的EC50、CC50和SI值。表4
从上表明显可见本发明多肽(1)具有与T-22相同的细胞毒性，该多肽(1)的抗HIV活性已经阐明，但浓度仅为T-22的三分之一时却呈现出与之相同的抗病毒活性。即使已从该肽中除去4个氨基酸残基，使其分子量减小，但本发明多肽仍表现出更高的活性。
与叠氮基胸苷(AZT)相比较，多肽(1)的EC50值稍高些，但其细胞毒性极低。因此本发明多肽应该可以用作更安全的抗HIV剂。
6.5实施5多肽的特性及其抗HIV活性表5列出了用实施例1、3和4的方法制备的本发明多肽的结构式和特性。表5还列出了按照实施例2的方法检测和评价的多肽的抗HIV活性。
表5 *(SEQ ID N0.5)
除非特别说明，上表中所表示的实施例化合物中第3和第11位上Cys是以二硫键相连的。此外，在上表中“AZT”代表叠氮基胸苷(通常称为Zidovudine)，T-22代表式8表示的多肽。本发明提供了对人类免疫缺陷病毒(HIV)具有抗病毒活性的新多肽，它具有亲水性、亲脂性及更高的活性，并且可用于阐明抗HIV活性的表现机理。
权利要求
1.由下式表示的多肽及其盐12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13A1-Trp-Cys-A2-A3-A3-X-A2-A3-A3-Cys-A3-A4(SEQ ID NO.1-4)其中A1是碱性氨基酸残基或具有至少一个或两个选自赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的碱性氨基酸的肽残基；在所述的碱性氨基酸残基或肽残基中，所述氨基酸残基的氨基末端的N-α氢原子可以被酰基或取代的硫代氨基甲酰基所取代，形成N-α酰基取代的碱性氨基酸残基、N-α酰基取代的肽残基、N-α取代的硫代氨基甲酰基取代的碱性氨基酸残基或N-α取代的硫代氨基甲酰基取代的肽残基；A2是酪氨酸或苯丙氨酸残基；A3是赖氨酸或精氨酸残基；A4是-OH(由羧基衍生的)或-NH2(来自酸性酰胺)；X是一种选自由D-鸟氨酰-脯氨酸、脯氨酰-D-鸟氨酸、D-赖氨酰-脯氨酸、脯氨酰-D-赖氨酸、D-精氨酰-脯氨酸、脯氨酰-D-精氨酸、甘氨酰-鸟氨酸、鸟氨酰-甘氨酸、甘氨酰-赖氨酸、赖氨酰-甘氨酸、甘氨酰-精氨酸和精氨酰-甘氨酸代表的肽的肽残基，其中D-赖氨酸、L-赖氨酸、D-鸟氨酸和L-鸟氨酸的ω-氨基的氢原子可以被ω-氨酰基所取代，且所述的肽残基在第6位和第8位上通过本身的肽键与氨基酸残基相连；Trp是色氨酸残基；和Cys是半胱氨酸残基。
2.权利要求1的多肽及其盐，其中A1是至少一个碱性氨基酸，它选自赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。
3.权利要求1的多肽及其盐类，其中A1是两个碱性氨基酸的肽残基，其中所述的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。
4.权利要求1的多肽及其盐，其中A1是至少一个或两个被酰基或取代的硫代氨基甲酰基N-α取代的碱性氨基酸残基，其中该氨基酸氨基末端的N-α氢原子被酰基或取代的硫代氨甲基酰基所取代。
5.权利要求1的多肽及其盐，其中第3和第11位上的半胱氨酸残基是通过二硫键相连。
6.A1是碱性氨基酸残基或具有至少一个或两个选自赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的碱性氨基酸的肽残基；在所述的碱性氨基酸残基或肽残基中，所述氨基酸残基的氨基末端的N-α氢原子可以被酰基或取代的硫代氨基甲酰基所取代，形成N-α酰基取代的碱性氨基酸残基、N-α酰基取代的肽残基、N-α取代的硫代氨基甲酰基取代的碱性氨基酸残基或N-α取代的硫代氨基甲酰基取代的肽残基；A2是酪氨酸或苯丙氨酸残基；A3是赖氨酸或精氨酸残基；A4是-OH(由羟基衍生的)或-NH2(来自酸性酰胺)；X是一种选自由D-鸟氨酰-脯氨酸、脯氨酰-D-鸟氨酸、D-赖氨酰-脯氨酸、脯氨酰-D-赖氨酸、D-精氨酰-脯氨酸、脯氨酰-D-精氨酸、甘氨酰-鸟氨酸、鸟氨酰-甘氨酸、甘氨酰-赖氨酸、赖氨酰-甘氨酸、甘氨酰-精氨酸和精氨酰-甘氨酸代表的肽的肽残基，其中D-赖氨酸、L-赖氨酸、D-鸟氨酸和L-鸟氨酸的ω-氨基的氢原子可以被ω-氨酰基所取代，且所述的肽残基在第6位和第8位上通过本身的肽键与氨基酸残基相连；Trp是色氨酸残基；Cys是半胱氨酸残基；和第3和第11位上的半胱氨酸残基通过二硫键相连。
7.一种用于抑制病人体内HIV活性的药物组合物，其中含有有效量的权利要求1的多肽或其盐和药用载体。
8.一种用于抑制病人体内HIV活性的药物组合物，其中含有有效量的权利要求6的多肽或其盐和药用载体。
全文摘要
由下式表示的多肽。其中A上述多肽可用于药物组合物中作为抗微生物或抗病毒剂，尤其可作为抗HIV剂和作为基团治疗中DNA传染系统的一种成分。
文档编号C07K7/08GK1116427SQ94190947
公开日1996年2月7日 申请日期1994年10月12日 优先权日1993年10月14日
发明者松本章义, 胁道典 申请人:生化学工业株式会社