。在10纳米-400纳米之间记录发 射光谱，在300纳米处激发。分别将激发和发射缝隙宽度设定为5. 0纳米和2. 5纳米。样 品情况与进行圆二色性测量法时描述的样品情况相同。
[0066] IgG的FCS功能性试验。在室温下，使用Fluoropoint单分子检测系统（奥林巴斯 公司，东京，日本）进行所述抗体-抗原结合FCS特性鉴定。使用我们所使用的单分子分析 系统进行检测时，蛋白质的荧光信号较小，因此，我们用标准蛋白质标记试剂盒（Molecular Probes公司，尤金，OR)，用强焚光团Alexa-647标记人IgG。Alexa-647焚光标记的IgG分 子越过共焦的毫微微升体积，在633纳米下被氦氖激光器激发，测量（在单位时间内计数） 并使用各自荧光标记的IgG在不同的浓度下的校准曲线将测量值转化为浓度。
[0067] 记录共焦体积内荧光强度的变化作为时间的函数和自相关函数，g(t)，这回受到 荧光分子的性质以及局部环境下的扩散动力的影响[16' 17]。为了定义溶液中单分散颗粒的 不规则三维扩散的自相关函数[16'18' 19]，Fluoropoint系统使用等式2 :
[0068]
[0069] 其中，g( 〇是分数群（Ft"P)和三重态衰变时间（t&1P)的函数，N是样品体内分 子的数目，td是平移扩散时间，s是一个因子，描述了圆柱型检测体积，其等于圆柱底面半 径（《〇)除以其高度的一半（《1)的比率。在完全各向异性溶液中，扩散分子显著地小于 共焦体积，分子（例如，IgG)的扩散系数D等于D= ?。2/4^.使用单个和多次平移扩散时 间拟合自相关曲线。所有的数据点代表4或8个样品的平均值。
[0070] 在室温下将Alexa-647标记的IgG与10倍过量的PC-BSA抗原（Athera生物技术 AB，瑞典）在磷酸缓冲液中相互反应1小时。IgG和抗原之间的任何相互作用都会增加复合 物的分子量（和大小），其特征在于与游离IgG相比平移扩散时间（td)变慢。通过在不同 浓度的吐温清洁剂存在的情况下测量结合亲和性，从而评价IgG与抗原非特异性结合的作 用；在0.5%吐温中，非特异性结合最小，因此，所有的IgG-抗原结合研究都在此吐温浓度 下进行。使用如上所述的FCS算法分析数据，并且使用一个和多次组分拟合自相关函数。
[0071]IgG的QCM功能性试验。用QCM(Attana A200,斯德哥尔摩，瑞典）评价天然人IgG 和水凝胶释放的人IgG的生物活性。该组织由薄的压电石英圆盘组成，在每一侧面都有电 极。当连接到振荡电流时，所述石英晶体以共振频率振动，这对于结晶状物是敏感的，当材 料吸附到石英表面时，可记录到频率发生变化。为了比较天然人IgG和水凝胶释放的人IgG 的结合性质，用胺耦合试剂盒将PC-BSA抗原共价固定到通路A和B上。初步实验显示在 0. 05%吐温清洁剂中非特异性结合最小，因此，所有的IgG-抗原结合研究都在此吐温浓度 下进行。.
[0072] 通过注射84秒35yE的20微克/毫升人IgG，使其以20微升/分钟的速率流过 固定在QCM表面上的PC-BSA，并测量由于IgG与PC-BSA的结合作用导致的表面重量增加， 从而获得室温条件下的动力学数据。参照阴性参照物矫正动力学数据，所述阴性参照物通 过注入以下观察到：（i)将人多克隆IgG注入固定有BSA的表面上；（ii)将单克隆抗His标 记抗体注入固定有PC-BSA的表面上，和（iii)将抗视紫红质抗体注入固定有PC-BSA的表 面上。使用Attache评价软件分析数据，利用简单的1 : 1结合模型模拟抗体和抗原之间 的结合反应。通过分析相关性、ka和解离，计算ka、速率常数以及结合亲和常数，天然IgG 和释放的IgG对于抗原的结合亲和常数定义为KD=kd/ka。根据x2值和接近于零的残留 误差评价拟合度。
[0073] 结果和讨论
[0074] 人IgG通过肽纳米纤维脚手架水凝胶释放。如图3A所示，在第一个小时内可以观 察到IgG的最初快速释放（爆炸效应）。这或许是由于位于溶剂/水凝胶接触面上的IgG 分子或者在接触面附近的IgG分子快速释放入上清液溶液中。上述工作显示通过蛋白质这 种肽水凝胶的释放取决于蛋白质的大小[ 1<：]。小蛋白质释放的更快，而IgG作为一种大蛋 白质（~150kD)，释放的较慢。其中，据显示，IgG在三天后仍然没有完全释放。这里，我们 表明IgG通过肽脚手架水凝胶的释放不会再三个月后逐渐达到平稳值。在水凝胶系统中， 蛋白质的释放很少能达到100%，理由是蛋白质分子会被物理截留在高度卷曲的水凝胶纳 米纤维结构域中，使扩散剂不能自由运动。然而，自组装肽水凝胶是可生物降解的，因此，在 被引入到活的生物体中之后，水凝胶将会被分解成单个肽单体，随后被分解成氨基酸。这一 过程使脚手架水凝胶中装载的全部内含物都被释放到宿主组织中。
[0075] 肽脚手架水凝胶密度对人IgG扩散的作用。为了调查水凝胶密度对IgG释放曲线 的作用，改变自组装肽密度。增加的肽浓度导致纳米纤维高密度网络结构，这回阻碍IgG的 释放。图3显示了IgG穿过水凝胶的释放动力学，所述水凝胶中含有ac-(RADA)4-C0NH2肽 水凝胶，其中肽浓度为〇. 5 %重量/体积（99. 5 %水）、1. 0 %重量/体积（99 %水）和1. 5 % 重量/体积（98. 5 %水），和ac- (KLDL) 3-C0NH2肽水凝胶，其中肽浓度为0. 3 %重量/体积 (99. 7 %水）和0. 6 %重量/体积（99. 4 %水）。没有对高密度ac- (KLDL) 3-C0NH2肽进行实 验，这是由于这种水凝胶的特点在于增加的刚性，这种刚性使样品难以处理。这些结果显 示可以IgG通过改变肽纳米纤维密度来控制IgG经过水凝胶的释放。
[0076] 构建用于药物释放的复合多层肽水凝胶结构。所述双层水凝胶系统由两个部分组 成。图A和2B-D显示了两组分肽水凝胶的结构，其中，两组分中的每一个都装载有染料，从 而便于观察。所述水凝胶球的核心部分由自组装ac-(RADA)4-C0NH2肽组成，并且包含CY3 染料（红色），而包覆密封的第二球由ac- (KLDL) 3-C0NH2肽组成，并且包含Alexa-488 (绿 色）荧光团。亮场和荧光显微术显示每个水凝胶的轮廓（图2B-D)。虽然染料的扩散最终 导致CY3 和Alexa-488 分别扩散到ac- (KLDL) 3-C0NH2 和ac- (RADA) 4-C0NH2 水凝胶中，并 且可以预计在整个二组分肽水凝胶系统中均匀分布，这些染料的初始分布清楚地定义了每 个水凝胶球的形状和尺寸。
[0077] 在抗体释放实验中，通过1. 0%的ac-(RADA)4_C0NH2肽凝胶化作用形成核心，向 所述核心中装载抗体，而第二层（壳）由ac- (KLDL) 3-C0NH2水凝胶组成，其中不包含抗体 并且其包覆密封所述核心。多层水凝胶的形成产生一种系统，在此系统中，最初的蛋白质脉 冲释放显著的小于在单组份水凝胶中所观察到的最初释放（图3A和4A)。因此，IgG通过 多层水凝胶的扩散产生表面上接近-零-顺序的扩散曲线（图4A&4B)。
[0078] 多层自组装肽水凝胶技术可以容易的实验室转化为临床应用，通过使用例如具有 同轴针的双组分注射器同时注射两个肽溶液。随着肽溶液与生物流体之间的相互作用，发 生凝胶化，活性化合物的释放可以持续延长的时间。
[0079] IgG通过水凝胶脚手架是扩散率。20°C下，无限稀释的IgG在水中的扩散系数可以 通过下式计算〇.4xlO1%2,使用史托-爱因斯坦方程DSE=kBT/6JInyh，其中，KB是玻 耳兹曼常数、T是介质的绝对温度、n是溶剂的动态粘度（认为是1. 〇〇2cP)，并且yh是 IgG的流体动力学半径[2°]。然而应当指出，当使用微摩尔的IgG浓度时，如目前的工作，单 分子分析显示史托-爱因斯坦方程将IgG在溶液中的扩散率过高估计了 10-20% [1(：]。进 一步研究针对无限稀释分子的史托-爱因斯坦方程，随后进行布朗运动，因此微摩尔级浓 度的分子可以通过缓慢的分子运动影响扩散。
[0080] 为了计算IgG在通过肽水凝胶释放期间的扩散系数，我们使用图3显示的释放曲 线。利用常用的Fickian模型，如式I的描述，会产生水凝胶内部的表观IgG扩散系数，这种 扩散系数与使用史托爱因斯坦方程确定的IgG在溶液中的扩散系数明显不同（即，在50% 到80%之间）。通过假定小分子扩散、扩散剂的无限稀释、和所述分子通过水凝胶的扩散只 取决于布朗运动，可以研发出使用菲克定律计算的扩散系数模型。等式1常用于确定表观 扩散系数，即使不使用这些情况时。这样做的理由是当没有其他可容易的确定扩散率的转 化方法时，它能够促进系统的讨论。在水凝胶系统中，很少满足这些假设。将释放数据绘制 成时间平方根的函数（图3C)，绘图结果显示双相扩散机理。每个绘图最初的线性部分显示 IgG通过所述肽水凝胶扩散控制的释放，其可以根据菲克定律（等式1)计算扩散系数。长 时间后偏离直线可能与非菲克、反常扩散有关。
[0081] 具有较小尺寸的水凝胶孔和/或扩散中的IgG分子和水凝胶的肽纳米纤维之间的 特异性相互作用造成的扩散障碍都可以导致不符合菲克定律。
[0082] 释放的IgG的结构性质。蛋白质聚结作用以及导致蛋白质失活的蛋白质-肽相互 作用会发生在IgG在所述肽溶液中滞留期间，发生在自组装和纳米纤维形成期间或者发生 在释放过程中。为了观察到从肽水凝胶中释放的IgG的构造状态，在包裹密封后2个月进 行远紫外圆二色性和荧光光谱分析分别检测二级和三级结构特性。
[0083] 天然IgG的⑶广谱与文献中报道的IgG的光谱相同[23]。如图5A所示，水凝胶 释放的IgG的CD光谱与新鲜制备的IgG溶液的光谱非常相似。在低于200纳米的一些谱 图中观察到细微偏差，这时二极管或者HT(S卩，总吸光度）水平较高。在此区域广谱中观察 到低信号-噪音比例的原因是相对低的释放的IgG浓度与可能存在的从脚手架上分离的纳 米纤维。但是，IgG的0 -片结构，如在218纳米下观察到的，在释放过程中不受影响。
[0084] 在300纳米条件下激发色氨酸并记录荧光发射光谱。该发射对蛋白质三维结构内 的色氨酸微环境是敏感的，因此，荧光发射可以用于检测从水凝胶中释放的IgG的三级结 构变化。在最大发射波长的红色位移显示蛋白质未折叠，这是色氨酸暴露于极性溶液的结 果。IgG的荧光发射光谱与之前文献报告的相似[24]。图5B显示在相同的IgG浓度下，相 对于二者的发射最大值和荧光强度，释放的IgG发射光谱与天然IgG发射光谱相似，这表明 IgG的包覆密封和释放不会导致其三级结构改变。
[0085] 释放的人IgG的功能性实验。作为一种亚群，人IgG已知能够结合磷酸胆碱（PC)， 这是这一种常见的存在于许多人感染的微生物（包括肺炎球菌）中的抗原[25' 26'27'28]， PC-结合的BSA抗原被用于检测天然IgG和水凝胶释放的IgG的功能性。本实验中使用的 PC-BSA样品中每个BSA包含17个磷酸胆碱（PC)分子。使用单分子FCS检测系统研究人 IgG与PC-BSA之间的相互作用。通过使用一个和多个组分进行自相关函数拟合分析GCS数 据。通过X参数值和残差判断每组数据的拟合优度，其在零周围均匀分布。在所有的情况 下都选择最简单的模型。实验数据与具有较少独立组分的模型的尝试拟合会导致X2值增 加。还要进行参照实验：（i)缓冲液；（ii)在抗原存在的情况下未标记的IgG分子；（iii) 在PC-BSA抗原存在的情况下，热变性的标记的IgG ;和（iv)在BSA(无PC半抗原）存在的 情况下，标记的IgG，并且未发现可测量的相互作用。
[0086] 数据分析显示，一个tD足够描述游离IgG的自相关函数，随着过量抗原的加入， 需要三个tD值进行FCS数据分析（图6)。随着IgG与10倍过量的PC-BSA抗原（即，50 微摩）的相互作用，根据其扩散时间可以识别出三种不同的种类，游离地、未结合的IgG分 子、和与一个或者两个抗原分子结合的IgG分子（图6)。数据分析显示，无论是否存在抗 原，游离的IgG分子扩散通过检测体积的时间为ca. 1060微秒。比较IgG在通过肽水凝胶 释放之前和之后的扩散时间说明，随着与抗原的相互作用，形成相同类型的IgG-(PC-BSA)x 复合物。这些复合物具有的扩散时间为大约1135微秒和1230微秒，分别对应于结合IgG结 合一个或者两个抗原分子。图6还显示在每个种类（即，游离分子和与一个或者两个抗原 相互作用的分子）中IgG分子的百分比在通过水凝胶释放之前和之后都是相似的。这些结 果显示IgG与PC-BSA抗原的结合亲和力不会随着IgG从肽水凝胶中的释放而改变，因此， IgG的生物活性不受到水凝胶包覆密封和释放的影响。
[0087] 在多克隆人