结合cd70的人类抗体及其用途的制作方法

专利名称：结合cd70的人类抗体及其用途的制作方法
相关申请
本专利申请主张于2006年12月14日提交的美国临时申请系列号60/870,091、于2007年5月1日提交的美国临时申请系列号60/915,314以及于2007年11月30日提交的美国临时申请系列号60/991,702的优先权，其内容在此合并作为参考。
背景技术：
细胞因子受体CD27是肿瘤坏死因子受体(TFNR)超家族的成员，它在细胞生长和分化中，以及在细胞凋亡或程序性死亡中起一定作用。CD27的配体是CD70，它属于配体的肿瘤坏死因子家族。CD70是一个193个氨基酸的多肽，具有20个氨基酸亲水的N末端结构域以及包含2个潜在的N-连接糖基化位点的C末端结构域(Goodwin，R.G.等人(1993)Cell73447-56；Bowman等人(1994)Immunol 1521756-61)。基于这些特征，CD70被确定为具有细胞外C末端部分的II型跨膜蛋白。
已发现CD70瞬时出现于已激活的而非静止态的T和B淋巴细胞以及树突细胞(Hintzen等人(1994)J.Immunol.1521762-1773；Oshima等人(1998)Int.Immunol.10517-26；Tesselaar等人(2003)J.Immunol.17033-40)。除在正常细胞上表达外，已报道CD70在不同类型的癌细胞中表达，包括肾细胞癌、转移型乳癌、脑肿瘤、白血病、淋巴瘤以及鼻咽癌(Junker等人(2005)J Urol.1732150-3；Sloan等人(2004)Am J Pathol.164315-23；Held-Feindt and Mentlein(2002)Int J Cancer 98352-6；Hishima等人(2000)Am J Surg Pathol.24742-6；Lens等人(1999)Br JHaematol.106491-503)。另外，发现CD70在用DNA甲基转移酶抑制剂或ERK途径抑制剂处理的T细胞上过量表达，可能导致药物引起的或原发性狼疮(Oelke等人(2004)Arthritis Rheum.501850-60)。已提出，CD70与CD27的相互作用在细胞介导的自身免疫疾病以及抑制TNF-α的产生中起作用(Nakajima等人(2000)J.Neuroimmunol.109188-96)。
因此，CD70代表了用于治疗以CD70表达为特征的癌症、自身免疫紊乱以及许多其他疾病的有价值的靶标。
概述 本发明提供了分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，这些抗体特异性结合CD70并且具有多种所希望的特性。这些特性包括结合人类CD70的高亲和力、由表达CD70的细胞内化、介导抗体依赖性细胞毒性的能力、结合肾细胞癌肿瘤细胞系的能力、和/或结合淋巴瘤细胞系(例如B细胞肿瘤细胞系)的能力。本发明的抗体可以用于例如检测CD70蛋白或用于抑制表达CD70的细胞(如表达CD70的肿瘤细胞)的生长。
还提供了使用本发明分离的单克隆抗体及其组合物治疗多种CD70介导的疾病的方法。
一方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其中该抗体结合CD70，并且表现出以下特性中的至少一种 (a)以1×10-7M或更小的KD与人类CD70相结合； (b)结合肾细胞癌肿瘤细胞系； (c)结合淋巴瘤细胞系，例如B细胞肿瘤细胞系； (d)被表达CD70的细胞内化； (e)表现出针对表达CD70的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；并且 (f)当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的细胞的生长。
优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少两种。更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少三种。更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的四种。甚至更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的五种。甚至更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的全部六种。在另一个优选的实施方案中，当该抗体与细胞毒素相偶联时该抗体在体内抑制表达CD70的肿瘤细胞的生长。
优选地，该抗体结合肾细胞癌肿瘤细胞系，该细胞系选自786-O(ATCC登录号CRL-1932)、A-498(ATCC登录号HTB-44)、ACHN(ATCC登录号CRL-1611)、Caki-1(ATCC登录号HTB-46)以及Caki-2(ATCC登录号HTB-47)。
优选地，该抗体结合B细胞癌肿瘤细胞系，该细胞系选自Daudi(ATCC登录号CCL-213)、HuT 78(ATCC登录号TIB-161)、Raji(ATCC登录号CCL-86)或Granta-519(DSMZ登录号342)细胞。
优选地，该抗体是人类抗体，虽然在可替代地实施方案中，该抗体可以是鼠类抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在更优选的实施方案中，该抗体以5.5×10-9M或更小的KD与人类CD70相结合，或以3×10-9M或更小的KD与人类CD70相结合，或以2×10-9M或更小的KD与人类CD70相结合，或以1.5×10-9M或更小的KD与人类CD70相结合。
在另一个实施方案中，该抗体与786-O肾细胞癌肿瘤细胞上表达的CD70结合后被那些细胞内化。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或该抗体的抗原结合部分，其中该抗体交叉竞争结合CD70上由参考抗体所识别的表位，其中该参考抗体(a)以1×10-7M或更小的KD结合人类CD70；并且(b)结合肾细胞癌肿瘤细胞系。
在不同的实施方案中，该参照抗体包括 (a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO1；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO7； 或该参照抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO2；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO8； 或该参照抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO3；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO9； 或该参照抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO4；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO10； 或该参照抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO5或73；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO11； 或该参照抗体包括(a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO6；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO12。
在另一个实施方案中，本发明的参考抗体为抗体69A7Y。69A7Y与抗体69A7相同，但在氨基酸序列SEQ ID NO5的VH中含保守修饰，导致在氨基酸位置100处C(半胱氨酸)突变为Y(酪氨酸)。69A7Y的VH氨基酸序列由SEQ ID NO73给出。从C到Y的突变是由在69A7的VH核苷酸序列(SEQ ID NO53)的核苷酸位置323处发生从G到A的单一碱基对取代所形成的。69A7Y的VH核苷酸序列由SEQ ID NO74给出。69A7Y具有重链可变区CDR3，包括如SEQ ID NO75所给出的氨基酸序列。
另一方面，本发明涉及与治疗剂相连接的分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，该单克隆抗体或其抗原结合部分包括作为人类VH 3-30.3基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异性结合CD70。本发明还提供分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VH 3-33基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异性结合。本发明还提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VH 4-61基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体与CD70特异地结合。本发明还提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VH 3-23基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异性地结合CD70。
本发明还进一步提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VK L6基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。本发明还进一步提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VKL18基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。本发明进一步提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VKL15基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。本发明进一步提供了分离的单克隆抗体，包括连接到治疗剂上的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体包括作为人类VKA27基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。
特别优选的抗体或其抗原结合部分包括 (a)包括SEQ ID NO13的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO19的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO25的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO31的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO37的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO43的轻链可变区CDR3。
另一种优选的组合包括 (a)包括SEQ ID NO14的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO20的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO26的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO32的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO38的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO44的轻链可变区CDR3。
另一种优选的组合包括 (a)包括SEQ ID NO15的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO21的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO27的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO33的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO39的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO45的轻链可变区CDR3。
另一种优选的组合包括 (a)包括SEQ ID NO16的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO22的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO28的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO34的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO40的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO46的轻链可变区CDR3。
另一种优选的组合包括 (a)包括SEQ ID NO17的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO23的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO29或75的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO35的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO41的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO47的轻链可变区CDR3。
另一种优选的组合包括 (a)包括SEQ ID NO18的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO24的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO30的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO36的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO42的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO48的轻链可变区CDR3。
本发明其他优选的抗体具有抗体或其抗原结合部分，其包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO1的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQID NO7的轻链可变区。
另一种优选的组合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO2的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO8的轻链可变区。
另一种优选的组合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO3的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO9的轻链可变区。
另一种优选的组合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO4的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO10的轻链可变区。
另一种优选的组合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO5或73的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO11的轻链可变区。
另一种优选的组合包括(a)包括氨基酸序列SEQ ID NO6的重链可变区；以及(b)包括氨基酸序列SEQ ID NO12的轻链可变区。
在另一个实施方案中，本发明的一种抗体是抗体69A7Y。69A7Y与抗体69A7相同，但在SEQ ID NO5的VH氨基酸序列中包含保守修饰，导致在氨基酸位置100处C(半胱氨酸)突变为Y(酪氨酸)。69A7Y的VH氨基酸序列由SEQ ID NO73给出。从C到Y的突变是在69A7的VH核苷酸序列(SEQ ID NO53)的核苷酸位置323处发生从G到A的单一碱基对取代形成的。69A7Y的VH核苷酸序列由SEQ ID NO74给出。69A7Y具有重链可变区CDR3，包含如SEQ ID NO75所给出的氨基酸序列。
例如，本发明的抗体可以是全长抗体，例如IgG1或IgG4同种型。可替代地，该抗体可以是诸如Fab或Fab’2片段或单链抗体的抗体片段。
本发明还提供了免疫偶联物，包括连接到治疗剂(例如细胞毒素或放射性同位素)的本发明的抗体或它的抗原结合部分。在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了免疫偶联物，该偶联物包含连接到细胞毒素(例如，此处说明的细胞毒素或参见于2006年12月28日申请的美国专利申请60/882,461或2007年11月30日申请的美国专利申请号60/991,300中，其全文在此合并作为参考)(例如通过硫羟醇基连接)的本发明抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，该免疫偶联物的细胞毒素以及连接物具有N1或N2结构。
例如，在不同的实施方案中，本发明提供了以下优选的免疫偶联物 (i)免疫偶联物，包括抗体或其抗原结合部分，包括 (a)包括氨基酸序列SEQ ID NO1的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO7的轻链可变区； (b)包括氨基酸序列SEQ ID NO2的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO8的轻链可变区； (c)包括氨基酸序列SEQ ID NO3的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO9的轻链可变区； (d)包括氨基酸序列SEQ ID NO4的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO10的轻链可变区； (e)包括氨基酸序列SEQ ID NO5或73的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO11的轻链可变区，以及 (f)包括氨基酸序列SEQ ID NO6的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO12的轻链可变区，其中该抗体或其抗原结合部分连接到细胞毒素上； (ii)一种免疫偶联物，包括抗体或其抗原结合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO13的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO19的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO25的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO31的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO37的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO43的轻链可变区CDR3； 或者抗体或其抗原结合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO14的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO20的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO26的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO32的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO38的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO44的轻链可变区CDR3； 或者抗体或其抗原结合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO15的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO21的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO27的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO33的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO39的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO45的轻链可变区CDR3； 或者抗体或其抗原结合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO16的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO22的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO28的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO34的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO40的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO46的轻链可变区CDR3； 或者种抗体或其抗原结合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO17的重链可变区CDR1，； (b)包括SEQ ID NO23的重链可变区CDR2，； (c)包括SEQ ID NO29或75的重链可变区CDR3，； (d)包括SEQ ID NO35的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO41的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO47的轻链可变区CDR3； 或者抗体或其抗原结合部分，包括 (a)包括SEQ ID NO18的重链可变区CDR1； (b)包括SEQ ID NO24的重链可变区CDR2； (c)包括SEQ ID NO30的重链可变区CDR3； (d)包括SEQ ID NO36的轻链可变区CDR1； (e)包括SEQ ID NO42的轻链可变区CDR2；以及 (f)包括SEQ ID NO48的轻链可变区CDR3， 其中该抗体或其抗原结合部分连接到细胞毒素上；以及 (iii)一种免疫偶联物，包括连接到细胞毒素上的抗体或其抗原结合部分，它结合由下述抗体所识别的相同表位(如与该抗体交叉竞争结合人类CD70)，该抗体包括 (a)包括氨基酸序列SEQ ID NO1的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO7的轻链可变区； (b)包括氨基酸序列SEQ ID NO2的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO8的轻链可变区； (c)包括氨基酸序列SEQ ID NO3的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO9的轻链可变区； (d)包括氨基酸序列SEQ ID NO4的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO10的轻链可变区； (e)包括氨基酸序列SEQ ID NO5或73的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO11的轻链可变区；以及 (f)包括氨基酸序列SEQ ID NO6的重链可变区和包括氨基酸序列SEQ ID NO12的轻链可变区。
本发明还提供了双特异性分子，该双特异性分子包括本发明的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部位与第二个功能部分相连接，该第二功能部分具有与所述抗体或其抗原结合部分相比不同的结合特异性。
还提供了组合物，包括本发明的抗体或其抗原结合部分或免疫偶联物或双特异性分子，以及药学上可接受的载体。
本发明还包括编码本发明抗体或它们的抗原结合部分的核酸分子以及包括此类核酸的表达载体以及包括此类表达载体的宿主细胞。还提供了使用包括此类表达载体的宿主细胞制备抗CD70抗体的方法，并且这些方法可包括的步骤有(i)在宿主细胞中表达该抗体以及(ii)从宿主细胞中分离该抗体。
在又另一方面中，本发明涉及制备抗CD70抗体的方法。该方法包括 (a)提供(i)重链可变区抗体序列，包括选自SEQ ID NO13至18的CDR1序列；选自SEQ ID NO19至24的CDR2序列；和/或选自SEQID NO25至30及75的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，包括选自SEQ ID NO31至36的CDR1序列；选自SEQ ID NO37至42的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO43至48的CDR3序列； (b)在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中改变至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变的抗体序列；并且 (c)将被改变的抗体序列表达成蛋白质。
本发明还提供了以高亲和力与CD70特异性结合的分离的抗CD70抗体-配偶体分子偶联物，特别是那些包含人类单克隆抗体的抗CD70抗体-配偶体分子偶联物。此类抗体-配偶体分子偶联物中有某些能被内化至表达CD70的细胞中，并且能介导抗体依赖性细胞毒性作用。本发明还提供了使用在此披露的抗CD70抗体-配偶体分子偶联物治疗癌症的方法，这些癌症例如肾细胞癌或者淋巴瘤。
还提供了包括与本发明的配偶体分子相偶联的抗体或其抗原结合部分的组合物。可以有利地与在此披露的抗体配偶体分子偶联物中的抗体相偶联的配偶体分子包括但不限于作为药物的分子、细胞毒素、标记分子(如放射性同位素)、蛋白质以及治疗剂。还在此披露了包括抗体-配偶体分子偶联物以及药学上可接受的载体的组合物。
一方面，此类抗体-配偶体分子偶联物通过化学连接物相偶联。在一些实施方案中，该连接物是肽基连接物，并在此被表示为(L4)p-F-(L1)m。其他连接物包括肼以及二硫化物连接物，并在此被分别表示为(L4)p-H-(L1)m或(L4)p-J-(L1)m。除了与配偶体相结合的连接物之外，本发明还提供了适用于结合至基本上任何分子种类的可切割的连接臂。
另一方面，本发明涉及抑制表达CD70的肿瘤细胞生长的方法。该方法包括将表达CD70的肿瘤细胞与本发明的抗体-配偶体分子偶联物相接触，使得表达CD70的肿瘤细胞的生长受到抑制。在一个优选的实施方案中，该配偶体分子是治疗剂，如细胞毒素。特别优选的表达CD70的肿瘤细胞是肾癌细胞和淋巴瘤细胞。
另一方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法。该方法包括给予该受试者本发明的抗体-配偶体分子偶联物，使得该受试者的癌症得到治疗。在一个优选的实施方案中，该配偶体分子是治疗剂，如细胞毒素。特别优选的能治疗的癌症是肾癌以及淋巴瘤。
另一方面，本发明涉及治疗受试者的自身免疫病、炎症或者病毒感染的方法。该方法包括给予该受试者本发明的抗体-配偶体分子偶联物，使得该受试者的自身免疫紊乱得到治疗。
以下详细的说明书以及实施例将清楚地说明本发明的其他特征及优点，这些说明书与实施例不得被解释为是对本发明的限制。本申请全文引用的所有参考文献、Genbank登录号、专利以及已公开的专利申请都明确地合并入本文作为参考。
附图简要说明

图1A示出了2H5人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO49)以及氨基酸序列(SEQ ID NO1)。描述了CDR1(SEQ ID NO13)、CDR2(SEQ ID NO19)以及CDR3(SEQ ID NO25)区，并指明了V与J的种系来源(germline derivations)。
图1B示出了2H5人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO55)以及氨基酸序列(SEQ ID NO7)。描述了CDR1(SEQ ID NO31)、CDR2(SEQ ID NO37)以及CDR3(SEQ ID NO43)区，并指明了V与J的种系来源。
图2A示出了10B4人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO50)以及氨基酸序列(SEQ ID NO2)。描述出了CDR1(SEQ IDNO14)、CDR2(SEQ ID NO20)以及CDR3(SEQ ID NO26)区，并指明了V、D以及J的种系来源。
图2B示出了10B4人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO56)以及氨基酸序列(SEQ ID NO8)。描述了CDR1(SEQ ID NO32)、CDR2(SEQ ID NO38)以及CDR3(SEQ ID NO44)区，并指明了V与J的种系来源。
图3A示出了8B5人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO51)以及氨基酸序列(SEQ ID NO3)。描述了CDR1(SEQ ID NO15)、CDR2(SEQ ID NO21)以及CDR3(SEQ ID NO27)区，并指明了V、D以及J的种系来源。
图3B示出了8B5人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO57)以及氨基酸序列(SEQ ID NO9)。描述了CDR1(SEQ ID NO33)、CDR2(SEQ ID NO39)以及CDR3(SEQ ID NO45)区，并指明了V与J的种系来源。
图4A示出了18E7人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO52)以及氨基酸序列(SEQ ID NO4)。描述了CDR1(SEQ ID NO16)、CDR2(SEQ ID NO22)以及CDR3(SEQ ID NO28)区，并指明了V、D以及J的种系来源。
图4B示出了18E7人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO58)以及氨基酸序列(SEQ ID NO10)。描述了CDR1(SEQ ID NO34)、CDR2(SEQ ID NO40)以及CDR3(SEQ ID NO46)区，并指明了V与J的种系来源。
图5A示出了69A7人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO53)以及氨基酸序列(SEQ ID NO5)。描述了CDR1(SEQ ID NO17)、CDR2(SEQ ID NO23)以及CDR3(SEQ ID NO29)区，并指明了V、D及J的种系来源。
图5B示出了69A7人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO59)以及氨基酸序列(SEQ ID NO11)。描述了CDR1(SEQ IDNO35)、CDR2(SEQ ID NO41)以及CDR3(SEQ ID NO47)区，并指明了V与J的种系来源。
图6A示出了1F4人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO54)以及氨基酸序列(SEQ ID NO6)。描述了CDR1(SEQ ID NO18)、CDR2(SEQ ID NO24)以及CDR3(SEQ ID NO30)区，并指明了V、D以及J的种系来源。
图6B示出了1F4人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO60)以及氨基酸序列(SEQ ID NO12)。描述了CDR1(SEQ ID NO36)、CDR2(SEQ ID NO42)以及CDR3(SEQ ID NO48)区，并指明了V与J的种系来源。
图7示出了2H5和10B4的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH3-30.3氨基酸序列(SEQ ID NO61)的比对。
图8示出了8B5和18E7的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH3-33氨基酸序列(SEQ ID NO62)的比对。
图9示出了69A7的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 4-61氨基酸序列(SEQ ID NO63)的比对。
图10示出了1F4的重链可变区的氨基酸序列与人类种系VH 3-23氨基酸序列(SEQ ID NO64)的比对。
图11示出了2H5的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK L6氨基酸序列(SEQ ID NO65)的比对。
图12示出了10B4的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK L18氨基酸序列(SEQ ID NO66)的比对。
图13示出了8B5和18E7的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VKL15氨基酸序列(SEQ ID NO67)的比对。
图14示出了69A7的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK L6氨基酸序列(SEQ ID NO65)的比对。
图15示出了1F4的轻链可变区的氨基酸序列与人类种系VK A27氨基酸序列(SEQ ID NO68)的比对。
图16示出了ELSIA实验的结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体特异性结合CD70。
图17示出了流式细胞术实验的结果，证明抗-CD70人类单克隆抗体2H5与肾癌细胞系结合。
图18A与B示出了流式细胞术实验结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体以浓度依赖性的方式与肾细胞癌(RCC)细胞系结合。(A)786-ORCC细胞系(B)A498RCC细胞系。
图18C示出了流式细胞术实验的结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体与786-O肾癌细胞系结合。
图18D示出了流式细胞术实验的结果，证明针对人类CD70的HuMAb69A7抗体以浓度依赖性的方式与肾细胞癌(RCC)细胞系786-O结合。
图19示出了流式细胞术实验的结果，证明抗CD70人类单克隆抗体2H5与人类淋巴瘤细胞系结合。
图20A与B示出了流式细胞术实验的结果，证明抗-CD70人类单克隆抗体2H5以浓度依赖性的方式与人类淋巴瘤细胞系结合。(A)Raji淋巴瘤细胞系(B)Granta-519淋巴瘤细胞系。
图20C示出了流式细胞术实验的结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体结合Raji淋巴瘤细胞系。
图20D示出了竞争性流式细胞术测定的结果，证明HuMAb 2H5与69A7共用类似的结合表位。
图20E示出了流式细胞术实验的结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体与Daudi淋巴瘤细胞系以及786-O肾癌细胞系结合。
图21示出了Hum-Zap内化实验的结果，证明针对人类CD70的人类单克隆抗体可以内化进入CD70阳性细胞中。
图22A至C示出了细胞增殖测定的结果，证明偶联细胞毒素的人类单克隆抗-CD70抗体杀死肾细胞癌细胞(RCC)系。(A)Caki-2RCC(B)786-ORCC(C)ACHN RCC。
图23A至D示出了ADCC测定的结果，证明人类单克隆抗-CD70抗体以ADCC依赖的方式杀死人类白血病以及淋巴瘤细胞系。(A)ARH-77白血病细胞系(B)HuT 78淋巴瘤细胞系(C)Raji淋巴瘤细胞系以及(D)L-540细胞系，它不表达CD70。
图24示出了细胞增殖测定的结果，证明偶联细胞毒素的人类单克隆抗-CD70抗体杀死人类淋巴瘤细胞系。
图25A至B示出了细胞增殖测定的结果，证明偶联细胞毒素的人类单克隆抗-CD70抗体显示出在(A)洗涤三小时以及(B)持续洗涤时对Raji细胞的细胞毒性。
图26A至B示出了在体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用偶联细胞毒素的抗-CD70抗体2H5治疗对肾细胞癌(RCC)肿瘤具有直接的体内抑制作用。(A)A-498RCC肿瘤(B)ACHN RCC肿瘤。
图27A至F示出了ADCC测定的结果，证明非岩藻糖化的人类单克隆抗-CD70抗体对人类白血病细胞具有以ADCC依赖方式的增加的细胞毒性。(A)ARH-77细胞；(B)MEC-1细胞；(C)用抗-CD16抗体处理的MEC-1细胞；(D)SU-DHL-6细胞；(E)IM-9细胞；(F)HuT 78细胞。
图28示出了ADCC测定的结果，证明人类单克隆抗-CD70抗体以ADCC浓度依赖性方式杀死人类白血病细胞。
图29示出了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定的结果，证明人类单克隆抗-CD70抗体以ADCC依赖性方式杀死人类白血病细胞，但是细胞毒性依赖于CD16。
图30示出了ADCC测定的结果，证明人类单克隆抗-CD70抗体杀死人类已激活的T细胞，并且该作用可随抗-CD16抗体的加入得到逆转。
图31示出了阻断测定的结果，证明一些人类单克隆抗-CD70抗体阻断CD70与CD27的结合，而其他人类单克隆抗-CD70抗体不阻断CD70与CD27的结合。
图32A至B示出了在体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明裸露的抗-CD70抗体2H5的治疗对淋巴瘤具有直接的体内抑制作用。(A)Raji肿瘤(B)ARH-77肿瘤。
图33A至C示出了在体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用偶联细胞毒素的抗-CD70抗体2H5的治疗对淋巴瘤具有直接的体内抑制作用。(A)ARH-77肿瘤；(B)Granta 519肿瘤；(C)Raji肿瘤。
图34示出了一项研究结果，表明抗-CD70抗体69A7与在恒河猴CD70阳性B淋巴瘤细胞系上表达的CD70进行交叉反应。
图35示出了阻断测定的结果，证明人类抗-CD70抗体阻断已知小鼠抗-人类CD70抗体的结合。
图36A与B示出了用抗-CD70抗体或该抗体的非岩藻糖化形式处理的结果。(A)抗-CD70抗体以剂量依赖的方式抑制CD70共刺激的细胞的增殖。(B)抗-CD70抗体以剂量依赖的方式抑制CD70共刺激的IFN-γ分泌。
图37A至C示出了用抗-CD70抗体或该抗体的非岩藻糖化形式在肽刺激的细胞上处理的结果。(A)抗-CD70抗体抑制肽特异性的CD8阳性T细胞的增殖(expansion)。(B)没有观察到总细胞生存力的明显下降。(C)没有观察到总CD8阳性细胞数的明显下降。
图38示出了抗-CD70抗体对肽特异性的CD8阳性T细胞增殖的作用被外加的抗-CD16抗体阻断。
图39A至B示出了在体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用细胞毒素偶联的抗-CD70抗体2H5的治疗对肾癌肿瘤具有直接的体内抑制作用。(A)786-O肿瘤(B)Caki-1肿瘤。
图40示出了免疫偶联物抗-CD70-N1与抗-CD70-N2在786-O肾细胞癌异种移植NOD-SCID小鼠模型中体内抵抗肿瘤形成的功效。
图41示出了单一剂量的免疫偶联物抗-CD70-N2在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中体内抵抗肿瘤形成的功效。
图42示出了不同剂量的免疫偶联物抗-CD70-N2在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中体内抵抗肿瘤形成的功效。
图43示出了不同剂量的免疫偶联物抗-CD70-N2在Caki-1肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中体内抵抗肿瘤形成的功效。
图44示出了免疫偶联物抗-CD70-N2在Raji细胞淋巴瘤SCID小鼠模型中体内抵抗肿瘤形成的功效。
图45示出了在BALB/c小鼠中免疫偶联物抗-CD70-N2在体内的安全性。
图46A至D示出与在犬中游离的药相比，免疫偶联物抗-CD70-N2在体内的安全性。
图47示出了ADCC测定的结果。hIgG1nf Neg Ctrl＝人类IgG1NF阴性对照抗体。hIgG1Neg Ctrl＝人类IgG1阴性对照抗体。mIgG1NegCtrl＝小鼠IgG1阴性对照抗体。(A)2H5结合至已激活的B细胞上的FACS分析。(B)在已激活的人类B细胞上的2H5NF和2H5的ADCC测定。(C)加入抗CD16抗体的ADCC测定。
图48描述了抗-CD70抗体通过ADCC利用在受刺激的人类PBMC培养物中天然存在的效应细胞介导经Ag激活、CD70阳性人类T细胞裂解的能力。
图49描述了抗-CD70抗体对天然表达CD70阳性的人类癌细胞系786-0细胞的结合特性。
图50描述了岩藻糖化的以及非岩藻糖化的抗-CD70抗体在CD70阳性淋巴瘤细胞系ARH77上介导ADCC的能力。
图51显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素E在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图52显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素E在A498肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图53显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素E在Caki-1肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图54显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素E在Raji细胞淋巴瘤SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图55显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素E在Dauli细胞淋巴瘤SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图56显示抗CD70-细胞毒素E在Caki-1肾细胞癌异种移植大鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图57显示抗CD70-细胞毒素E在BALB/c小鼠中的体内安全性。
图58显示抗CD70-细胞毒素E在犬中的体内安全性。
图59显示抗CD70-细胞毒素E在猴子中的体内安全性。
图60显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素F在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图61显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素F在Caki-1肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图62显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素F在Raji细胞淋巴瘤SCID小鼠模型中的抗肿瘤形成的体内功效。
图63显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素G在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图64显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素G在Caki-1肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图65显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素H在A498肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图66显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素H在Caki-1肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图67显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素I在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图68显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素I在Caki-1肾细胞癌异种移植大鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图69显示单一剂量的抗CD70-细胞毒素J在786-O肾细胞癌异种移植SCID小鼠模型中抵抗肿瘤形成的体内功效。
图70显示抗-CD70抗体2H5功能性地阻断CD70刺激的人类T细胞增殖。
图71是细胞毒素B的结构。
图72是细胞毒素C的结构。
图73是细胞毒素D的结构。
图74是细胞毒素E的结构。
图75是细胞毒素F的结构。
图76是细胞毒素G的结构。
图77是细胞毒素H的结构。
图78是细胞毒素I的结构。
图79是细胞毒素J的结构。
详细说明 本发明涉及分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，这些抗体结合人类CD70并且具有所希望的功能特性。在某些实施方案中，本发明的抗体衍生自特定的重链及轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，例如包括特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供了分离的抗体，制备此类抗体、抗体-配偶体分子偶联物以及包括此类抗体的双特异性分子的方法，以及包含本发明的抗体、抗体-配偶体分子偶联物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用该抗体来例如检测CD70蛋白质的方法，以及使用本发明的抗CD70抗体来抑制表达CD70的细胞(例如肿瘤细胞)的生长的方法。因此，本发明还提供使用本发明的抗CD70抗体以及抗体-配偶体分子偶联物治疗多种类型的癌症的方法，例如，治疗肾细胞癌或者淋巴瘤。
为了更容易地理解本发明，首先定义了某些术语。其他定义在整个详细说明中给出。
如此处使用的术语“CD70”包括变异体、同种型、同系物、直向同源物以及种内同源物。例如对人类CD70蛋白具有特异性的抗体在某些情况下可以与来自除人类之外的物种的CD70蛋白进行交叉反应。在另一个实施方案中，对人类CD70蛋白具有特异性的抗体对于人类CD70蛋白可能是完全特异的，并且可能不表现出物种或其他类型的交叉反应性，或者可能与来自某些其他物种但不是所有其他物种的CD70进行交叉反应(如与灵长类CD70进行交叉反应但不与小鼠CD70进行交叉反应)。术语“人类CD70”指人类序列CD70，如具有Genbank登录号P32970的人类CD70的完整氨基酸序列(SEQ ID NO76)。术语“小鼠CD70”指小鼠序列CD70，如具有Genbank登录号NP_035747的小鼠CD70的完整氨基酸序列。通过具有例如保守突变或在非保守区的突变，人类CD70序列可能不同于Genbank登录号P32970的人类CD70，而该CD70具有基本上与Genbank登录号P32970的人类CD70相同的生物功能。例如，人CD70的一个生物功能是结合细胞因子受体CD27。
特定的人类CD70序列与Genbank登录号P32970的人类CD70在氨基酸序列上通常会有至少90％的同一性，并且含有这样的氨基酸残基，当与其他物种(如鼠类)的CD70氨基酸序列相比时，这些氨基酸残基将该氨基酸序列鉴定为是人源的。在某些情况下，人类CD70与Genbank登录号为P32970的CD70在氨基酸序列上可具有至少95％，或者甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。在某些实施方案中，与Genbank登录号P32970的CD70序列相比，人类CD70序列可展示出不超过10个氨基酸的差异。在某些实施方案中，与Genbank登录号P32970的CD70序列相比，该人类CD70可展示出不超过5个，或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。百分比同一性可以如此处所说明进行确定。
术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞以及由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子以及补体)的作用，该作用导致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或者在自身免疫炎症或病理炎症情况下的正常人类细胞或组织的选择性损害、破坏或将它们从人体中清除。
“信号转导途径”指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分的转递中发挥作用。此处使用的短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接受信号并将这种信号传递穿过细胞的细胞膜的分子及分子的复合物。本发明的“细胞表面受体”的一个实例是CD70受体。
此处提及的术语“抗体”包括完整抗体以及它们的任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或它们的单链。“抗体”指包括至少两条重(H)链及两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分，其中两条重链以及两条轻链之间通过二硫键相互连接。每一条重链均包括重链可变区(在此缩写为VH)以及重链恒定区。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2以及CH3构成。每一条轻链均包括轻链可变区(在此缩写为VL或Vk)以及轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH以及VL区可以进一步被分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区。每个VH以及VL均由三个CDR及四个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，这些宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)以及经典补体系统的第一成分(Clq)。
在此所使用的术语“抗体的片段”以及抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)指一个或多个保留了特异性结合抗原的能力的抗体的片段(如CD70)。已经发现抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括通过在铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，它实质上是带有铰链区部分的Fab(参见，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul编著，第三版，1993)；(iv)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(vi)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341544-546)，它由VH结构域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体(nanobody)，含有单一可变结构域及两个恒定结构域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL与VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，使它们形成单一蛋白链，其中VL与VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，如Bird等人(1988)Science242423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在涵盖此类单链抗体。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规方法获得，并且对这些片段采用与完整抗体相同的方式进行有用性筛选。
此处所使用的“分离的抗体”旨在指基本上没有具备不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD70的分离的抗体是基本上没有特异性结合除CD70以外的抗原的抗体)。然而，特异地结合CD70的分离的抗体对其他抗原(例如来自其他物种的CD70分子)可能具有交叉反应性。在某些实施方案中，分离的抗体特异性结合人类CD70而不与其它非人类CD70抗原交叉反应。此外，分离的抗体可能基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
此处使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物展示了针对特定表位的单一结合特异性及亲和力。
此处使用的术语“人类抗体”旨在包括具有这样可变区的抗体，在这些可变区中，框架区及CDR区均衍生自人类种系免疫蛋白序列。此外，如果该抗体包括恒定区，则该恒定区也衍生自人类种系免疫球蛋白序列。人类抗体可以包括随后的修饰，包括天然或者合成的修饰。本发明的人类抗体可以包括不通过人类种系免疫球蛋白序列进行编码的氨基酸残基(例如，在体外由随机或定点特异性诱变或在体内由体细胞突变引入的突变)。然而，在此所使用的术语“人类抗体”并非旨在包括这样的抗体，其中来自另外的哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列已经被移植到人类框架序列上。
术语“人类单克隆抗体”指展示出单一结合特异性的抗体，这些抗体具有其中框架区以及CDR区均衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，人类单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的，该杂交瘤细胞包括融合至无限增殖化细胞的从转基因非人类动物(例如转基因小鼠)处获得的B细胞，其具有包括人类重链转基因及轻链转基因的基因组。
此处使用的术语“重组人类抗体”包括由重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(a)从动物(例如小鼠)或是由其制备出的杂交瘤(以下将进一步说明)中分离的抗体，该动物对于人类免疫球蛋白基因是转基因性的或转染色体性的；(b)从经转化以表达人类抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组的、组合的人类抗体文库中分离的抗体，以及(d)由其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，这些方法涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列。此类重组人类抗体具有其中框架区及CDR区均衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，此类重组的人类抗体可进行体外诱变(或者，当使用针对人类Ig序列的转基因动物时，进行体内体诱变)，并且因此重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是也许并不天然存在于体内人类抗体种系表达谱中的序列，尽管它们衍生自人类种系的VH和VL序列并与其相关。
此处使用的“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”此处可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人类抗体衍生物”指人类抗体的任何经修饰的形式，例如，该抗体与另一种试剂或抗体的偶联物。
术语“人源化抗体”旨在表示其中衍生自另一个哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列已被移植到人类框架序列上的抗体。可在人类框架序列中进行额外的框架区修饰。
术语“嵌合抗体”旨在表示其中可变区序列衍生于一个物种而恒定区序列衍生于另一个物种的抗体，如其中可变区序列衍生于小鼠抗体而恒定区序列衍生于人类抗体的抗体。
术语“抗体模拟物”旨在表示能够模拟抗体的结合抗原能力的分子，但是它们不局限于天然抗体结构。此类抗体模拟物的实例包括但不限于亲和体(Affibody)、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、抗运载蛋白(Anticalin)、高亲和性多聚体(Avimer)以及反向抗体(Versabody)，在模拟传统抗体结合时，所有这些抗体模拟物采用从不同机理产生并通过不同机理发挥作用的结合结构。
此处使用的术语“配偶体分子”指在抗体-配偶体分子偶联物中偶联至抗体的实体。配偶体分子的实例包括药物、毒素、标记分子(包括但不限于肽以及小分子标记物，如荧光染料标记物，以及单原子标记物，如放射性同位素)、蛋白质以及治疗剂。
此处使用的“特异性结合人类CD70”的抗体旨在指以5×10-8M或更小的KD结合人类CD70，更优选以1×10-8M或更小，更优选6×10-9M或更小，更优选3×10-9M或更小，甚至更优选2×10-9M或更小的KD结合人类CD70的抗体。
此处使用的术语“Kassoc”或“Ka”旨在指特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而此处使用的术语“Kdis”或“Kd，”旨在指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。此处使用的术语“KD”旨在指解离常数，它是由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)得到，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域已经充分确定的方法进行确定。确定抗体的KD的优选方法是通过使用表面等离子共振，优选使用诸如

系统的生物传感器系统。
此处使用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指对于靶抗原抗体具有的KD为1×10-7M或更小，更优选为1×10-8M或更小，更优选为1×10-9M或更小，并且甚至更优选为1×10-10M或更小。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和力”结合可以发生变化。例如，对于IgM同种型而言，“高亲和力”结合是指抗体具有的KD值为1×10-7M或更小，更优选为1×10-8M或更小，甚至更优选为1×10-9M或更小。
此处使用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指不结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即，以1×10-6M或更大，更优选为1×10-5M或更大，更优选为1×10-4M或更大，更优选为1×10-3M或更大，甚至更优选为1×10-2M或更大的KD结合蛋白质或细胞。
此处使用的术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、鱼、爬行动物等等。
符号“-”，不论是用作键或显示为垂直于键时均表示这样的点，在该点处所展示的部分连接到分子、固相支撑部分等的其余部分上。
除非另作说明，术语“烷基”就其本身或作为另一个取代基的部分而言指直链或支链或环烃基或它们的组合，它可能是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且能包括二价以及多价基，具有所指定的碳原子数目(即C1-C10是指1至10个碳原子)。饱和烃基的实例包括但不限于以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基以及例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物或异构体，等等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基以及3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级同系物以及异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意在包括那些以下详细说明的烷基衍生物，如“杂烷基”。限于烃基的烷基基团被称为“同型烷基”。
术语“亚烷基”就其本身或作为另一个取代基的部分而言是指衍生自烷烃的二价基团，例如但不局限于-CH2CH2CH2CH2-，并且进一步包括那些如下说明为“杂亚烷基”的基团。一般，烷基(或亚烷基)应具有1到24个碳原子，其中具有10个或更少的碳原子的那些基团在本发明中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短的链烷基或亚烷基，一般具有八个或更少的碳原子。
除非另作说明，术语“杂烷基”就其本身或与另一个术语组合，是指稳定的直链或支链或环烃基或它们的组合，由所提及数目的碳原子以及至少一个杂原子组成，该杂原子选自O、N、Si以及S，并且其中氮、碳以及硫原子可任选地受到氧化，并且氮杂原子可任选地受到季铵化。一个或多个杂原子O、N、S及Si可位于杂烷基的任何内部位置，或可位于烷基连接于该分子其余部分的位置上。实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2，-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3以及-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3以及-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”就其本身或作为另一个取代基的部分而言是指衍生自杂烷基的二价基，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-以及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可占据链末端的任一端或两端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基以及类似物)。术语“杂烷基”与“杂亚烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(参见例如，Shearwater PolymersCatalog，2001)。此外，对于亚烷基以及杂亚烷基连接基团，书写连接基团的式的方向并不表示连接基团的方向。例如，式-C(O)2R’-代表-C(O)2R’-以及-R’C(O)2-。
与术语“烷基”或“杂烷基”组合使用的术语“低级”是指具有1到6个碳原子的部分。
术语“烷氧基”、“烷氨基”、“烷基磺酰基”以及“烷硫基”(或硫代烷氧基)都是以它们的常规意义使用，并分别指通过氧原子、氨基基团、SO2基团或硫原子连接于该分子其余部分的那些烷基基团。术语“芳基磺酰基”是指通过SO2基团连接于分子其余部分的芳基，且术语“巯基”是指SH基团。
一般而言，“酰基取代基”也选自以上所给出的组。在此使用的术语“酰基取代基”指连接于羰基碳并满足其化合价的基团，该羰基碳直接或间接地连接于本发明化合物的多环核上。
除非另作说明，术语“环烷基”与“杂环烷基”，就它们本身或与其他术语组合而言，分别表示环型的取代或未取代的“烷基”以及取代或未取代的“杂烷基”。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环连接于分子的其余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基以及类似物。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基以及类似物。环结构的杂原子以及碳原子可任选地受到氧化。
除非另作说明，术语“卤”或“卤素”，就它们自身或作为另一个取代基的部分而言是指氟、氯、溴或碘原子。此外，术语如“卤烷基”是指包括单卤烷基以及聚卤烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”旨在包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯代丁基、3-溴丙基以及类似物。
除非另作说明，术语“芳基”是指取代或未取代的多不饱和的芳香烃取代基，它可以是单环或多环(优选地从1至3个环)的，这些环稠合在一起或以共价键相连接。术语“杂芳基”指含有从一至四个选自N、O以及S杂原子的芳基基团(或环)，其中氮、碳以及硫原子可任选地被氧化，并且氮原子可任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基以及杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。以上提到的每一个芳基以及杂芳基环体系的取代基选自以下说明的可接受的取代基。“芳基”以及“杂芳基”也包括环体系，其中一个或多个非芳香族环体系被稠合或者以其他方式结合至芳基或杂芳基体系上。
简言之，术语“芳基”当与其他术语组合使用时(如芳氧基、芳基硫氧基(arylthioxy)、芳烷基)包括以上定义的芳基环以及杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意在包括那些基团，其中芳基连接于烷基(例如苯甲基、苯乙基、吡啶甲基以及类似物)；该烷基包括其中碳原子(例如，亚甲基基团)已被例如氧原子替换的那些烷基基团(如苯氧甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基以及类似物)。
以上术语(如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”以及“杂芳基”)各自均包括指定基团的取代以及未取代这两种形式。以下提供每个类型基团的优选取代基。
烷基以及杂烷基(包括那些经常提到的如亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基以及杂环烯基)的取代基一般分别称为“烷基取代基”以及“杂烷基取代基”，并且它们可以是下述多种基团的一个或多个，这些基团选自但不限于-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R’”、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’”、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN以及-NO2，数量在从0到(2m’+1)的范围内，其中m’是这种基团的碳原子的总数。R’、R”、R’”以及R””各自均优选独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基，例如1至3个卤素取代的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时，每个R基团独立地选择，如对每个R’、R”、R’”以及R””基团选择一样。当R’和R”连接于相同的氮原子时，它们可与氮原子组合成5、6或7元环。例如，-NR’R”旨在包括但不局限于，1-吡咯烷基以及4-吗啉基。从以上取代基的讨论中，本领域中的技术人员会明白术语“烷基”旨在包括结合到不是氢基的基团上的碳原子的基团，例如卤烷基(如-CF3以及-CH2CF3)以及酰基(如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3以及类似物)。
类似于对烷基所说明的取代基，芳基取代基以及杂芳基取代基通常分别称为“芳基取代基”以及“杂芳基取代基”，并且是可改变的和选自，例如卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R’”、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’”、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN以及-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基以及氟(C1-C4)烷基，并且其数目从0到芳香环体系上开放(open)化合价的总数的范围内；以及其中R’、R”、R’”以及R””优选独立地选自氢、(C1-C8)烷基以及杂烷基、未取代的芳基以及杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基以及(未取代的芳基)氧-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时，每个R基团独立地选择，如对每个R’、R”、R’”以及R””基团选择一样。
可任选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个芳基取代基可由具有式为-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基替换，其中，T和U独立为-NR-、-O-、-CRR’-或单键；且q是从0到3的整数。可替代地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选由具有式为-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中，A和B独立地为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键；且r是从1到4的整数。如此形成的新环的单键之一可任选由双键代替。可替代地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地由具有式为-(CRR’)s-X-(CR”R’”)d-的取代基代替，其中s和d独立地是从0至3的整数，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。优选地，取代基R、R’、R”以及R’”独立地选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
此处使用的术语“二磷酸酯”包括但不局限于包含两个磷酸酯基团的磷酸的酯。术语“三磷酸酯”包括但不局限于包含三个磷酸酯基团的磷酸的酯。例如，具有二磷酸酯或三磷酸酯的特定的药物包括
此处使用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)以及硅(Si)。
符号“R”是一个通用缩写，它代表取代基，该取代基选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基以及取代或未取代的杂环基基团。
在以下各分部中进一步详细地说明了本发明的不同方面。
具有特定功能特性的抗-CD70抗体 本发明抗体的特征为抗体的特定功能特征或特性。例如，该抗体特异地结合人类CD70，例如表达在细胞表面的人类CD70。优选地，本发明的抗体以高亲和力结合CD70，例如以1×10-7M或更小的KD，更优选以5×10-8M或更小的KD，甚至更优选以1×10-8M或更小的KD结合CD70。评估抗体对CD70的结合亲和力的标准测定是本领域中已知的，包括例如ELISA、蛋白印迹法以及RIA。在实施例中详细地说明了适宜的测定。也可以用本领域中已知的标准测定评估抗体的结合动力学(如结合亲和力)，例如通过ELISA、Scatchard以及Biacore分析。作为另一个实例，本发明的抗体可以结合肾癌肿瘤细胞系，例如786-O、A-498、ACHN、Caki-1或Caki-2细胞系。作为又另一个实例，本发明的抗体可以结合B细胞肿瘤细胞系，例如Daudi、HuT 78、Raji或Granta-519细胞系。
本发明的抗-CD70抗体结合人类CD70，并且优选地表现以下特性中的一种或多种 (a)以1×10-7M或更小的KD结合人类CD70；并且 (b)结合肾细胞癌肿瘤细胞系； (c)结合淋巴瘤细胞系，如B细胞肿瘤细胞系； (d)被表达CD70的细胞内化； __(e)对表达CD70的细胞显示出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；以及 (f)当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的细胞的生长。
优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少两种。更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的至少三种。更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的四种。甚至更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)中的五种。甚至更优选地，该抗体表现出全部六种特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及(f)。
在另一个优选的实施方案中，该抗体与CD70结合的亲和力为5×10-9M或更小。在又另一个优选实施方案中，当该抗体与细胞毒素相偶联时在体内抗体抑制表达CD70的肿瘤细胞的生长。
本发明的抗体与CD70的结合可用一种或多种本领域已建立的技术进行评估。例如，在优选的实施方案中，抗体可用流式细胞术进行测试，其中该抗体与表达人类CD70的细胞系进行反应，例如已经得到转染而能在其表面表达CD70的CHO细胞，或表达CD70的细胞系，如786-O、A498、ACHN、Caki-1、和/或Caki-2(参见如实施例4和5中的适宜测定，以及对细胞系的进一步说明)。另外地或可选择地，抗体的结合，包括结合动力学(如KD值)可用BIAcore结合测定进行测试。其他适宜的结合测定包括ELISA测定，例如利用重组的CD70蛋白(参见如实施例1中的适宜测定)。
优选地，本发明的抗体与CD70蛋白结合的KD为5×10-8M或更小、与CD70蛋白结合的KD为3×10-8M或更小、与CD70蛋白结合的KD为1×10-8M或更小、与CD70蛋白结合的KD为7×10-9M或更小、与CD70蛋白结合的KD为6×10-9M或更小或者与CD70蛋白结合的KD为5×10-9M或更小。该抗体对CD70的结合亲和力可以通过例如标准BIACORE分析来评估。
在本领域已知通过表达CD70的细胞用于评估抗-CD70抗体的内化作用的标准测定(参见如在实施例7与21中说明的Hum-ZAP以及免疫荧光测定)。在本领域中也已知用于评估CD70与CD27的结合以及通过抗-CD70抗体对其抑制的标准测定(参见如在实施例17中说明的测定)。用于评估针对表达CD70的细胞的ADCC的标准测定在本领域中也是已知的(参见如在实施例9中说明的ADCC测定)。通过抗-CD70抗体以及其细胞毒素偶联物用于评估在体内抑制肿瘤细胞生长的标准测定在本领域中也是已知的(参见如在实施例18、19、24至31以及36至41中说明的肿瘤异种移植小鼠模型)。
本发明优选的抗体是人类单克隆抗体。另外地或可替代地，该抗体可以是，例如嵌合的或人源化的单克隆抗体。
单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4 本发明的示例性抗体包括人类单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4，它们如在实施例1与2所说明的那样进行分离并且进行结构性表征。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH氨基酸序列分别在SEQ ID NO1、2、3、4、5、73以及6中显示。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VL氨基酸序列分别在SEQID NO7、8、9、10、11、11以及12中显示(69A7与69A7Y均具有氨基酸序列SEQ ID NO11的VL)。考虑到这些抗体中每一种均能结合CD70，可将VH和VL序列进行“混合并匹配”，以产生本发明的其他抗-CD70结合分子。可以使用以上以及在实施例中说明的结合测定(如FACS或ELISA)来测试此类“混合并匹配”的抗体与CD70的结合。优选地，当VH和VL链得到混合并匹配时，来自特定VH/VL对的VH序列由结构相似的VH序列代替。同样地，优选来自特定VH/VL对的VL序列由结构相似的VL序列代替。
因此，一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括 (a)重链可变区，包括选自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6以及73的氨基酸序列；以及 (b)轻链可变区，包括选自SEQ ID NO7、8、9、10、11以及12的氨基酸序列； 其中该抗体特异性地结合CD70。
优选的重链及轻链组合包括 (a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO1；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO7；或 (a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO2；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO8；或 (a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO3；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO9；或 (a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO4；以及(b)轻链可变区，包括SEQ ID NO10的氨基酸序列；或 (a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO5或73；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO11；或 (a)重链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO6；以及(b)轻链可变区，包括氨基酸序列SEQ ID NO12。
另一方面，本发明提供了包括2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的重链和轻链CDR1、CDR2以及CDR3或它们的组合的抗体。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH CDR1氨基酸序列分别在SEQ ID NO13、14、15、16、17、17以及18中显示(69A7与69A7Y均具有SEQ ID NO17的VH CDR1序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH CDR2的氨基酸序列分别在SEQ ID NO19、20、21、22、23、23以及24中显示(69A7与69A7Y均具有在SEQ ID NO23中显示的VH CDR2序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VH CDR3的氨基酸序列分别在SEQ ID NO25、26、27、28、29、75以及30中显示。
2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VK CDR1的氨基酸序列分别在SEQ ID NO31、32、33、34、35、35以及36中显示(69A7与69A7Y均具有在SEQ ID NO35中显示的VK CDR1序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VK CDR2的氨基酸序列分别在SEQID NO37、38、39、40、41、41以及42中显示(69A7与69A7Y均具有在SEQ ID NO41中显示的VK CDR2序列)。2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的VKCDR3的氨基酸序列分别在SEQ ID NO43、44、45、46、47、47以及48中显示(69A7与69A7Y均有在SEQ ID NO47中显示的VK CDR3序列)。这些CDR区是用Kabat系统绘出的(Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。
鉴于这些抗体中每一种均能够结合CD70，并且主要由CDR1、CDR2及CDR3区提供抗原结合特异性，VH CDR1、CDR2、及CDR3序列以及Vk CDR1、CDR2、及CDR3序列可以得到“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以得到混合并匹配，但是每种抗体均必须包含VH CDR1、CDR2、及CDR3，以及Vk CDR1、CDR2，及CDR3)，以产生本发明的其他抗-CD70结合分子。使用以上及在实施例中说明的结合测定(如FACS、ELISA、Biacore分析)可以测试此类“混和并匹配”的抗体的CD70结合。优选地，当VH CDR序列得到混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3序列由结构相似的CDR序列代替。同样地，当VkCDR得到混合并且匹配时，来自特定Vk序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3序列由结构相似的CDR序列代替。对于本领域普通技术人员非常清楚的是，通过将来自在此披露的单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y以及1F4的CDR序列的结构类似序列代替一个或多个VH和/或VL CDR区序列，可以产生新的VH和VL序列。
因此，另一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括 (a)重链可变区CDR1，包括选自SEQ ID NO13、14、15、16、17以及18的氨基酸序列； (b)重链可变区CDR2，包括选自SEQ ID NO19、20、21、22、23以及24的氨基酸序列； (c)重链可变区CDR3，包括选自SEQ ID NO25、26、27、28、29、30以及75的氨基酸序列； (d)轻链可变区CDR1，包括选自SEQ ID NO31、32、33、34、35以及36的氨基酸序列； (e)轻链可变区CDR2，包括选自SEQ ID NO37、38、39、40、41以及42的氨基酸序列；以及 (f)轻链可变区CDR3，包括选自SEQ ID NO43、44、45、46、47以及48的氨基酸序列， 其中该抗体特异地结合CD70，优选结合人类CD70。
在优选的实施方案中，该抗体包括 (a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO13； (b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO19； (c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO25； (d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO31； (e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO37；以及 (f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO43。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括 (a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO14； (b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO20； (c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO26； (d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO32； (e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO38；以及 (f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO44。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括 (a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO15； (b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO21； (c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO27； (d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO33； (e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO39；以及 (f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO45。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括 (a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO16； (b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO22； (c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO28； (d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO34； (e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO40；以及 (f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO46。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括 (a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO17； (b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO23； (c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO29或75； (d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO35； (e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO41；以及 (f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO47。
在另一个优选的实施方案中，该抗体包括 (a)重链可变区CDR1，包括SEQ ID NO18； (b)重链可变区CDR2，包括SEQ ID NO24； (c)重链可变区CDR3，包括SEQ ID NO30； (d)轻链可变区CDR1，包括SEQ ID NO36； (e)轻链可变区CDR2，包括SEQ ID NO42；以及 (f)轻链可变区CDR3，包括SEQ ID NO48。
本领域熟知CDR3结构域不依赖于CDR1和/或CDR2结构域，可以独自确定抗体对同族抗原的结合特异性，并且可预测地产生多种抗体，这些抗体具有基于共同的CDR3序列的相同结合特异性。参见例如，Klimka等人，British J.of Cancer 83(2)252-260(2000)(说明了仅使用鼠类抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3来产生人源化抗CD30抗体)；Beiboer等人，J.Mol.Biol.296833-849(2000)(说明了仅使用亲代鼠类MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.958910-8915(1998)(说明了使用鼠类抗整联蛋白αvβ3抗体LM609的重链和轻链可变CDR3结构域的一系列人源化抗整联蛋白αvβ3抗体，其中每个成员抗体在CDR3结构域之外均包含不同的序列，并均能与亲代鼠类抗体一样结合相同的表位，并且其结合亲和力与亲代鼠类抗体一样高或比亲代鼠类抗体更高)；Barbas等人，J.Am.Chem.Soc.1162161-2162(1994)(披露CDR3结构域对抗原结合的作用最大)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.922529-2533(1995)(说明了将三个针对人类胎盘DNA的Fab(SI-1、SI-40以及SI-32)的重链CDR3序列移植到抗破伤风类毒素Fab的重链上，藉此替换存在的重链CDR3，并表明CDR3结构域独自赋予了结合特异性)；以及Ditzel等人，J.Immunol.157739-749(1996)(说明了移植研究，其中仅将亲代多特异性Fab LNA3的重链CDR3移植到结合破伤风类毒素Fab p313抗体的单特异性IgG重链上，就足以保留亲代Fab的结合特异性)；Berezov等人，BIAjournal 8Scientific Review 8(2001)(说明了基于抗HER2单克隆抗体的CDR3的肽模拟物)；Igarashi等人，J.Biochem(Tokyo)117452-7(1995)(说明了对应于抗磷脂酰丝氨酸抗体的CDR3结构域的12个氨基酸的合成多肽)；Bourgeois等人，J.Virol 72807-10(1998)(显示了衍生自抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体的重链CDR3结构域的单肽能够在体外中和该病毒)；Levi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.904374-8(1993)(说明了基于鼠类抗HIV抗体的重链CDR3结构域的肽)；Polymenis和Stoller，J.Immunol.1525218-5329(1994)(说明了通过移植Z-DNA结合抗体的重链CDR3区使得scFv能够结合)；以及Xu和Davis，Immunity 1337-45(2000)(说明了重链CDR3的多样性足以使得其他部分相同的IgM分子区分多种半抗原以及蛋白质抗原)。还参见于美国专利号6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905；以及5,760,185，说明了由单一CDR结构域定义的已获得专利的抗体。这些参考文献中每一篇的全文均由此合并作为参考。
因此，本发明提供包括来自衍生自人类或非人类动物抗体的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD70。在某些方面，本发明提供包括来自非人类抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD70。在一些实施方案中，此类创造性的抗体包括来自非人类抗体的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域，与相应的亲代的非人类抗体比较，(a)能与其竞争而进行结合；(b)保留功能特性；(c)结合到相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。
在其他方面，本发明提供的单克隆抗体包括来自人类抗体(例如，获自非人类动物的人类抗体)的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域，其中该人类抗体能够特异性结合CD70。在其他方面，本发明提供的单克隆抗体包括来自第一人类抗体(例如获自非人类动物的人类抗体)的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域，其中该第一人类抗体能够特异性结合CD70，并且其中来自该第一人类抗体的CDR3结构域替换缺乏CD70结合特异性的人类抗体的CDR3结构域，以产生能特异地结合CD70的第二人类抗体。在一些实施方案中，此类本发明的抗体包括来自第一人类抗体的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域，与相应的亲代第一人类抗体相比较，(a)能与其竞争而进行结合；(b)保留功能特性；(c)结合到相同的表位；和/或(d)具有相似的结合亲和力。
具有特定种系序列的抗体 在某些实施方案中，本发明的抗体包括来自特定的种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定的种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如，在优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VH 3-30.3基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VH 3-33基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VH 4-61基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VH 3-23基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD70。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VK L6基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异性结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VK L18基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异性结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VK L15基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异性结合CD70。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，包括作为人类VK A27基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异性结合CD70。
在其它另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或它的抗原结合部分，其中该抗体 (a)包括重链可变区，该重链可变区是人类VH 3-30.3、3-33、4-61或3-23基因的产物或衍生自该基因(这些基因所编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO61、62、63以及64中给出)； (b)包括轻链可变区，该轻链可变区是人类基因VK L6、L18、L15或A27基因的产物或衍生自该基因(这些基因所编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO65、66、67以及68中给出)；并且 (c)特异地结合CD70。
此类抗体也可能拥有以上详细说明的一个或多个功能特性，例如结合人类CD70的高亲和力、由表达CD70的细胞内化、介导针对表达CD70的细胞的ADCC的能力、和/或当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。
分别具有VH 3-30.3以及Vk L6的VH以及Vk的抗体的实例是2H5。分别具有VH3-30.3以及VK L18的VH以及VK的抗体的实例是10B4。分别具有VH 3-33以及VK L15的VH以及VK的抗体的实例是8B5和18E7。分别具有VH 4-61以及VK L6的VH以及VK的抗体的实例是69A7和69A7Y。分别具有VH 3-23以及VKA27的VH以及VK的抗体的实例是1F4。
此类抗体也可能拥有以上详细说明的一个或多个功能特性，例如结合人类CD70的高亲和力、由表达CD70的细胞内化、结合肾细胞癌肿瘤细胞系、结合淋巴瘤细胞系、介导针对表达CD70的细胞的ADCC的能力、和/或当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。
如在此所用，如果人类抗体的可变区从使用人类种系免疫球蛋白基因的系统中获得，则该人类抗体包含重链或轻链可变区，它是特定种系序列的“产物”或者“衍生于”该特定种系序列。此类系统包括用目的抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫，或者用目的抗原对展示在噬菌体上的人类免疫球蛋白基因文库进行筛选。是人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生于”该序列的人类抗体可以通过对该人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择在序列上最接近(即最大％同一性)人类抗体的序列的人类种系免疫球蛋白序列这样进行鉴定。是特定人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生于”该序列的人类抗体，与该种系序列相比可含有不同的氨基酸，这是由于例如天然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变。然而，经选择的人类抗体一般与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％的同一性，并且当与其他物种(例如，鼠类种系序列)的种系免疫球蛋白氨基酸序列进行比较时，包含将该人类抗体鉴定为人类抗体的氨基酸残基。在某些情况中，人类抗体与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可具有至少95％或甚至至少96％、97％、98％，或99％的同一性。一般，与由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列相比，衍生于该特定人类种系序列的人类抗体将展示不超过10个的氨基酸差异。在某些情况中，与由种系免疫球蛋白基因进行编码的氨基酸序列相比，该人类抗体可以展示出不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个的氨基酸差异。
同源抗体 在另一个实施方案中，本发明的抗体包括重链及轻链可变区，这些可变区包含与在此说明的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本发明抗CD70抗体的所希望的功能特性。
例如，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括重链可变区及轻链可变区，其中 (a)该重链可变区包括与选自SEQ ID NO1、2、3、4、5、6以及73的氨基酸序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列； (b)该轻链可变区包括与选自SEQ ID NO7、8、9、10、11、及12的氨基酸序列具有至少80％的同源性的氨基酸序列； (c)该抗体特异性与CD70相结合。
另外地或者可替代地，该抗体可具有以上讨论的以下功能特性中的一个或多个，例如结合人类CD70的高亲和力、由表达CD70的细胞内化、结合肾细胞癌肿瘤细胞系、结合淋巴瘤细胞系、介导针对表达CD70的细胞的ADCC的能力、和/或当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。
在不同的实施方案中，该抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与以上给出的序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。具有与以上给出的序列的VH以及VK区有高度同源性(即，80％或更高)的VH与VL区的抗体可以通过以下方式来获得对编码SEQ ID NO1-12和73的核酸分子进行诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)，然后用此处说明的功能测定法检测所编码、被改变的抗体的保留的功能(即以上所给出的功能)。
如在此所使用，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于两个序列之间的百分比同一性。在这两个序列之间的百分比同一性是在考虑空位数目、以及每个空位长度的情况下，这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目×100)，需要引入这些空位以用于两条序列的最佳比对。正如在以下的非限制性实施例中说明的，使用数学算法可以完成两条序列之间的序列比较以及百分比同一性的确定。
可以使用已经整合在ALIGN程序中(2.0版本)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12以及空位罚分为4，确定两个氨基酸序列的百分比同一性。此外，两个氨基酸序列的百分比同一性可以使用已经整合到GCG软件包中的GAP程序(可在www.gcg.com上获得)里的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))的算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6来确定。
另外地或者可替代地，本发明的蛋白质序列可以进一步作为“查询序列”而使用，对公共数据库进行检索，例如鉴定相关序列。使用Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215403-10的XBLAST程序(版本2.0)可以进行此类检索。用XBLAST程序，记分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索，以获得与本发明抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，如在Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中说明的可使用Gapped BLAST。当使用BLAST及Gapped BLAST程序时，对应的程序(如XBLAST及NBLAST)的默认参数是有用的。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守性修饰的抗体 在某些实施方案中，本发明的抗体包括含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的重链可变区以及含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个序列包括基于已知抗CD70抗体或它们保守性修饰的特定氨基酸序列，并且其中这些抗体保留了本发明抗CD70抗体的所希望的功能特性。本领域所理解的是可以进行某些保守性序列修饰，这些保守性序列修饰并不去除抗原结合。参见，例如，Brummell等人(1993)Biochem 321180-8(说明了在对沙门氏菌特异的抗体CDR3重链结构域的突变分析)；de Wildt等人(1997)Prot.Eng.10835-41(说明了抗UA1抗体的突变研究)；Komissarov等人(1997)J.Biol.Chem.27226864-26870(显示了在HCDR3中间的突变导致亲和力的消除或减低)；Hall等人(1992)J.Immunol.1491605-12(说明在CDR3区中的单一氨基酸改变消除了结合活性)；Kelley和O’Connell(1993)Biochem.326862-35(说明了酪氨酸残基在抗原结合中的作用)；Adib-Conquy等人(1998)Int.Immunol.10341-6(说明了疏水性在结合中的作用)以及Beers等人(2000)Clin.Can.Res.62835-43(说明了HCDR3氨基酸突变体)。因此，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的重链可变区以及含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的轻链可变区，其中 (a)重链可变区CDR3序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO25、26、27、28、29、30以及75，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列； (b)轻链可变区CDR3序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO43、44、45、46、47以及48，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列； (c)抗体与CD70特异性结合。
另外地或者可替代地，该抗体可拥有以上说明的以下功能特性中的一个或多个，例如结合人类CD70的高亲和力、被表达CD70的细胞内化、结合肾细胞癌肿瘤细胞系、结合淋巴瘤细胞系、介导针对表达CD70的细胞的ADCC的能力、和/或当与细胞毒素相偶联时在体内抑制表达CD70的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。
在优选的实施方案中，重链可变区CDR2序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO19、20、21、22、23以及24，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR2序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO37、38、39、40、41、以及42，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，重链可变区CDR1序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO13、14、15、16、17以及18，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列；并且轻链可变区CDR1序列包括选自氨基酸序列SEQ ID NO31、32、33、34、35以及36，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列。
在不同的实施方案中，该抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如在此所使用，术语“保守性序列修饰”旨在表示不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸的置换、插入以及缺失。通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变以及PCR介导的诱变，可将这些修饰引入本发明的抗体中。保守性氨基酸置换是以下这些置换，其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以由来自相同侧链家族的其他氨基酸残基所替换，并且使用在此说明的功能测定可以针对保留的功能(即，在以上给出的功能)测试被改变的抗体。
与本发明的抗-CD70抗体结合相同表位的抗体 在另一个实施方案中，本发明提供了抗体，其结合本发明任何CD70单克隆抗体所识别的人类CD70上的表位(即，有能力与本发明单克隆抗体中的任何抗体进行交叉竞争而结合CD70的抗体)。在优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参照抗体可以是单克隆抗体2H5(具有分别示于SEQ ID NO1和7的VH和VL序列)或单克隆抗体10B4(具有分别示于SEQ ID NO2和8的VH和VL序列)或单克隆抗体8B5(具有分别示于SEQ ID NO3和9的VH和VL序列)或单克隆抗体18E7(具有分别示于SEQ ID NO4和10的VH和VL序列)或单克隆抗体69A7(具有分别示于SEQ ID NO5和11的VH和VL序列)或单克隆抗体69A7Y(具有分别示于SEQ ID NO73和11的VH和VL序列)或单克隆抗体1F4(具有分别示于SEQ ID NO6和12的VH和VL序列)。
此类交叉竞争抗体可以在标准的CD70结合测定中基于它们与2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4进行交叉竞争的能力而被鉴别。可使用标准ELISA测定，其中将重组的人类CD70蛋白固定在板上，这些抗体中的一种用荧光进行标记，并且评价了未标记抗体进行竞争脱去标记的抗体的结合的能力。另外地或可替代地，BIAcore分析也可以用于评价抗体的交叉竞争的能力。例如，使用BIAcore的表位结合实验证明了2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4抗体结合CD70上不同的表位。测试抗体抑制例如2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4结合人类CD70的能力证明该测试抗体能与2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4竞争与人类CD70的结合，并且因此结合至由2H5(具有分别示于SEQ ID NO1和7的VH和VL序列)或10B4(具有分别示于SEQ ID NO2和8的VH和VL序列)或8B5(具有分别示于SEQ ID NO3和9的VH和VL序列)或18E7(具有分别示于SEQ ID NO4和10的VH和VL序列)或69A7(具有分别示于SEQ ID NO5和11的VH和VL序列)或69A7Y(具有分别示于SEQ ID NO73和11的VH和VL序列)或1F4(具有分别示于SEQ ID NO6和12的VH和VL序列)所识别的人类CD70的相同表位上。
在一个优选的实施方案中，结合至由2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4所识别的人类CD70上的相同表位的抗体是人类单克隆抗体。正如在实施例中所说明的，可以对此类人类单克隆抗体进行制备并分离。
经改造的并且经修饰的抗体 通过以下方式可以进一步制备本发明的抗体可以使用具有一个或多个本文公开的VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，以改造为经修饰的抗体，这种经修饰的抗体与起始抗体相比可能具有经改变的特性。通过在一个或两个可变区(即VH和/或VL)中，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个框架区内中修饰一个或多个残基，可以对抗体进行改造。另外地或可替代地，通过修饰恒定区中的残基，例如改变该抗体的效应物功能，能够对抗体进行改造。
在某些实施方案中，可以使用CDR移植以对抗体的可变区进行改造。抗体和靶抗原主要通过位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基进行相互作用。由于这一原因，在各个抗体之间的CDR的氨基酸序列比在CDR之外的序列更具有多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以通过构建包括来自被移植至框架序列(来自具有不同特性的不同抗体)上的特异天然发生抗体的CDR序列的表达载体，表达模拟特异天然发生抗体的特性的重组抗体是可能的(参见，例如Riechmann，L.等人(1998)Nature 332323-327；Jones，P.等人(1986)Nature321522-525；Queen，C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.8610029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，该单克隆抗体或其抗原结合部分包括含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2以及CDR3序列包括分别选自SEQID NO13、14、15、16、17和18，SEQ ID NO19、20、21、22、23和24，以及SEQ ID NO25、26、27、28、29、75和30的氨基酸序列；以及含有CDR1、CDR2以及CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2以及CDR3序列包括分别选自SEQ ID NO31、32、33、34、35和36，SEQ ID NO37、38、39、40、41和42，以及SEQ ID NO43、44、45、46、47和48的氨基酸序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7、69A7Y或1F4的VH和VLCDR序列，但是可包含与这些抗体不同的框架序列。
此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已公开的文献获得。例如，针对人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“Vbase”人类种系序列数据库中找到(在互联网在http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)，连同在以下献中找到Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生和人类服务部，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，等人(1992)“The Repertoire of Human Germline VH SequencesReveals about Fifty Groups of VH Segments with Different HypervariableLoops”J.Mol.Biol.227776-798；以及Cox，J.P.L.等人(1994)“ADirectory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage”Eur.J.Immunol.24827-836；这些文献中每一篇的内容均明确地通过引用结合于此作为参考。作为另一个实例，针对人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。例如，在HCo7HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列在所附的Genbank登录号中可获得1-69(NG_0010109、NT_024637、以及BC070333)、3-33(NG_0010109以及NT_024637)、以及3-7(NG_0010109以及NT_024637)。作为另一个实例，在HCo12HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列在所附的Genbank登录号中可获得1-69(NG_0010109、NT_024637、以及BC070333)、5-51(NG_0010109以及NT_024637)、4-34(NG_0010109以及NT_024637)、3-30.3(CAJ556644)、以及3-23(AJ406678)。然而人类重链和轻链种系序列的另一个来源为人类免疫球蛋白基因数据库，该数据库可获自IMGT(http://imgt.cines.fr)。
使用序列相似性检索方法之一的称为Gapped BLAST方法(Altschul等人(1997)Nucleic Acids Research 253389-3402)将抗体蛋白质序列和已编制的蛋白质序列数据库进行比较，这对本领域的技术人员而言是熟知的。BLAST是一种启发式算法，因为抗体序列与数据库序列之间统计学上的显著性比对可能包含比对字符的高得分片段对(HSP)。通过扩展或修正不能改善片段对分数的片段对被称为命中项(hit)。简言之，翻译VBASE来源的核苷酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)，并且保留在FR1至FR3框架区之间的区(包括FR1至FR3框架区)。这些数据库序列具有的平均长度为98个残基。去除重复序列(它们是蛋白质全长上的精确匹配)。用于蛋白质的BLAST检索使用程序blastp，其使用默认的、除了低复杂性过滤(它已被关闭)以外的标准参数，以及置换矩阵BLOSUM62，针对实现序列相配的前5个命中项的过滤。按全部六个读码框翻译核苷酸序列，并且认为在数据库序列的匹配片段中不具有终止密码子的读码框是潜在的命中项。进而使用BLAST程序tblastx对此结论进行确认，该程序以全部六个读码框翻译抗体序列，并且将这些翻译与以全部六个读码框动态翻译的VBASE核苷序列进行比较。可以如以上说明使用类似于VBASE的方法对其他人类种系序列数据库(例如可从IMGT(http://imgt.cines.fr)获得的数据库)进行检索。
同一性是抗体序列与蛋白质数据库之间在序列的全长上的精确的氨基酸匹配。这些阳性项(同一性+取代匹配)不是完全相同的，而是由BLOSUM62取代矩阵所引导的氨基酸取代。如果抗体序列以相同的同一性匹配数据库序列中的两条序列，则具有最大阳性的命中项将被判定为匹配的序列命中项。
可用于本发明抗体的优选框架序列是与所选择的本发明抗体所用框架序列在结构上类似的那些框架序列，例如类似于本发明优选的单克隆抗体所使用的以下框架序列VH 3-30.3框架序列(SEQ ID NO61)和/或VH 3-33框架序列(SEQ ID NO62)和/或VH 4-61框架序列(SEQ ID NO63)和/或VH 3-23框架序列(SEQ ID NO64)和/或VKL6框架序列(SEQ IDNO65)和/或VK L18框架序列(SEQ ID NO66)和/或VK L15框架序列(SEQ ID NO67)和/或VK A27框架序列(SEQ ID NO68)。
VH CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及VK CDR1、CDR2以及CDR3序列可以被移植至这样的框架结构区上，其具有与从中衍生出该框架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者这些CDR序列可以被移植至与种系序列相比含有一个或多个突变的框架结构区上。例如，已发现在某些情况下在框架区内对残基进行突变可能是有益的，以保持或增强该抗体的抗原结合能力(参见，例如Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是在VH和/或VK CDR1、CDR2和/或CDR3区中对氨基酸残基进行突变，由此改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变来引入一种或多种突变，并且对抗体的结合或其他目的功能特性的影响可以通过在此说明的以及在实施例中提供的体内或体外测定进行评估。优选引入保守性修饰(如以上所讨论)。这些突变可以是氨基酸置换、插入或缺失，但优选是置换。此外，一般在CDR区中改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗CD70单克隆抗体或其抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区包括(a)VH CDR1区，包括选自SEQ ID NO13、14、15、16、17和18的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO13、14、15、16、17和18相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。(b)VH CDR2区，包括选自SEQ ID NO19、20、21、22、23和24的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO19、20、21、22、23和24相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，包括选自SEQ IDNO25、26、27、28、29、75和30的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO25、26、27、28、29、75和30相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VK CDR1区，包括选自SEQ IDNO31、32、33、34、35和36的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO31、32、33、34、35和36相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VK CDR2区，包括选自SEQ ID NO37、38、39、40、41和42的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO37、38、39、40、41和42相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；以及(f)VK CDR3区，包括选自SEQ ID NO43、44、45、46、47和48的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO43、44、45、46、47和48相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明改造的抗体包括其中在VH和/或VK内已经对框架残基进行了修饰的抗体，如改善了抗体的特性。一般对此类框架进行修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一个方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成为相应的种系序列的残基。更确切地说，已经经历了体细胞突变的抗体可能包含与从中衍生出该抗体的种系序列不同的框架残基。此类残基可以通过将该抗体框架序列与从中衍生出该抗体的种系序列进行比较而被鉴定。本发明也旨在涵盖此类“回复突变”的抗体。例如，对于10B4，VH(位于FR1)的#2氨基酸是异亮氨酸而该在相应的VH 3-30.3种系序列中此残基是缬氨酸。为了将框架区序列返回至它们的种系序列，通过例如定点诱变或PCR介导的诱变，可以将体细胞突变“回复突变”为种系序列(例如，可以将10B4的VH中FR1的2号残基从异亮氨酸回复突变为缬氨酸)。
作为另一个实例，对于10B4而言，VH的氨基酸残基#30(在FR1内)为甘氨酸，而在VH 3-30.3种系序列中相应的这一残基为丝氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，10B4的VH的FR1的残基30可从甘氨酸“回复突变”到丝氨酸。
作为另一个实例，对于8B5而言，VH的氨基酸残基#24(在FR1内)为苏氨酸，而在VH 3-33种系序列中相应的这一残基为丙氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，8B5的VH的FR1的残基24可从苏氨酸“回复突变”到丙氨酸。
作为另一个实例，对于8B5而言，VH的氨基酸残基#77(在FR3内)为赖氨酸，而在VH 3-33种系序列中相应的这一残基为天冬酰胺。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，8B5的VH的FR3的残基11可从赖氨酸“回复突变”到天冬酰胺。
作为另一个实例，对于8B5而言，VH的氨基酸残基#80(在FR3内)是丝氨酸，而在相应的VH 3-33种系序列中这一残基是酪氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，8B5的VH的FR3的残基14可从丝氨酸“回复突变”到酪氨酸。
作为另一个例子，对于69A7而言，VH的氨基酸残基#50(FR2内)是亮氨酸，而在VH 4-61种系序列中相应的这一残基是异亮氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，69A7的VH的FR2的残基13可从亮氨酸“回复突变”到异亮氨酸。
作为另一个实例，对于69A7而言，VH的氨基酸残基#85(在FR3内)为精氨酸，而在VH 4-61种系序列中相应的这一残基为丝氨酸。为了使该框架结构区序列返回到它们的种系构型，例如，69A7的VH的FR3的残基18可从精氨酸“回复突变”到丝氨酸。
作为另一个实例，对于69A7而言，VH的氨基酸残基#89(在FR3内)为苏氨酸，而在VH 4-61种系序列中相应的这一残基为丙氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，69A7的VH的FR3的残基22可从苏氨酸“回复突变”到丙氨酸。
作为另一个实例，对于10B4而言，VL的氨基酸残基#46(在FR2内)为苯丙氨酸，而在VLL18种系序列中相应的这一残基为亮氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，10B4的VL的FR2的残基12可从苯丙氨酸“回复突变”到亮氨酸。
作为另一个实例，对于69A7而言，VL的氨基酸残基#49(在FR2内)为苯丙氨酸，而在VLL6种系序列中相应的这一残基为酪氨酸。为了使该框架区序列返回到它们的种系构型，例如，69A7的VL的FR2的残基15可从苯丙氨酸“回复突变”到酪氨酸。
另一种类型的框架修饰涉及在框架区内或甚至在一个或多个CDR区内的对一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，由此降低抗体的潜在的免疫原性。这一方法也称为“去免疫化”，并且在Carr等人的美国专利
发明者M·A·科恰, J·A·科雷特, D·J·金, C·帕恩, J·卡尔达雷利, M·亚马纳卡, K·A·亨宁 申请人:梅达雷克斯公司