用于长时间持续释放人类抗体的多层可注射自组装肽脚手架水凝胶的制作方法
【专利说明】用于长时间持续释放人类抗体的多层可注射自组装肽脚手 架水凝胶
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年3月14日递交的美国临时申请第61/782, 791号的权利。上 述申请的全部教导通过引证在此全部并入本文。 技术背景
[0003] 由于自20世纪60年代开始，控制释放主要集中在聚合物水凝胶和动物衍生的生 物材料，因此使用水凝胶作为药物传递载体已经被研究过了。但是，由合成聚合物组成的水 凝胶由于以下原因不能代表生物医学应用的理想系统：（i)组分和降解产物的毒性（例如， 许多聚合物需要利用有毒的交联剂，例如戊二醛，及其他能够威胁生命的化学试剂，例如聚 乙醇酸-聚乳酸及其类似物，在降解过程中局部释放酸），（ii)后凝胶化聚合物膨胀常常会 导致宿主疼痛，和（iii)由于聚合物网络的大孔，活性聚合物在较短的时间内释放。
[0004] 而且，在实际涉及人体的临床应用中不会考虑从动物体提取的生物聚合物，例如， 胶原蛋白、明胶、纤维蛋白和粘连蛋白t1'2'3'4]，这是由于这些生物聚合物的来源和具有引发 宿主对可能存在于供体组织中的病毒、细菌及其他未知物质的炎症性反应的风险。为了满 足生物相容性药物释放系统的需要，研发了可生物降解的合成聚合物[ 5'1'2'3]。尽管对新型 水凝胶系统进行了广泛的研究和持续的研发，但是这些挑战没有被完全攻克。
[0005] 之前，研究了由肽ac_(RADA)4_C0NH2 (其中，R是精氨酸，A是丙氨酸并且D是天 冬氨酸）自组装组成的纳米纤维水凝胶对小模型药物分子的控制释放[9]。在近期研究中 已经表明，具有不同分子量和等电点的蛋白质可以通过ac- (RADA) 4-〇)册12肽水凝胶缓慢释 放，并且研究了在3个月时间内的释放动力学[ 1(：]。自组装肽水凝胶是可注射的，这是由于 他们可以在体内随着肽溶液和生物液体的相互作用形成。在被引入电解质溶液过程中，自 组装肽形成直径在10纳米-20纳米之间的纳米纤维，这近一步组织形成含水率高达99. 5 % (重量/体积）的脚手架水凝胶，并且形成的小孔直径在5纳米-200纳米之间[n]。肽的凝 胶化不需要有害的材料（例如毒性交联剂）来引发溶胶-凝胶变化，并且这种水凝胶的降 解产物是天然氨基酸，这种天然氨基酸可以被代谢并被身体重新利用。溶胶-凝胶变化在 生理条件下进行的事实促进了肽溶液与生物活性分子的混合，并且以一种组织特异性方式 被共同注射，在组织中形成药物传递载体。根据分子设计，肽脚手架水凝胶是生物相容的， 并且已经被用于许多组织工程应用，包括骨和软骨再造、神经元的和心脏组织再生、伤口愈 合、血管生成和止血[ 12'13]。自组装肽水凝胶提供了一种平台，该平台使其可以理想的用于 各种生物纳米医学应用，用于促进水凝胶内部的细胞迀移。而且他们是无毒的、非免疫原性 的、非凝血酶原性的、生物可降解的，并且适合于通过注射入某一具体组织而进行定位治疗 由于除了存在复杂的三维结构之外还存在多种功能性基团，大蛋白质，例如抗体， 2 比传统的有机药物和无机药物更大并且更为复杂，因此他们的控制释放位点制剂更难功 3 克。为了使抗体维持生物活性，该制剂必须在整个治疗期间保护抗体的功能性。在持续释 放期间，由于三维结构的缺失或者化学不稳定性，抗体有多种降解途径。这些挑战被治疗长 度弱化。具有治疗性质的功能性抗体的呈递对于持续传递生物医学应用是重要的。因此， 需要开发一种基于生物可降解的肽的持续释放系统，从而在延长的时间期限内传递治疗有 效性大蛋白质，例如，抗体。
【发明内容】
[0007] 本发明涉及一种用于持续传递治疗剂的药物制剂，所述治疗剂优选蛋白质、多肽、 抗体或者抗体片段，所述药物制剂包括一种或者一种以上胶体形成肽，其中，所述制剂在至 少2周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周、至少十 周、至少十一周、至少十二周或者更长的时间内显示持续的传递。在一个实施方案中，本发 明涉及一种制剂，所述制剂包括在电解质溶液（例如，生物流体和盐）存在的情况下经历溶 胶-凝胶变化的自组装肽。所述制剂可以持续释放抗体和抗体片段，尤其是IgG。随着水凝 胶纳米纤维密度的增加，抗体的扩散率会减少，从而提供了一种控制释放动力学的方式。
[0008] 本发明进一步涉及多层水凝胶结构，这些多层水凝胶结构包括基本上同心球状的 补体和结构上相容肽，例如ac- (RADA) 4-〇)順2核心和ac- (KLDL) 3-〇)順2壳。所述治疗剂可 以通过洋葱样的体系结构扩散，当使用补体肽时可以形成所述洋葱样的体系结构。在一个 实施方案中，本发明的持续释放制剂可以在至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少 六周、至少七周、至少八周、至少九周、至少十周、至少十一周和至少十二周或更长的时间内 释放功能上完整的抗体。在一种优选的实施方案中，所述制剂在至少大约2个月到大约三 个月的时间内持续释放功能上完整的抗体，例如IgG。
[0009] 在一个实施方案中，本发明涉及一种制剂，其中，被释放的抗体（例如，IgG)的二 级结构和三级结构分析以及生物学分析显示，即使在水凝胶内部两个或者三个月之后，密 封和释放不影响所述抗体的构象和他们的生物活性。多克隆人IgG的功能性可以通过IgG 密封和释放之后他们与胆碱磷酸抗原的亲和性来确定。所述抗原结合效率可以被用于确定 密封后功能性的保留度.本发明涉及一种制剂，其中一种完全生物相容性可注射肽水凝胶 系统可以用于控制释放应用，作为治疗剂抗体的载体。
[0010] 在一种优选的实施方案中，本发明涉及人免疫球蛋白（pi7. 1，分子量146kDa)的 持续释放制剂，在大约3个月的时间内包括-ac- (RADA) 4-〇)順2和ac- (KLDL) 3-C0NH2自组装 肽水凝胶。在一种优选的实施方案中，使用圆振二向色性（CD)、荧光光谱分析和免疫测定法 对释放的抗体进行分析，据此可知，整合肽和从肽水凝胶中释放抗体的过程基本上不影响 其构象和功能。可以使用单分子荧光相关光谱（FCS)和石英晶体微量天平（QCM)生物传感 器技术监控IgG的生物活性。
[0011] 本发明进一步涉及一种持续药物传递系统，该系统可以有效的将治疗剂导向具体 的组织，其中这种定向传递对病人产生更小的毒性和副作用。所述可注射的自组装肽脚手 架系统，其中，在生理条件下，所述凝胶可以被用于包括免疫治疗的持续释放应用，从而在 延长的时间内将活性抗体局部释放到具体的组织中。在一种优选的实施方案中，在大约3 个月的时间内，人类抗体通过ac-(RADA)4-C0NH2或者ac-(KLDL) 3-C0NHjic水凝胶缓慢释放。 所述释放动力学随着形成水凝胶的自组装肽氨基酸序列的变化和水凝胶中肽纳米纤维的 密度变化而改变。而且，所述控制释放系统可以呈递生物活性蛋白质，其中，所述水凝胶释 放的抗体的二级结构和三级结构以及他们的生物活性基本上不受密封和通过水凝胶释放 的影响。肽序列的可编程性是独特的，并且提供了一种将纳米纤维性质控制在分子水平的 方法，这反过来可以改变生物分子的扩散和释放动力学。
[0012] 附图简要说明
[0013] 本发明的前述及其他目标、特征和优势从下列对本发明优选的实施方案的更为具 体的描述中变得显而易见，如随后附图中说明的那样，其中，不同视图中相同的附图标记指 的是相同的部分。所述附图不需要按比例绘制，相反，在图示上突出重点说明本发明的原 则。
[0014] 图1是（A)ac-(RADA)4-C0NH2肽单体、和其肽纳米纤维的图示、（B)IgG分子的图示、 (c)肽纳米纤维的电子镜检术图像图示和⑶脚手架水凝胶的宏观图像图示。IgG和肽的 色彩设计：带阳电荷的（蓝色）、带负电荷的（红色）和疏水性的（灰色）。
[0015] 图2. (A)多层水凝胶的示意图。（B)多层水凝胶的光学显微镜检查和（C-D)多 层水凝胶的荧光显微镜检查。为了便于观察，壳（自组装ac-(KLDL)3-C0NHj^)装载有 Alexa-488荧光基团（C)并且核（自组装ac-(RADA)4-C0NHjic)装载有CY3(D)。
[0016] 图3. (A)IgG通过不同肽和不同肽纳米纤维密度水凝胶在整个3个月的时间内的 释放曲线（A)和在头12天的释放曲线（B)。由自组装肽⑴ac-(RADA)4-C0NH2，浓度分别为 〇? 5%重量/体积的（淡蓝色，▲ )、1. 0%重量/体积（蓝色，▲)、和1. 5%重量/体积（深 蓝色，▲)和（ii)ac-(KLDL)3-C0NH2，浓度分别为0.3%重量/体积（红色，)和0.6%重 量/体积（品红色，)。在室温条件下，pH值为7. 4,磷酸缓冲液中进行释放试验。数据 点表示五个样品的平均计算标准偏差小于12%。（C)将IgG释放曲线绘制成时间平方根的 函数，显示双相的扩散机理。绘图最初的线性部分代表IgG通过所述肽水凝胶的单向扩散， 可以根据菲克定律（等式1)计算扩散系数。
[0017] 图4.IgG通过水凝胶和多层双组分水凝胶在整个3个月的时间内的释放 曲线（A)和在头12天的释放曲线（B)，所述水凝胶由浓度为1.0 %重量/体积的 ac- (RADA) 4-C0NH2 (蓝色，▲)和浓度为 0? 6 % 重量 / 体积的ac- (KLDL) 3-C0NH2 (品红色，) 所组成，所述多层双组分水凝胶由浓度为1. 0%重量/体积的ac-(RADA)4-C0NH2 (核心）和 浓度为〇. 6%重量/体积的ac-(KLDL)3-C0NH2(壳）所组成。在室温条件下，pH值为7. 4， 磷酸缓冲液中进行释放试验。数据点表示五个样品的平均计算标准偏差小于12%。（C) 将IgG释放曲线绘制成时间平方根的函数，显示双相的扩散机理。绘图最初的线性部分代 表IgG通过所述肽水凝胶的单向扩散，可以根据菲克定律（等式1)计算扩散系数。
[0018] 图5.人IgG在pH值为7. 4的磷酸缓冲液中的光谱分析（A)天然IgG(实线）和 肽水凝胶释放的IgG(虚线）的远紫外线圆二色性谱。（B)天然IgG(实线）和通过肽水凝 胶释放的IgG(虚线）的标准化的荧光发射光谱；激发波长是300纳米。释放样品后2个月 的时间内在室温下记录光谱。
[0019] 图6.游离的IgG分子在不存在和存在PC-BSA抗原情况下，在通过 ac- (RADA) 4-C0NH2肽水凝胶释放之前和之后的平移扩散时间。单分子荧光相关光谱（FCS) 数据显示IgG与抗原的相互作用产生三种不同的种类：游离的IgG分子，其扩散时间与单独 的IgG扩散时间相似，和与一个或者两个抗原分子键合的IgG。在IgG释放前后这些种类的 相对浓度是相似的。标准偏差在5%和12%之间。
[0020] 图7.天然多克隆人IgG(A)和⑶水凝胶释放的多克隆人IgG与固定的 PC-BSA(抗原）相连（结合）和解离的QCM随时间而变的频率变化，-dF。零时代表在流体 管道中注入IgG的时间，随后是结合相。随着IgG的注射和IgG与固定抗原的结合，生物传 感器信号（黑线）增加，随着缓冲液的注射（箭头）导致结合的IgG解离，生物传感器信号 降低。天然IgG和水凝胶释放的IgG之间计算的速率常数的相似性和亲合常数的相似性说 明IgG的功能特点在整合和通过肽水凝胶释放的过程中不受影响。红线代表数据拟合。
[0021] 图8.使用史托-爱因斯坦方程确定人免疫球蛋白（IgG，分子量146kDa，流体动 力学半径4= 5.3纳米，等电位点pi7. 1)在溶液中的扩散常数，并随着通过肽水凝胶释 放过程使用菲克定律确定扩散常数。使用误差传递计算标准偏差（n= 8)。
【具体实施方式】
[0022] 本发明涉及一种用于持续传递抗体或者抗体片段的药物制剂，所述抗体或者抗体 片段包括一种或者一种以上胶体形成肽，其中，所述制剂在至少2周、三周、四周、五周、六 周、七周、八周、九周、十周、十一周、十二周或者更长的时间内显示持续的传递。在一个实施 方案中，本发明涉及一种制剂，所述制剂包括在电解质溶液（例如，生物流体和盐）存在的 情况下经历溶胶-凝胶变化的自组装肽。所述制剂可以持续释放抗体和抗体片段，尤其是 IgG。随着水凝胶纳米纤维密度的增加，抗体的扩散率会减少，从而提供了一种控制释放动 力学的方式。
[0023] 本发明进一步涉及多层水凝胶结构，这些多层水凝胶结构包括基本上同心球状的 补体和结构上相容肽，例如ac- (RADA) 4-C0NH2核心和ac- (KLDL) 3-C0NH2壳。所述抗体可 以通过洋葱样的体系结构扩散，当使用补体肽时可以形成所述洋葱样的体系结构。本发明 的持续释放制剂可以在至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至 少八周、至少九周、至少十周、至少十一周和至少十二周或更长的时间内释放功能上完整的 抗体。在一种优选的实施