高效透气装置及培养细胞的方法

专利名称：高效透气装置及培养细胞的方法
技术领域：
本发明涉及改进细胞培养效率的方法和装置。它们包括透气培养室的 使用，在维持均匀的培养条件时可减少空间的使用，并且更适合液体的向 动处理。它们包括将透气材料集成到传统的多层形式内，以解决细胞培养 条件不均匀的问题。它们包括使用由透气的、充有等离子体的硅酮构成的 表面，它们还能与传统的附着表面，例如由传统的经组织培养处理(tissue culture treated)的聚苯乙烯构成的那些表面，集成为 -体。它们包括将透 气、透液的膜集成为一体的培养装置。
背景技术：
细胞培养是生物技术的核心部分。组织培养瓶是细胞培养常用的装置，因为它们可以培养粘附性细胞类型也可以培养非粘附性细胞类型，是一次 性的，并且可在静态方式下工作而无需灌注培养基的设备。传统瓶有一个 培养室。它们的设计要求在装置内存在供培养物气体交换的气-液界面。培 养基的驻留高度必须很低，使得向细胞的氧传递不会受到削弱。对于组织 培养瓶，建议的培养基高度为2mm 3mm。然而，瓶体必须足够大以保持 气体，并允许使用(通常是)移液管吸取培养基。因此，相对其盛装的培 养基体积，培养瓶具有较大的装置体积。例如，常用的T一175培养瓶具有 大约长23cm、宽llcm的底面，大约高3.7cm，并因此需占936cm3的空间。 但是，其工作时培养基通常为约50ml。因此，相对培养瓶瓶体所占的空间 (936cm3)，在瓶体中的培养基(50ml)显示仅有瓶容积的约5%被培养 基占用。而且，将由培养瓶瓶体占用的空间(936cm3)的容积除以供细胞 驻留在上面的表面区域(175cm2)，表明由培养瓶占用的空间的容积是其 提供给细胞驻留其上的表面积的5倍以上。培养瓶制造成具有各种数量的 供细胞驻留其上的表面积，通常的面积为25 cm2 225 cm2，因此，只有 较小的培养容量。因为在培养放大期间使用越来越多的培养瓶，相对于它 们提供的较小的培养基体积和有限的培养表面积，它们占用的整个空间量 导致了固有的对于空间的低效利用，这加重了培养过程的负担，因为与运 输、灭菌、储藏、培养箱空间以及废弃处理相关的成本过高。工作量以及 污染风险的大幅增加进 一 步加深了这个问题。
多层培养瓶，如NUNCTM Cell Factory (美国专利No. 5,310，676)和 Corning CellSTACK⑧(美国专利No. 6,569,675)，试图通过以垂直方向堆叠 培养层以在一各培养瓶内形成多个培养室，来解决培养瓶放大效率低的问 题。这在一个装置内形成了更多的表面积，并且这使得可以有比传统培养 瓶中更多的细胞驻留在多层培养瓶内。这样， 一个多层培养瓶可以代替多 个传统培养瓶。该多层培养瓶可设置成使得培养基可以通过共用汇集点取 放，从而不需要用移液转通向A个培养室。这使得与传统培养瓶的^度相 比，多层培养瓶的各层之间的距离可以减低。例如，NUNCtm Cell Factory 的培养层之间的空间为约1.4cm，相对常用的T-175培养瓶的底部和顶部之 间3.7cm的距离，在储藏、运输、灭菌、培养和废弃处理空间的利用方面 有了一些改养。多层培养瓶中通气口允许与环境大气之间的气体交换，以 调节pH、供氧以及有助于维持温度控制。然而，在多层培养瓶内的任意给 定位置的气体与通气口位置的距离不同。由于在放大时多层培养瓶内培养 室数量增多，离通气口最远点的气体和最近点的气体之间的距离随之增大， 在多层培养瓶内的全部气体中会形成C02和02浓度梯度。闲此，多层培养瓶设计本身具有在整个装置内存在不均匀的培养条件不均匀的可能性， 该问题在放大时更加严重。
有许多静态细胞培养装置，它们通过使装置的下壁透气来实现气体传 递。气体通过透气下壁扩散，以响应形成在培养基和环境气体之间形成的 浓度梯度。这种方式不以气-液界面作为唯一的气体交换源。因为细胞驻留 其上的表面是透气的，与所述多层培养瓶相比会存在更均匀的培养条件。 培养袋是静态透气装置，其包含单一培养室。为了放大培养，培养袋必须 沿水平方向伸长，以获得供细胞驻留其上的更大表面积。因此，在放大时，
它们很快变得难以处理并且超出细胞培养箱的尺寸。OriGen Biomedical Group (OriGen PermaLife Bags)、 Baxter (Lifecell X-FolcFM涉及美国专利 4,829,002, 4,937， 194, 5,935,847, 6，297,046B1)、 Medtronic(Si-Culture ,美国 专禾U No. 5,686,304)、 Biovectra (VectraCell )以及American Fluoroseal (VueLife Culture Bag System,由美国专利4,847,462和4,945,203保护) 有市售培养袋。透气培养器是和培养袋以同样的方式工作的装置，区别在 于它们具有刚性的侧壁。市售透气培养器包括CLINIcell Culture Cassettes (由Laboratories MABIO-International 提供)禾卩Opticell 透气培养器 (美国专利6,455,310和6,410,309)(山BioChrystal Ltd.提供)。对于培养袋， 为了提供更多供细胞驻留其上的表面积，这些装置必须在水平方向伸11 。 在美国专利No. 6,821,772中，Opticel产的发明人提出了多个透气培养室。 不幸的是，这种方案仅仅增加了水平方向上的培养室数量。因此，无论培 养室的数量是多少，为了增加这些装置的培养容量，它们必须在水平方向 上制作得更大。这胜透气装置都不能在垂直方向放大。
在更有效地利用空间的努力中，美国专利No. 6,673,595记载了通过在 垂直方向堆叠独立的物理上不同的培养器，并且以非常复杂的自动化系统 来操作各独立培养器，来放大Opticell 透气培养器。这种放大方式明显背 离了传统多层培养瓶A有的简单性。
美国专利No. 6，759，245记载了 一种多层透气培养装置，其通过采用透 气不透液膜将氧输送和培养基输送相分离。该发明基于这样的发现，如果 通过透气不透液膜将液体培养基和含氧流体的流动分开，且细胞附着于膜 的液体侧生长，那么装置可用于利用穿过所述膜的氧传输来培养细胞，而 无需考虑液体培养基经过装置的流量。其优点在于液体培养基的流量不再 依赖于将氧携带至细胞的需求。然而，虽然培养基的流动大幅降低，因为 其仅需要携带如葡萄糖之类的物质，其失去了培养悬浮细胞的能力，因为 在使用时悬浮细胞会被从装置洗出。在这种方式中，细胞必须附着于胶原基体。另外的缺陷是需要灌注气体空间和/或液体空间。这需要泵、流体管 道，与传统多层培养瓶相比大大提高了复杂程度。因此，这种方式还没有 商业化。
共同未决美国专利申请No. 10/961,814 (Wilson等)记载了一种更有效 地利用空间的透气装置。Wilson等的'814记载的所述透气装置允许在垂直 方向放大，同时保留传统多层培养瓶的简单性。例如，Wilson等的'814 记载了透气装置的垂直放大，所述透气装置由一个一个堆叠的供细胞驻留 其上的培养层构成。气体传递通过装置的壁进行。与传统透气装置的放大 不同，可通过增加装置在垂直方向而非水平方向的尺寸来增加培养规模。 因为不需要气-液界面，这使得在垂直放大培养规模时优化了空间效率。得 到了相对所述多层培养瓶更加紧凑的装置。存在传统多层培养瓶中不可能 的特性。例如，所述装置可以倒转，以使得粘附细胞可以在堆叠培养层的 上表面和下表面上培养以进一步优化空间效率。本文记载的发明在共同未 决申请Wilson等的'314上进一步发展，得到了新的几何形状，其为传统多 层培养瓶提供了优良的替代方式。
本发明的目的是提供改进的细胞培养装置和方法，将整个装置内存在 不均匀培养条件的可能性降到最低，允许对粘附细胞或悬浮细胞进行空间 效率较高的培养放大，易于使用，可在无需灌注培养基或气体的前提下工 作，并使得使用者可以有效利用各培养室的上、下或侧壁表面。通过随后 的说明和附图可以使进 一 步的目的和优点变得清楚。

发明内容
本发明通过集成至少两个透气培养室，克服了现有静态细胞培养装置 的许多缺点，所述培养室至少部分地将气体空间保持在它们之间，以使得 气体可以与培养室的透气区域接触。这使得各培养室可以与邻近该培养室 的气体空间直接交换气体，将培养条件不均匀的可能性降到显低。培养室 的选定表面可以制成是透气的，以在与细胞相对和/或靠近细胞的表面上进 行气体交换。培养室内的表面可山各种材料构成，以提供供细胞驻留其上 的最佳表面。如果有需耍(例如在培养粘附细胞或在三维基体中生长的细 胞的情况下可能需要)，培养室内的表面积可以增大。细胞还可以直接驻 留在培养室的透气材料上。通过增加培养室使得气体空间至少部分地处在 各培养室之间，以允许气体与培养室的透气区域接触，来实现装置的放大。 通过一个或多个共用集流腔，或通向各培养室的独立通路，可以实现与培 养室的通路。凭借这种构造，可以用简单的方式放人培养规模，这种方式易于使用，有效利用空间，并将发生培养条件不均匀的可能性降到最低。 可以包括各种部件，并可以设置成各种构造，以提供附加的优点，包括使 得装置可以在一种以上的状态下操作，允许培养粘附细胞，允许培养悬浮 细胞，允许共培养，防止日常操作期间细胞离开它们各自的培养室，将补 料频次减到最低，利用传统培养瓶的操作方式，允许在培养期间增加或减 少共细胞驻留其上的表面积，允许在培养期间增加或减少培养基体积与共 细胞驻留其上的表面积的比率，以及/或允许细胞驻留在替代材料上或驻留 在替代材料附近。
本发明的一个方面中，各培养室包括第一壁和相对的第二壁，所述第 一壁和/或第二壁由透气材料构成，且气体空间存在于各培养室的至少一部 分之间。
在本发明的另一方面中，各培养室包括多个壁，包括但不限于第一壁 和相对的第二壁，第三壁和相对的第四壁，以及第五壁，所述第一壁和/或 第二壁和/或第三壁和/或第四壁和/或第五壁由透气材料构成，气体空间靠 近各培养室的至少透气部分。
在本发明的另一方面中，所述培养室由一集流腔平行连接。所述集流 腔可设胃成防止气体置换保持在培养室内的培养基，并且/或者可以设贾成 在操作期间将细胞保留在培养室内，并且/或者可以设置成将培养基和气体 保留在培养室内。
本发明的另 一方面中，培养室由超过一个集流腔平行连接。
在本发明的另一方面中，培养室的高度可以改变。
在本发明的另一方面中，培养室支架位于培养室之间，以将培养室保 持在基本上水平状态，并且/或者使得气体可以与培养室的透气表面接触。
本发明的另一方面中，培养室的壁包括于其相邻培养室中的至少一个 接触的突起部，以将培养室保持在基本上水平的状态，并使得气体可以与 培养室的透气表面接触。
本发明的另一方面中，提供了防止培养室的壁与相邻的培养室壁接触 的结构。
本发明的另一方面中，培养室串联连接。
本发明的另 一方面中，可以直接通向各培养室。
本发明的另一方面中，环境气体和透气多层装置的气体空间之间的接 触可以有选择地被终止，限制或不受限制。
本发明的另一方面中，将细胞从一个培养室扩展到多个培养室是可能的。
9本发明的另一方面中，当透气多层培养装置被定向成使得细胞驻留在 培养室最下方的培养表面上， 一个培养室的至少部分没有培养室直接位于 其上，以方便显微镜评价。
本发明的另一方面中，当透气多层培养装置被定向成使得细胞驻留在 培养室最下方的培养表面上，最下面的培养室和位于其上的培养室之间的 气体空间使得光可以存在在最下方培养室上，以方便用倒置式显微镜对最 下方培养室的评价。
本发明的另一方面中，通过将细胞接种到培养表面，并且重新定位装 置以使细胞的另一接种物沉降到不同培养表面，可以实现共培养细胞的方 法。
本发明的另一方面中，通过仅仅转动装置来一个表面一个表面地重新 定位细胞，可以实现在特定表面、在特定氧压力、和特定培养基高度、和/ 或在特定的培养基体积与表面积之比率下培养细胞的方法。还可以培养至 少5种不同的细胞系，各细胞系驻留在培养室的不同壁上。
本发明的另一方面中，培养室被制造成整体单元以将密封件的数量减 到最少。
本发明的另一方面中，透气多层装置可设置成保留市售的传统多层培 养瓶的结构，同时解决培养条件不均匀的问题。
本发明的另一方面中，公开了采用透气不透液材料，用于包括培养室 支架以及气体空间与环境气体之间的无菌屏障的透气细胞培养装置。
本发明的另一方面中，公开了用充等离子体的硅酮构造透气装置，以 将其向其它表面的迁移减到最低。


图1A和图1B示出了一种透气多层装置的实施方式，该装置设置成使 气体交换直接通过培养室的壁进行。该培养室通过集流腔平行连接以形成 完整单元，该单元包括存在于培养室之间的气体空间。通行端口允许流体 进出透气多层装置。
图2示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视阁，该装置设置成允 许气体通过培养室的第一壁传递，以允许通过处于离细胞最远距离的培养 基的表面进行气体交换。
图3示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视阁，该装置设胃成允 许气体通过培养室的第二壁传递，以允许细胞附近的气体交换。
图4示出了透气多层装置的 -种实施方式的剖视阁，该装贾被设置成允许通过培养室的第一壁和通过培养室的第二壁进行气体传递，以增加用 于气体交换的表面积。
图5A、 5B和5C示出了透气多层装置的立体图，所述装置被设置成具
有第一壁和相对的第二壁，第三壁和相对的第四壁，以及第五壁。通过有 选择地制造具有预定长度、宽度、表面积和材料成分的各个壁，以及具有 预定材料和表面积的各培养表面，使用者可以从多种培养方式种进行选择。 因此，通过仅仅改变所述透气多层装置的朝向，使用者可以使细胞处于各 种培养表面类型、培养表面积、氧压力和培养基体积与培养表面积之比率。
例如，当透气多层装置定向成如图5B所示时，培养基可以处于比透气多层 装置定向成如图5A所示时更高的高度。当透气多层装置定向成如图5C所 示，培养基会所处的高度可以超过当装置定向成如图5A或图5B中所示时 可能达到的高度。
图6示出了透气多层装置的剖视图，该装置设置有气阱，以防止气体 从培养室内部置换培养基。
图7A和7B示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图，其设置成 防止细胞在日常操作时离开培养室。图7C、 7D和7E示出了透气多层装置 的一种实施方式的剖视图，其被设置成使得培养基和气体以预定的体积处 f培养室内。
阁8A、8B、8C和8C-1示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图， 该装置设置有两个集流腔。培养室平行地连接在集流腔之间，形成包括邻 近各培养室的气体空间的整体争元。图8D和8E示出了在培养过程前或培 养过程中如何改变培养基体积和/或透气表而积与培养室容积的比率。
图9A和9B示出了培养室支架的用途，用于使得气体与培养室的透气 材料接触，并且/或者用于将培养室保持在基本上水平状态，以使得细胞均 匀地分布在培养室内。
图IO示出了培养室支架的用途，所述支架呈从培养室的壁部突出的突 起部形式，用于使得气体与培养室的透气材料接触，并且/或者用于将培养 室保持在基木上水平状态，以使得细胞均匀地分布在培养室内。
图11示出了处于培养室内的内部间隔件的作用，其用于防止壁以及/ 或者培养表面互相接触。
图12示出了透气多J3装置的一种实施方式的剖视图，其中培养室与进 口和出口以串联方式连接。培养室形成整体单元，并包括邻近各培养室的 气体空间。
图13示出了透气多层装置的一种实施方式的剖视图，所述装置设覽有
11独立的培养室和邻近各培养室的气体空间。其还示出了如何有选择地控制 环境气体至气体空间的通路。
图14示出了透气多层装置的另一种实施方式，其被设置为控制环境气 体至气体空间的通路。
图15示出了透气多层装置的另一种实施方式，其被设置为控制环境气 体至气体空间的通路。
图16A和16B示出了使用透气多层装置从一个培养室向多个培养室扩 展细胞的方法。
图17A示出了由硅酮成型的整体培养室，其将可能泄漏的连接件数量 减到最少。图17B示出了作为单个工件制造的培养室整体组合。图17C示 出了透气多层装置的分解图，其包括整体培养室，包覆成型法兰、两个集 流腔和培养室支架。
图18A示出了传统多层培养瓶制造商推荐的用于解决培养条件不均匀 问题的方式。图18B示出了该方式的放大图。图18C、 18D禾B18E示出了 透气多层装置的实施方式，所述装置设置成解决培养条件不均匀的问题， 同时集成了市售的传统多层培养瓶的特点。在一实施方式中，气体传递通 过装置的壁直接进行，使得在各培养室上的气体与周围环境的气体可以直 接进行气体交换。在另一实施方式中，气体空间位于装置内，使得装置内 的气体的气体交换通过气体空间的壁进行。气体空间的上壁可适用于使得 气体交换独立于气-液界面，并凡/或者气体空间的下壁可适用于使得气体通 过气-液界面传递到培养物。在另一实施方式中，气体空间通过透气装置的 壁与环境气体连通，气体空间的透气上壁作为培养室下壁，使得气体向培 养物的传递独立于气-液界面而进行。
图19不出了从胰岛细胞培养中采集的数据的柱状图，闲胰岛细胞高的 氧需求，胰岛细胞培养是一种非常具有挑战性的培养类型。良好的结果证 实，将有利的几何结构包括到其培养室支架中，透气多层装置独特的容量 节约了空间，并提供了均匀的培养条件。
图20示出了 -种试验装置的剖视图，该装置用于证实在将透气多层装 胃暴露于诸如伽马辐射之类的常用无菌处理之前，对由硅酮构成的材料充 等离子体以将硅酮向其它表面的迁移减到最少的作用。
具体实施例方式
图1A和图1B用于图示本发明的一些基本特征。在图示巾，透气多S 装置1集成了两个透气培养室20，这两个培养室部分地由气体空间50隔开。示出的两个培养室可说明一些基本的透气多层装置特征，但是可以设置任 意的附加数量的培养室。图1A为立体图，去除了侧壁以暴露培养室20的
内部。图IB示出了透气多层装置1的剖视图。培养室20包括第一壁110 和相对的第二壁120。第一壁110、第二壁120、或第一壁110和第二壁120 两者，可包括透气材料。象传统的细胞培养袋一样，第一壁IIO和第二壁 120可固定在一起而无需侧壁。然而，最好具有侧壁，使得在整个培养室范 围内，培养室的第一和第二壁之间的距离相同。还有，当所选的壁和侧壁 包括透气材料时，透气多层培养装置的朝向可设置成使其能以多种位置工 作，包括第一壁朝下、第二壁卓U或任意侧壁朝下。这使得细胞可驻留于 (靠近)任意壁。当培养室的长度、高度和宽度的尺寸不同时，透气多层 培养装置通过在接种和/或培养期间改变其位置，可提供独特的细胞上培养 基高度以及/或者独特的培养基与表面积的比率。根据接种时的朝向，细胞 会沉降到培养室内的任意表面。例如，处于图1B的位置时，细胞朝第二壁 120沉降。细胞接触的表面可以仅仅是培养室壁的内表面。然而，细胞驻留 其上的材料的期望成分和几何结构可以不是培养室壁的表面所代表的材料 成分和几何结构。这样，任意能提供期望的材料和几何结构的部件、插件、 基体等可构造成透气多层装胃。因此，培养表面130可以仅仅是给定的培 养室壁的内表面，或者可以是任意位于培养室内的部件、插件、基体等。 仅仅为方便起见，在本申请通篇中，培养表面130被描述为在装置壁的内 表面上，但这不限制本发明的范围。
如图1B所不，集流腔60形成培养室20之间的流体通道。通行口 70 使得可以加入或移除流体和细胞。在该图示中，通行U70包括颈部和以传 统培养瓶的方式覆盖通行口 70的盖f 30。然i(ij，通行U可以是任意构造， 并且I '了以位于任意位置，只要能够实现将流体移入和移出透气多层装置的 n的。细胞培养装置设计领域的普通技术人员可以认识到，可以有很多方 法来实现该目标，包括许多封闭系统构造，封闭系统构造可包括使用设贾 成可无菌插接的隔板、快拆配件、或管道。
气体空间50不需要是装置的密封部分。该气体空间不需要具有强制气 流，或适合于强制气流，来使装置工作。在该最简单和优化的形式中，仅 仅是环境气体与装贾的任意或全部透气部分相接触。然而，可以有一个或 多个壁包围该气体空间。
在简单的操作方法中，将培养基和细胞送入透气多层装置内，并将透 气多G装置放至lj标准的细胞培养箱内，该装置的朝向设置成使得细胞沉降 到期望的表面。在较复杂的操作方式中，可进行追加接种，使得细胞沉降到另外的表面。例如，在接种时定期地对装置重新定位，细胞会驻留在所 有的培养表面。
各培养表面130可以是任意合适的材料、任意可用于培养细胞的形状， 所述表面可以与也可以不与细胞培养室的壁成为一体。例如，培养表面可 以仅仅是包括了培养室的壁的内表面，也可以是经或不经组织培养处理。
该材料可以是如专利号为5,935,847的美国专利记载的，层积于培养室的壁 的材料。可以是与培养室的壁物理分离的材料，如位于壁上方的由聚苯乙 烯制成的分离部，可以是固定或不固定于壁，如以纤粘蛋白或胶原蛋白为 基质的插入件。如细胞和组织培养领域的技术人员已知的，对任意培养表 面的采用没有限制。
图2示出了怎样利用跨过培养室20的透气第一壁110的气体交换来实 现均匀的培养条件。氧气流箭头IOO示出了，作为培养基80和气体空间50 之间的氧浓度梯度的结果，氧怎样跨过透气的第一壁IIO输送到利用培养 基80驻留在培养表面B0上的细胞90。根据第一壁IIO的透气程度，最多 事实上培养基的整个上表面可同时暴露于包围着装置的环境气体，不象传 统的多层烧瓶，环境气体在位于离装置内各培养基位置不同距离的单一透 气部位进入装置。如本文所述，在一些实施方式中，透气多层装置被构造 成可以使气体和培养基驻留在培养室内。因此，运行期间，气体可驻留在 透气第一壁110的两侧。通常，气体冈气体空间和培养室内流体之间的分 压差而进出培养室。
.图3示出了跨过培养室的透气第—壁120的气体交换。氧气流箭头100 示出了，作为培养基80和气体空间50之间的浓度梯度的结果，氧怎样通 过透气第二壁120输送到驻留于培养室20内的细胞90。这样，各细胞室中 的细胞比传统多层培养瓶中的细胞离环境气体可以更近。应注意确保构成 培养表面130的材料对气体传递的阻碍，不会影响到对期望的细胞量进行 供氧的需求和维持合适的pH的需求。例如，如果透气第二壁120山高透1 性的材料勿1 二甲基硅酮构成，而透1性较低的培养表向—如聚苯乙烯位J'-该 硅酮上，则向细胞的气体传递会被阻碍。通常，位f细胞和环境气体源之 间的、对气体传输的阻碍程度最高的材料将成为限速因素。因此，为了优 化透气多层装置的功能，设计时应考虑用于构建透气壁的材料的透气性， 被使用的任意附加培养表面的透1性，以及培养物的氧需求。透气的多层 装置为提供合意的气体交换和合意的供细胞驻留的材料考虑到了许多可选 方案。然而，如果期望使用将会限制培养物气体交换的材料作为培养表面， 可以通过培养室的相对壁和/或侧壁来加强气体交换。图4示出了跨过培养室的透气第二膜120和跨过透气第一壁110的气 体交换。氧气流箭头100示出了，作为培养基80和气体空间50之间的浓 度梯度的结果，氧怎样通过透气第二壁120和透气第一壁110输送到培养 室20。这样，各培养室都可以实现高水平的气体传递。
虽然图2，图3和图4示出了通过特殊的壁的气体传递，但透气多层装 置的任意壁可以是透气性的。由于氧可直接通过细胞驻留的表面，和/或通 过培养室的侧壁，以及/或通过集流腔壁输送至细胞，从而可以获得各种优 点。Wilson等的'814记载了通过增加可驻留在透气培养室内的培养基高度 可以获得的优点。透气多层装置中的培养基高度的增加可远超过传统培养 瓶的2mm 3mm的限度，从而将培养基更换的频次降低到最低，减少工作 量并减少污染的风险。因此，如果可以进行跨越培养室的透气壁的气体传 递，有利的是，将培养室构造成使得透气壁和相对壁之间的距离允许增加 培养基高度。最佳距离取决于培养物的代谢需求和期望的培养基更换频次。
图5A、图5B和图5C示出了透气多层装置的放置方式的例子，这些放 置方式提供了许多可供选择的培养方式。例如，当第一壁110、和/或第二 壁120、和/或第三壁122、和/或第四壁124、和/或第五壁126由具有不同 透气件的材料构成时，通过将透气多层装置2定向成给定的状态，细胞会 处于不同的氧压力下。然而，不必使用不同的透气材料来进行费力的操作 方式。在第一壁110、和/或第二壁120、和/或第三壁122、和/或第四壁124、 和/或第五壁126附近的、与之成为一体或未成为一体的培养表面，其材料 或表面积可以不同。当第一壁110、禾ll/或第二壁122禾口/或第五壁126的大 小不同时，将透气多)3装置2朝向任意方位，也可提供了在培养之前或期 间的任京:时刻变更培养基的最大卨度。对培养室的形状进行改变甚至可产 生见多的可选方式。例如，由于装置朝向的变换，八角形为细胞提供了额 外的可驻留其h的表面。
为达到在透气多层装置内实现均匀的培养条件的R标，设计应包含这 样的目标将基本等量的细胞放置在各培养室内，并促使各培养室内的那 些细胞基本均匀地分布于整个培养室内。使各培养室的儿何结构基本相同、 将各培养室的相对的壁构造成基本平行、并使得培养室可放置成水平状态，
以使得细胞可均匀地沉降到培养表面上，这样会有助于达成该n标。然后，
当接种期间细胞处'j:均匀悬浮状态，且培养表面具有 一 致的几何结构时， 接种物会以均匀的体积驻留在各培养室的培养表面上，且细胞会以均匀的 分布沉积在各培养室的培养表面上。在培养表面不平坦，例如，存在起皱 的表面的情况下，将培养室设置成在每单位培养表向.上具有相同的空间体积，可有助于接种期间均匀的细胞分布。例如，如果培养表面起鮍，且相 对壁也起皱，该起皱的相对壁与培养表面之间的空间体积沿培养室的长度 方向会保持恒定。无论培养表面是怎样的几何结构，将培养室构造成使得 该培养室内的任意给定区域存在基本等体积的接种物，可有助于实现均匀 的细胞分布。
优选地，当利用集流腔向培养室输送培养基时，该集流腔应构造成使 得接种物均匀地分配到各培养室中，并使得沉积在集流腔内的细胞数量最 少。使集流腔容积不大于能让培养基快速并容易地充入培养室所需的大小， 这是有利的，因为驻留在滞留于集流腔内的培养基中的细胞会沉积到集流 腔的底部，并与驻留在培养室内的细胞处于不同的培养条件。虽然在接种 期间集流腔容积应最小化，以防止细胞沉积至不希望的区域，但是，允许 过量的培养基驻留在集流腔内以减少装置高度可能是有用的，因为那些培 养基会有助于提高各培养室内的培养基体积与表面积的比率。换句话说， 集流腔内的培养基体积会使驻留在细胞室内的细胞获取基质。
图6示出了透气多层装置3的剖视图，该装置被设置成使装置内可能
出现的气体进入不会对均匀培养条件的建立造成破坏的区域。集流腔60包 括气阱61。气阱61的至少一部分高于最上面的培养室20。在该图示中， 通行口 70由隔片72覆盖。装置巾的过量气体升到气阱61内，由此防止培 养基被置换出仟意的培养室。
在一些应用场合，期望在使用期间改变集流腔的形状或体积。将集流 腔构造成改变形状或体积应该以不会导致染菌的方式进行，例如可以通过 挠性壁或釆用垫圏或O形圈来实现。例如，期望通过共用柒流腔将细胞送 入培养室，并且防止细胞从 -个培养室移动到另一培养室或从培养室移动 到集流腔内。当以这样的方式操作装置时，可能会使培养室定向至会不小 心使细胞离开培养室的状态。堵塞培养室的一个或多个开U可以防止这种 情况发生。作为另一例子，譬如当细胞已附着在培养室内时，在使用期间 定期改变驻留在集流腔内的培养基的量是有利的，并且更多的培养基有利 于将补料频次降低到虽低。这样，可将柒流腔设S成具有更火的容积。在 其它应用场合，譬如当所期望的培养表面积与培养基体积的比率要求培养 基的驻留高度应该低于培养室高度吋，培养基最好不充满整个培养室。
阁7A和图7B示出了实现这些n标的方式的图不。在图7A巾，透气 多层装置4的集流腔壁62处于第-状态，允许将细胞和培养基经通行口 70 通过集流腔60导入培养室20。图7B示出了处于第二状态的集流腔壁，其 中集流腔60縮进，坫塞了培养室20的开U，防止细胞或培养基流出培养室20。培养室20可部分地盛有培养基，使得培养室20内驻留有培养基和 气体，并且集流腔壁62可移动到图7B的状态以防止培养基流失到集流腔 60内。然而，该实施方式也允许透气多层装置4被培养基完全充满，而无 需移动集流腔壁62。
图7C、图7D和图7E示出了用培养基部分填充培养室的例子。图7C 示出了透气多层装置4处于集流腔60朝向培养室20下方的状态，并且处 于其内部驻留有预定量的培养基80的第一开启状态。该预定量的培养基体 积少于各培养室的总容积。图7D示出了集流腔60被压縮，将培养基80 从集流腔60赶入培养室20。图7E示出了透气多层装置4呈水平朝向，使 得各培养室内驻留有培养基80和气体。当集流腔被闭合时，透气多层装置 的内部容积减少，压力升高。压力升高和培养室内气体与液体的比率、培 养室壁的挠性以及集流腔容积与装置容积的比率有关。压力的降低最终取 决于培养室的哪些表面是透气性的。然而，集流腔随着其容积减小而产生 的无菌通风可以更快地释放压力。本领域普通技术人员应认识到，有许多 方法将集流腔构造成符合这些目标，包括采用挠性壁、在径向密封构造中 设置有0形圈的刚性壁、以及其它方法(包括Wilson的美国专利No. 7,229,820中记载的)。
当在使用期间培养基的温度下降时，移动集流腔壁62可能也是有利的。 例如，胰岛细胞的培养的初始温度通常为37°C，然后降低至22"C。当透气 多层装置是封闭体且盛有培养某时，培养基会随温度下降而收縮。许多透 气材料是高挠性的。丙此，当培养基收缩时，所述装置的壁会发生移动， 以保持与培养基的接触。当所述壁移动，且细胞均匀地分布在壁上时，细 胞会从均匀状态移动至不受控制的密度，并因此会损伤培养物的活力。因 此，改变集流腔的容积以适应培养基体积的降低I 'J以防止细胞从其均匀状 态迁移。
如有需要，底脚135可以升高透气多层装置。底脚135使得气体可到 达装界下侧并且/或者防止划伤第二壁120。底脚135可以是任何形式，装 宵的上壁适于可将一个装贾以联锁方式放贾在另个装置之上。
将培养室与-个以上的集流腔平行连接，可使气体更容易被进入装胃 的液体贾换。例如，当-个集流腔被使用时，在培养基进入集流腔的相反 方向，气体被置换。带有一个集流腔的透气多层装置中，随若培养室^度 的降低，变得有必要倾斜该透气多层装覽以加速气体置换。形成附加的集 流腔使得气体能以培养基进入装置方向之外的方向置换，并可减低或消除 倾斜的必要性，山此简化A动流体处理。在测试装胃中，作了判定是否无
17需倾斜所述装置就可以灌满培养室的评估，当集流腔中的培养基体积为测
试装置中总容积的约7.0%时，可以实现灌满而无需倾斜。图8A、图8B和 图8C示出了采用两个集流腔的一实施方式。图8A示出了透气多层装置5， 删去了壁以暴露培养室20。气体空间50位于培养室20之间。在该图示中， 气体空间50为穿通透气多层装置5的整个主体的开口。图8B示出了透气 多层装置5，有部分被删去以暴露培养室20、第一壁110和集流腔60。图 8C和图8C-1示出了图8A中沿8C-8C线的剖视图，露出了培养室20、气 体空间50和集流腔60。在该实施方式中，液体进入通行口 70并灌满集流 腔60和培养室20，气体经由培养室20的远端上的另一集流腔60和第二通 行口 70被置换。
培养室的高度可以改变，以提供更多的操作方式。例如，如果将胰蛋白酶 的使用量减到最少，或增加培养基的高度，可能是有利的。图8D和图8E示 出了一种构造，其通过简单地由可打褶的挠性材料制作所述装置来实现培养室 高度改变，使得培养室20的高度可以上升或下降。例如，界定气体空间的外 壳和/或材料可以是挠性的。这样，透气多层装置可以膨胀，以使各培养室内的 容积更大或更小，这会有利于降低补料频次、减少胰蛋白酶和/或PBS的使用、 以及/或改变透气表面积与培养室容积之比。在该图示中，集流腔壁62是起皱 的，但所述装置可适于通过多种其它方式允许培养室高度的变化，包括美国专 利No. 7,229,820记载的方式。本领域普通技术人员可以认识到实现这种特性的 多种方式。
透气多层装置的优化性能中的一种因素是使用期间培养室的朝向。在 使用期间，透气多层装置最好应该处于基本上水平的状态，以使细胞均匀 地分布到细胞培养表面上。培养室支撑架可以象图5A所不的培养室支撑架 40那样简中-。这样，培养室支架40只提供简单的结构支撑以防止培养室互 相坍縮。然而，根据构成培养室的壁的材料的刚性，最好形成更加精心制 作的培养室支架。例如， 一些重要的细胞培养应用最好在非常受控的儿何 结构内进行，其涉及分布非常均匀细胞沉积物，如胰岛细胞、肝细胞和多 能成体机细胞(multipotent adult progenitor cell)的培养。例如，胰岛细胞 在高表面密度处接触时会发生聚集，多能成体祖细胞如果它们互相之间太 接近可能会发生分化。肝细胞和胰岛细胞还需要高的气体传输速率来维持 健康。因此，最坚固的培养室支架应该通过把有细胞向其沉降的壁保持在 基本水平的状态而实现均勾分布，并且不会过度地限制气体传输。为实现 这些优点，培养室支架应与培养室的壁接触。接触点的数量、接触点之间
的距离和与培养室支架直接接触的透气材料的表面积的大小属r设计所需考虑的因素。实施例1和实施例2提供了进一步的指导。
虽然可以将培养室支架永久固定于透气多层装置，但并非必须这样。 当使用者需要变换所述装置以适合更加受控的应用，或需要减低制造成本
时，这样做是较佳的。图9A和图9B示出了一种实施方式，其中培养室支 架是可重复使用的，并且透气多层装置的主体是一次性的。在图9A中，示 出了培养室支架42从透气多层装置6分离。在图9B中，培养室支架42被 放置成与透气多层装置6接触。突起部131从培养室支架42突出。突起部 131的高度及它们之间的距离应设计成它们可与透气多层装置的培养室充 分接触，以将细胞培养室保持在基本水平的状态，使得能在接种期间实现 均匀的细胞沉积。然而，与透气表面的接触会减少气体传递量。因此，必 须考虑实现水平状态的期望和想要的气体传递程度之间的平衡。根据被培 养的细胞类型，可以有不止一种优化设计。当希望与环境条件更好地连通 时，可以设置气体通行开口 132。在没有气体通行开口 132时，气体会在突 出有突起部131的表面，例如表面133之间移动，并且培养室气体交换的 阻力是突起部的数量、突起部的高度以及装置宽度的函数。在该图示中， 为了说明设计选项的多样性，最上面的培养室的第一壁没有处于被培养室 支架42保持的状态。如果培养室处于水平状态，如果盛有流体或受压流体， 或者如果它(该第一壁)山刚性材料构成，那种状态是可以的。还有，培 养室的第二壁120，如果其由刚性足够的材料构成而能在培养基处于其内部 的时候保持其形状，就不必与培养室支架接触。
培养室它们白身可构造成能起到使得环境气体可以与相邻培养室连通 的作用，同时保持期望的几何结构。Wilson等的美国专利No. 5,693,537记 载了具有突起部的壁可用于为培养室的相邻的壁提供支撑。图IO为剖视图， 其提供了一个如何保持期望的形状的例T。在该例子中，透气多层装置7 的第一壁110由刚性材料形成，并且透气第二壁120由如二甲基硅酮之类 的挠性材料构成。壁突起部150从第二壁120的表向-突出，以保持气体空 间50。 Wilson等的美国专利No. 5,714,384示出了突起部可ffl于增加气体传 递的表面积。本领域普通技术人员应理解，所述突起部可从第二壁(或者 从上壁和第二壁)的表面突出与相邻培养室的第一壁接触。作为选择力-式， 从培养室的壁的外侧表面突出的突起部可以在突起部之间互锁，或者与培 养室支架互锁。在另一方式中，所有的壁可以是挠性的，并且它们能在培 养基充入培养室时获得期望的形状。
给定培养室的上、下壁以及/或上下培养表面不应相互接触。例如，当 一培养表面是经组织培养处理的，且与相对壁接触，可能潜在地影响所述经组织培养处理的表面，可以在培养室内放置内部隔离物来确保阻止接触。 内部隔离物可以是任意生物相容材料，并且应该设置成使得培养基和流体 可以容易地移入和移出培养室。所述内部隔离物无需是独立部件，可以通 过从上壁和/或下壁、以及/或者上培养表面和/或下培养表面突出的突起部， 而实现在任意壁和/或培养表面之间保持希望的空间。图11示出了示范性的
例子，其中透气多层装置8的内部隔离物160是从培养表面130或壁110
突起的凸起部。本领域普通技术人员应认识到，内部隔离物可通过多种方 式构造，只要那些方法不会阻止培养基进入培养室或从培养室离开。 当培养室成竖向堆叠时，由于光线减少，对培养物中的细胞的显微镜
观察会受到妨碍。因此，如共同未决Wilson等的'814，中记载的那样，将 培养室从堆叠中偏移，对于允许采用倒置显微镜可能是有用的。另一可选 的方式是使所述气体空间能够接收光线，使得可以用倒置显微镜进行观察。 为此，培养室之间的距离应该足够大，以使光源可以照亮最下面的培养室 的内容物。光强度取决于培养室的材料和培养基的高度。优选使用透光性 好的材料。
图12示出了一种实施方式，其将培养室20串联连接。通过通行口70 输送进透气多层装置9的液体通过另一通行口 70置换气体，并且驻留在任 总期望数量的培养室20内。与环境气体连通的气体空间50处于培养室20 之间，并邻近透气材料。在该图示中，气体空间50处于穿通透气多层装置 9的整个主体的开口中。
在一些情况下，例如3各培养室含有不同的细胞类型或含有用于冋一 细胞类型的不同培养基组成时，可能期望个别地通向各培养室，即使它们 被集成为同一装置。可以有多种构造来实现这种方式。优选地，与各培养 室的通路被构造成使得可通过标准的液体操作方法(如移液或灌汴)或者 无菌或封闭体系方法(如隔膜或无菌管件连接)来实现这种方式。阁13示 出了 .种选择。在该以隔膜形式示出的图不中，可通过通行口70个别地通 向透气多/3装置10的培养室20。一个或多个通行U 70与各培养室20连接。 在该阁示中，气体空间50被设置成使得使用者可以将该气体空间与环境气 体连通，或阻.lh与环境气体连通。气体空间50由气体空间外壳51封闭。 气体空问外壳51中的气体空间通行开口 55使得气体空间50可以与周围环 境连通。气体空间通行开口 55 11」构造成根据需耍开启和闭合。对气体空间 50和环境气体之问的气体运动有选择地进行终止、限制或开启这样的功能， 可能是有用的。这种特征可存在于任意实施方式。例如，当透气多层装置 临时从C02环境移出时，关闭或限制气体空间通行开口 55可防止或延缓pH的变化。在另一例子中，给定细胞系的细胞可放置在各培养室中，与给 定培养室连通的气体空间可注入预定氧浓度，该气体空间可以封闭，且可 以对各种氧浓度对细胞生长和/或功能的影响进行研究。本领域普通技术人 员应认识到，有很多种用于开启或关闭气体空间通行开口 55的方法，包括
鲁尔(luer)接头和塞子、端口和盖子等。
图14示出了透气多层装置的另一实施方式，该装置被设置成，当该装 置从标准组织培养箱取出以在福乐罩(flow hood)中进行液体操作时，可 以限制pH变化的速度。气体空间外壳51封闭透气多层装置11的气体空间 50。通过在从培养箱取出之前关闭开口 55的气体通行盖53，可以将气体空 间50与环境气体隔离，从而在气体空间50内保留期望的CO2水平。优选 地，气体空间50内的气体容量足以支撑气体通行盖53关闭期间培养物的 氧需求。因此，所述装置中的细胞或组织的数量以及氧需求，是确定最佳 容量时需要考虑的。
图15示出了透气多层装置的另一实施方式，该装置被设置成，当该装 置从标准组织培养箱取出以在福乐罩(flow hood)中进行液体操作时，可 以限制pH变化的速度。这种情况下，气体空间50沿该透气多层装置的一 侧向环境气体开放。气体交换控制缘57从透气多层装置12的该侧延伸， 在该图示中作为气体空问外壳51的结构件。当透气多层装置12朝向为， 使得气体交换控制缘57与平坦表面，例如层流罩的底板平齐时，气体空间 50和环境气体之间的气体交换被终止或基本上被限制，以此降低pH变化 速度。当透气多层装置不具有控制pH变化的结构并且从培养箱被移出时， 使pH变化速度最小化的另一种简单的方法是，将其放置于密闭空间，例如 带盖的箱体内。为提供该优点，所述盖不必是气密性的。只耍所述盖和箱 体之间的气体通道的剖面卩「 口小于气体空间和环境气体之间的剖面开口 ， 就会产生对气体交换速度的限制以及pH变化的延缓。当透气多层装置位于 箱体内部时，箱体内的气体体积应该减到最小。而且，在将透气多层装置 放入箱体内之前，可对箱体做预先处斑，使其包含培养箱的气体组成。
新的透气多层装置允许在传统多层培养瓶中不可能的操作方式。例如， 细胞可从一层扩展到其它层。接种、扩展和收集粘附细胞这样的循环(其 不受剩余的胰蛋白酶的不利影响)，提供了该封闭体系过程如何发挥功能 的一个例子。图16A示出了透气多层装置13的剖视图，培养基80和细胞 处于其下层培养室20内。为了将粘附细胞扩展至如图16B所示的多个培养 室内，可以进行简单的操作顺序。首先，移除培养基80。然后将PBS引入 下层培养室以冲洗残留培养基。随后移除PBS。然后，将胰蛋白,或仟意其它脱壁材料(detachment material)引入下层培养室，以从附着表面释放 细胞。然后，可通过加入培养基80将细胞再分布到上培养室，这将胰蛋白 酶稀释至不会影响细胞附着的水平。如果细胞受到任何残留胰蛋白酶的影 响，可以移除细胞并用常规手段离心出残留的胰蛋白酶。然后，可将细胞 再引入到适当体积的培养基中，使得它们驻留在期望数量的培养室内。对 于悬浮细胞，只要添加适量体积的培养基就可以容易地扩展至另外的培养 室。这样，相对传统的多层培养瓶，可以将用来形成接种物的辅助装置的 采用最少化。由于透气多层装置可设置成适合密闭的体系通路(closed system access)，也可以降低污染的可能性。
细胞驻留于侧壁表面上的能力也可形成优点，所述优点包括使细胞从 具有一尺寸的表面区域扩展到尺寸更大的表面上的能力。例如，当通过使 透气多层装置定向成如图5C所示的状态，可利用少量的接种物开始培养， 该接种物将驻留在壁126附近。然后，当培养物的数量扩增时，通过将所 述装置重新定向至图5B的状态，可以获得更多的表面积。如果需要，细胞 可以在重定向前从壁126被胰蛋白酶化以增加表面积。如果需要进一步扩 增，可再对所述装置进行重新定向至图5A的状态。接着，通过前面段落描 述的方法可以进一步扩增。
通常与细胞培养装置或医疗器械相关的任意材料可用子遍及所述透气 多层装置。优选地，选用的材料符合USP(美国药典)VI和/或ISO 10993 的相容性标准。还有，敁好具有透光性，闪为这使得可以对污染和pH进行 目视检测。为了形成可以通过倒置型显微镜观察的表面，优选SPE2(球概 率误差2)或更"。
用于使得气体「' J以传递进/出透气多层装置透气材料的透气材料t' J由透 气细胞培养装置所使用的，或者如前面记载的用于透气细胞培养装置的任 意膜、薄胶、材料或所用材料的组合构成，例如硅酮、氟乙烯聚丙烯 (flouroethylenepolypropylene)、聚烯烃、聚苯乙烯薄膜，以及乙烯-醋酸 乙烯共聚物。f' J以获得很多用来了解透气材料及其细胞培养中的ffl途的指 南资料，包括但不限于美,专利No. 5,693,537、美W专利No. 6,455,310、 美国专利No. 6,297,046、[，际专利申请公开WO 01/92462和共同未决美国 专利申诺No. 10/961,814。其它的信息来源可以在Plastic Design Library, William Andrew Publishing, "Permeability and Other Film Properties of Plastics and Elastomers", 1995中找到。本说明书通篇使用的词语硅酮包括美 国专利No. 6,045,877中记载的制剂。
如Wilson等的美国专利5,693,537记载，透气材料可以是透液件材料。这些材料包括其整个横截面为亲水性的膜，例如由纤维素、醋酸纤维素和 再生纤维素构成的膜。然而，在评价这些材料的效用的试验中，发现最好
采取防止污染的措施，这在Wilson等的'537没有预期。应小心确保选用
的材料的透液性足够的低，以在培养室内保持期望体积的培养基。而且， 液体损失会使摩尔渗透压浓度升高到有害的水平。优选地，在给定的培养
基静压力条件下，在补料间隔期，选用的材料能够将大于约90%的培养基 体积保持在培养室内。在补料期间，摩尔渗透压浓度得以恢复。在补料间 隔为两天的情况下，由静压力导致的液体损失因此最好应该限制于培养装 置内的培养基体积每天损失的比率小于约5%。例如，已经发现，在培养基 体积为每cm2膜至少对应10.16ml培养基的情况下，截留分子量为10,000 的80M Cupraphan⑧膜是可以接受的材料。所述材料可以是薄的且能提供充 分的气体传递。在由Wilson Wolf Manufacturing制造的CELLine CLIOOO 细胞培养器产品中进行的试验中，使用由80MCupraphan⑧构成的低透气材 料，证明了在其上培养至少400xl06个鼠杂交瘤细胞的能力。除了不使用 80M Cupraphan⑧作为低透气膜，所述装置的所有其它方面与市售产品相同， 其集成了不透液的透气膜。在该试验中，表面密度至少为4x106个细胞/cm2 透气膜。然而，虽然在培养室内没有检测到污染，但膜外侧被污染了。因 此，用透气透液材料制造透气多层装置最好应该通过采用由无菌过滤器保 护的、通向气体空间的气体空间通路开口来限制通向气体空间的通路。可 以采用通常用于防止污染的任意透气过滤材料，例如微孔膜。为了最大程 度地防止污染，孔径可以在0.45pm以下，最好为0.2)im。然而，采用透气 透液材料并不限于仅仅是所述透气多层装置的实施方式。其它透气结构， 包括象例如Opticell 产品(在美国专利No. 6,821,772巾有部分记载)那 样简单的结构，可以集成至少一种透气透液膜(例如Cupraphan )。作为 其它例子，通过配置包括与两透析膜或任一透析膜接触的气体空间的优选 结构，并通过采用由无菌过滤器保护的通向气体空间的气体空间通路开口 ， 通常与细胞培养无关的Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes (美国专利No. 5,503,741)可以作为培养装置使用。
当将透气多层装置设置成，其可被定向成其中培养悬浮细胞的第一状 态，或者其可被定向成其中培养粘附细胞的另一状态时，构造透气多层装 背的优选设置应该使得细胞培养室的一个培养表面是疏水的，而另一表面 是亲水的。可通过任意的剖视图来阐述实例。例如，参考图4，第一壁110 可以是透气的且其内表面可以经组织培养处理以形成一培养表面，而第二 壁120的内表面可以是疏水的，以形成另一培养表面。因此，为培养粘附细胞，操作透气多层装置时可以使第一壁IIO位于第二壁120下方。因此，
为培养悬浮细胞，操作透气多层装置时可以使第二壁120位于第一壁110 下方。如果粘附细胞附着于第一壁110，然后对装置重新定向以使悬浮细胞 可以处于第二壁120上，可以进行共培养。可用于其上培养悬浮细胞的材 料为硅酮，可用于在其上培养粘附细胞的典型材料为经组织处理的聚苯乙 烯。因此，在本实例中，优选的实施方式可以是，第二壁120由硅酮构成， 而第一壁110的培养表面由经组织培养处理的聚苯乙烯构成。然而，已经 发现，如果使用硅酮，其会在伽马辐射或电子束杀菌期间发生迁移，并且 覆盖培养室内经组织处理的表面。这使得该经组织处理的表面变得不是最 适合粘附细胞。因此，在存在该最有用的材料时，常用的灭菌方法变得不 实用。其它的灭菌方法也会有问题。例如，ETO (环氧乙垸)会保留在硅 酮中，且不经很大范围的毒素冲洗，就会存在对细胞有害的环境。化学手 段灭菌也需要冲洗。通过向硅酮添加色素、禾口/或改变固化温度和时间、禾口/ 或将硅酮预先暴露于高剂量的伽马辐射、和/或改变硅酮至聚苯乙烯的距离 来解决问题的努力并没有消除问题。然而，已经发现，在使所述装置经受 伽马辐射之前用等离子体充硅酮，并可以将硅酮迁移到聚苯乙烯表面上的 问题减到最小或者消除该问题。因此，在存在经组织培养处理的表而(优 选聚苯乙烯)的情况下，采用硅酮的优选丄艺是，确保在伽马辐射之前对 硅酮充等离子体。这种形成细胞培养装置的方法不限于透气多层装置。这 种方法使得任意透气培养装置可以在存在经组织处理表面的情况下集成充 有等离子体的硅酮，其好处站可以防止硅酮在使用如伽马辐射或电丫-束之 类的传统灭菌方法期间发生迁移。例如，通过在存在处理表面的情况下采 用充有等离子体fi卡酮，对Wilson等的'814或美国专利No. 6,821,772巾记 载的装置是有益的。例如，市售的OpticellTM产品可以集成一经组织培养 处理的聚苯乙烯表面和相对的由充有等离子体硅酮构成的透气表面。这样， 当用标准方法灭齒时，可以在由硅酮构成的表面上培养悬浮细胞，并且/或 者可以在由聚苯乙烯构成的表面上培养粘附细胞。该产品能将膜之间的惯 常距离整合在一起，就像现在的情况，或者将如Wilson等的'814记载的 增加的距离整合在一起。
图17A示出了由硅酮成型的培养室，其使导致泄漏的连接件数量最少。 釆用二甲基硅酮是有利的，因为它可以成型成复杂的几何样式，并且这对 许多悬浮细胞培养应用是有益的。培养室20'包括法兰21。在该构造中， 可以省去壁交叉处的连接件。这样，它是一体化培养室，其可以进行模块 化装置设计。法兰21可以胶粘到其它硅酮表面，或同定于任意表面，从而可制成一连串培养室用于装配至集流腔壁。或者， 一连串的培养室可以预 制，以装配到集流腔壁，所述装配至集流腔壁通过下述方法进行在法兰 前面设置刚性板，在法兰后面设置刚性板，将这些刚性板连接在一起，然 后将该子配件装配至集流腔壁。在装配之前，可以在培养室内设置任意替 换的培养表面。该一体化培养室不必限于只有一个培养室。可以将一个以 上的培养室成型为整体件以形成也可以进行模块化装配的一体化培养室。 虽然对于高需求的培养，气体传递区域中的厚度希望优选为小于或等于约
0.022英寸，更优选地小于或等于0.010英寸，且最好小于约0.008英寸， 当细胞没有呈现出高的氧需求时，更大的厚度也是可以采用的。在制造过 程中，较厚的硅酮截面可能是有利的。通常，硅酮越厚，其越容易制造。 然而，上壁和下壁为约0.007英寸厚的一体化的二甲基硅酮培养室是可以制 造的。侧壁为约0.004英寸厚的一体化的二甲基硅酮培养室也是可以制造 的。虽然图中示出了不止一个法兰，但一体化培养室不必有一个以上的法 兰。因此，当希望只有一个集流腔时，培养室的一端可以封死。
在优选实施方式中，所有培养室模制成整体件，该整体件带有可固定 于集流腔壁的共用法兰。图17B示出了一体化培养室20，，，其是包括法兰 152的一连串成型的透气材料培养室(最好是二甲基硅酮)。作为法兰支承 件的塑料(例如聚碳酸酯)刚性件可直接成型(即，包覆成型)到法兰上， 以作为后续进一步装配的垫板。在该图示中，法兰支承件153包覆成型到 各法兰152上。如图17C的分解装配图所示，法兰支承件153以液体不能 渗透的方式配合至集流腔壁62，以形成位于培养室各端部的集流腔。在评 价将二甲基硅酮粘结至刚性塑料的能力时，获得二甲基硅酮和生物相容性 聚碳酸酯之间的不透液粘结。所述聚碳酸酯材料放置于模具中，并将硅酮 以液体注射成型工艺直接配合至所述聚碳酸酯。可以加入培养室支架，所 述支架可以是例如本文记载的和/或图10和图11所示的任意结构。如果形 成为如图1所示的那样，突起部可以是延伸穿越整个培养室的肋部。在图 17C的阁示中，存在一系列培养室支架42'。对于多种悬浮细胞而言，这是 -种有用的构造，甚至不需耍通过引入培养表面作进一步改造。然而，增 加培养表面仍然是可选方式。当预定的应用可能包括使用粘附细胞时，优 选地，硅酮的内表面覆盖有适合被培养细胞类型的典型粘附表面。对多种 粘附细胞而言，插入经组织处理的聚苯乙烯作为培养表面可能是有利的。 这使得可以进行多种培养方式。例如，为培养粘附细胞和悬浮细胞两者， 所述装置可定向成使得粘附细胞可以沉降至lj经组织处理的培养表面，并且 在附着后，旋转180度以使悬浮细胞可以驻留在相对的硅酮壁上。如果图17的构造希望形成为包括经组织处理培养表面而非硅酮，通过 用不同的培养表面覆盖所有硅酮内表面，对硅酮充等离子体以防止电子束 或伽马灭菌期间的迁移能够避免。例如，可插入薄的经组织处理聚苯乙烯， 使其覆盖全部硅酮。当集流腔壁不是会发生迁移的材料时，经处理聚苯乙 烯表面将保持为适合粘附性培养物。虽然所述培养表面(本实例中为聚苯 乙烯)提供了供细胞附着的表面，与假如它只是硅酮的情况相比，它会阻 止气体传递进细胞培养室。因此，期望细胞驻留其上的培养表面(或多个 表面)应该是薄的，以使气体传递仍然是充分的。优选地，在细胞驻留其 上的聚苯乙烯区域的厚度为约0.003英寸或更薄。这种方式减少了连接件的 数量并降低了渗漏的可能性，同时提供适合任意给定应用的培养表面。
图18C、图18D和图18E示出了另一实施方式的优点，其使得培养室 可以部分地盛有培养基，并且/或者使胰蛋白酶、PBS或任意其它与从细胞 室移除细胞有关的液体的体积最小。在该实施方式中，本发明的优点被直 接整合至传统的多层培养瓶(诸如NUNCTM Cell Factory、 NUNC Triple Flask和Corning CellSTACK )的形式。图18A是NUNCTM在网站上的 示图，描绘了它们的Cell Factory for Active Gassing的运行，其期望克服气 体组成不均匀的问题。该气体处理系统使丁艺复杂化，其需要ft道连接件、 无菌过滤器、独立的气体供给和备用的增湿过程，冈为干燥气休混合物的 持续流动会使培养基很快蒸发，并使摩尔渗透压浓度增加到影响细胞生长 和功能的水平。图18B是图18A的NUNC 方式的放大图，具有表示强 制气流的箭头，并标出了壁224和222以供参考。该透气多层培养瓶可以 解决气体组成不均匀的问题，而不需要传统多层培养瓶必须的辅助设备或 强制气流。图18C、图18D和图18E所/K-的实施方式的优点是，它们可以 集成传统多层培养瓶(例如市售的培养瓶，以及例如美国专利No. 5,310,676、美国专利No. 6,569,675和英国专利说明书GB 1539263A中记载 的那些培养瓶)的结构特征，包括使得培养基可以等量地被分配至各层的 任意或全部结构特征。图18C示出了透气多层培养瓶200的实施方式，其 中无需传统多层培养瓶必需的辅助装晋或强制气流就可以实现均匀的培养 条件。至少壁224禾ll/或壁222的一部分是透气的，允L亇气体空间250与环 境气体之间的气体连通。传统培养室可位于该装置内，优选地，具有由聚 苯乙烯构成的培养层220。培养室壁220被构造成处在传统的高度以保持培 养基和细胞，使得，作为在培养基80和气体空间250之问的界面气体传递 的结果，细胞90接收氧。集流腔260可构造成如在传统培养瓶巾那样。对 于透气材料而言，二甲基硅酮是好的选择，因为其可以液体注射成型成壳
26体，或者，其可以包覆成型到如聚碳酸酯之类的刚性壁上。然而，如前所 述，在预期使用伽马辐射的情况下，硅酮应该是充有等离子体。优选地， 壁的透气面积以相等的几何关系分布于各培养室，从而使得各培养室可以 获得相等的气体传递。换言之，各培养室与透气材料的间距应该相等。在 透气材料区域，可以设置防止损坏的保护装置和结构支架，只要提供这些 特性的构件允许气体可以通向气体空间。因此，可选用的侧壁支架240起
到该功能。其由气体通行开口 242和/或突起部241构成。优选地，侧壁支 架是刚性的透明材料。
图18D示出了另一种消除对强制通气的需求的方式，在传统多层装置 中，强制通气是作为一种提供均匀培养条件的方式。该构造将透气材料集 成在装置本体内。气体空间251是穿过透气多层装置201的至少一部分本 体的开口。因此，气体空间251由上气体空间壁210和下气体空间壁215 限定。它可以是贯穿整个本体的开口，类似于图8A和图8B示出的图示。 它不需要完全穿过装置，而可以在装置内终止。它的任意壁可以是透气的。 然而，上气体空间壁210不必是透气的来克服传统多层培养瓶中的培养条 件不均匀的问题。当气体空间251的任意其它壁由透气材料构成时，就可 解决该问题。例如，气体空间壁210可以是聚苯乙烯，其厚度不提供足够 的气体传递，只要气体空间251的至少其它一个壁或儿个壁由确实提供足 够气体传递的材料构成。在装置本体内均衡的区域进行气体传递，为利用 1液界面进行气体交换的传统细胞培养提供了比传统多层培养瓶更加均匀 的气体环境。透气多层装置不需耍仅以传统多层培养瓶的方式操作。如果 上气体空间壁210由透气材料构成，气体传递可独立于气液界面而进行。 上"t体空间壁210可与侧壁225紧密配合以形成细胞培养室。然后，例如， 如果期望增加培养基高度以将补料频次减到最少或延缓由蒸发引起的摩尔 渗透压浓度的变化，可将培养基加至任意期望高度，只要培养室侧壁225 的高度相应增加，如WUson等的'314记载。
图18E示出了改造传统多层培养瓶形成透气多层培养瓶的图示，该透 气多层培养瓶设有透气壁，当通过装置的侧壁发生气体传递时，该透气壁 供细胞驻留其上。与传统多层培养瓶相比，这提供了为培养方法提供了更 多的选择，并解决了培养条件不均匀的问题。透气多层培养瓶202设置为 它的壁(如侧壁224和222)的至少一部分由透气材料构成。如果需要，透 气区域应该象图18C描述的那样被支撑。再参见图18E，培养室底部245 由透1材料构成，并最好由培养室支架243支撑，所述支架可包括突起部 241和/或气体通行开口 242。培养室壁225可以是允许培养基80处于期望高度所需的任意高度。集流腔260可构造成如传统培养瓶那样。 实施例
实施例1和实施例2评估了培养室支架的交替几何结构，以定量地表
明透气多层培养瓶可以解决传统培养瓶的对货运、灭菌、存储、培养箱和 处理空间的资源利用过多的问题，同时将存在不均匀培养条件的可能性降 到最低。
实施例3记载了伽马辐射之前充有等离子的硅酮能限制或防止其迁移
到经组织培养处理的聚苯乙烯表面，以此使得硅酮和经组织培养处理的塑 料可以共存在同一培养室内而仍可利用标准灭菌工艺。
实施例1
用于氧需求非常高的培养物的培养室支架结构 通过构建试验装置来展示培养室支架的物理结构，该结构可以改善胰 岛细胞培养(已知是氧需求最高的类型之一)，所述装置的下壁由测得的
平均厚度为0.0072英寸、表面积为98cm2的成型二甲基硅酮片构成。 MOCON (Minneapolis, MN)利用他们的Oxtran 2/21 Instrument,根据美同材 料试验协会ASTM—1927测得的二甲基硅酮橡胶的透气率在37'C时约为 14，300 mlo2/100 in2/24 hours。支撑二甲基硅酮的培养室由与所述硅酮直接 接触的0.048cm厚、46%敞口格网构成。敞口格网由一组聚内烯线构成， 所述聚丙烯线各自的直径为0.018-0.020英寸，呈垂直和水平排列，使得毎 英寸水平距离以及每英寸垂直距离有16股线。所述格网由厚度为0.19cm 的聚碳酸酯成型塑料板保持在其位置上，具有均匀分布的突起，所述突起 将格网架高在所述片上方，使得气体空间位于所述膜下面。各突起部为统 '的"Y"形，而"Y"的各个边成120度分开。各个边的长度为0.45cm，且宽 度为0.127cm。因此，各突起部的、可用于支撑格网的表面积为约0.175cm2。 每cm、h有约1.1个突起部。因此，可用于支撑格网的突起部的累积表面积 为约18.87cm2。各突起部白塑料板起的高度为0.127cm。气体空间处于硅酮 底部和塑料板顶部之间。被突起部取代的累积气体体积为2.4cm3。被格网 取代的累积气体体积为2.54cm3。因此，处于硅酮膜下方并处于塑料板上方 的气体为约17.2ml。处于硅酮膜下方并处于塑料板上方的气体弓透气膜表 面积之比为17.6%。内塑料板包括作为气体通行开口的通孔(各通孔的截 面定向为与塑料板的平面垂直)，使得环境气体可以通过被动扩散与气体 空间连通。位于所述表面积为98cm2的二甲基硅酮下面的五个均匀隔开的
28通孔(各孔具有0.29 cm2的截面积和0.075英寸的长度)，形成1.45cn^的 累积截面积。因此，通孔的截面积与硅酮膜的截面积的比率为1.45 cm2/98 cm2，或约1.48%。从而，通孔的截面积与处于硅酮膜和塑料板的上表面之 间的气体体积的比率为1.45cm2/17.2ml，或约8.4%。足部高出塑料板底部 0.51cm。因此，位于硅酮膜下面的培养室支架的总高度为0.87cm。
下述定义和縮略语用于理解胰岛细胞的评估 培养瓶对照 依赖于气液界面获得氧的装置，最大接种200
IE/cm2 ， IE与培养基之比为1000 IE/ml，得到0.2cm 的最大培养基深度。该对照用于将GP装置(透气装 置)与培养瓶中的标准胰岛细胞培养方法作比较。 GP装置 试验装置，其底部由包括表面积98cn^的透气二甲基
硅酮构成并由如实施例1和实施例2中记载的结构支 撑。
IE (胰岛细胞当量)胰岛细胞体积的度量，等于直径150pm胰岛细胞的体
积。作为具有刚刚分离的胰岛铍褶的脉管系统，其体 积下降且其密度增加。因此，在第0天和第2天，IE 具有相同的体积，质量不同。
山DNA计量的IE 或DNA IE
IE人工计数
胰岛细胞比活力 胰岛细胞表面密度
培养基稀释度
非GP装置
胰岛细胞质量的直接度量，等于11.4ngDNA。 IE数量传统地由人:l:计数，这种方式不考虑胰岛细胞 的平坦度和密度。对于18例猪胰岛分离物，第0天 通过DNA计量的IE为人工计数IE的63±12% (范围 为49-93%)。数量通常随培养物中胰岛细胞体积的下 降而减小，仍情况并非总是如此，因为人工计数易丁-出错。除非另有注明，IE指传统地由人工计数的IE。 存活胰岛细胞量的比
在给定表面积上培养的胰岛细胞的体积，用IE/cm2 表示。15 0 直径的胰岛细胞的合流方阵列具有4444 IE/cm2。
培养基体积与驻留在装置内的胰岛细胞数量的比例，用 (il/IE表示。
一种对照装置，具有与GP装胃相同的几何结构，但是 没有透气膜(用作试验对照，具有与GP装覽相同的培 养条件，以定量分析透气膜结构的优点)。猪分离 采用Ricordi法(Ricordi Method)从猪胰腺获得胰岛细
胞的过程。
OCR 氧消耗速率，以nmol/min表示。活胰岛细胞量的度
OCR/DNA 每DNA含量的OCR，以nmol/miivmg DNA表示。
p值 报告的p值针对双尾配对Student t检验。
回收 在后来时间仍存在胰岛细胞属性(例如，DNA、IE、OCR)
的比例。
利用猪胰岛细胞进行初始评估，以确定需要什么样的培养基体积对IE 的比率。猪胰岛细胞在二甲基硅酮表面积为18cn^的小型GP装置内于37。C 培养2天，在200 IE/cn^下，1 |il/IE和4 pl/IE的培养基稀释度没有表现出 胰岛细胞活力(通过OCR/DNA评估)的统计学差异。对于5例猪分离样， 4 pl/IE时的OCR/DNA是1 pl/IE时的97.5% 102.4% ，综合平均值为101 %。基于该发现，采用1 Hl/IE的培养基稀释度进行实施例1和实施例2中 记载的批量评估。
在一系列试验中使用来自10例猪分离物的胰岛细胞，其主要目的是 确定在GP装置内是否可以达到超过常规方法的、范围为约1000 IE/cm2 2551 IE/cm2 (人工计数)(DNA计数为490 IE/cm2 2551 IE/cm2)表面 密度，而与小于约200 IE/cm2 (人工计数)的常规表面密度下的培养瓶对 照(即，气液界面)相比没有损失比活力。非GP装置对照存在这样的假设， 培养室支架结构仅仅使得细胞驻留其上的表面成水平状态，而没有提供气 体输送，从而会导致差的胰岛细胞活力。需讨论的是，在设法使胰岛细胞 处T均匀分布而不会因聚柒lflj损伤健康的同时，按如上所述设界的培养室 支架允许向胰岛细胞输送足够的氧的能力。GP装置构造成使得胰岛细胞在 98cn^的二甲基硅酮表面上均匀分布。在GP装置内的平均胰岛细胞表面密 度为1526 IE/cm2 (人工计数)。基于GP装置的比活力与代表性的培养瓶 对照的比活力的比率，GP装胃表现出相等的活力，标准偏差为9.4%， p 值为0.9987。因此，表叨了培养室支架能使气体被动传递进入培养室，所 述被动传递进入的速率允许表面密度至少比传统方法平均岛7倍，而不损 失胰岛细胞的活力(通过OCR/DNA测定)。其表明，培养室支架可构造 成使得环境气体可以存在于培养室支架的、与邻近该培养室支架的透气表 面相对的相反侧，沿培养室支架被动地移动，然后与细胞驻留其上的表而 垂直，然后被动地在细胞驻留于其上的透气表面下方流通，此时以超过传 统培养装置所允许的七倍提供足够的氧传递来支持胰岛细胞。实施例2
在另一胰岛细胞培养应用中对与实施例1不同的培养室支架的物理结 构进行考察。在本实施例中，试验装置包括与实施例1中本质上相同的透 气材料。支撑二甲基硅酮的培养室由与硅酮直接接触的敞口格网构成，并 且机加工的聚碳酸酯塑料板将所述格网支撑成基本呈水平状态。与实施例1 的培养室支架不同，格网直接位于塑料板的上表面上。格网的几何形状和 材料成分与实施例1的相同。对于每cn^的硅酮膜表面积，硅酮下表面和 塑料底部的上表面之间的气体体积在被格网取代后为0.022ml。换言之，塑 料板和透气膜之间的气体体积与透气膜的表面积之比为2.2%。为了使得环 境气体可以通过被动扩散与气体空间连通，在塑料底部中存在作为气体通 行开口的通孔，各通孔的截面定向为与格网的平面垂直。各通孔的直径为 0.125英寸。所述通孔在二甲基硅酮下面以栅格形式均匀隔开，使得各孔中 心之间的距离为0.375英寸。各通孔的长度为0.13英寸。通孔的截面积与 硅酮膜的截面积的比率为约16%。通孔的截面积与塑料板和透气膜之间的 气体体积的比率为273%。由于格网的高度为0.019英寸，二甲基硅酮和处 于塑料底部下面的气体之间的总计高度为约0.15英寸。八个均匀分布的底 脚，从其所处的培养层表面计，将塑料底部的周边部分抬卨0.41cm。底部 的周长为23.94cm。塑料底部下侧和其处于上面的表面(该表面由此向环境 气体的运动开放)之间的截面积为7.59cm2。不考虑作为气体运动限流器的 底脚，绕将气体运动开放至透气二甲基硅酮位贯的周边的截面积为 9.85cm2。因此，培养室支架的高度为约0.5英寸。
在一系列试验中采用来自5例猪分离的胰岛细胞，主要y的是确定是
否能够在GP装置中达到平均约1628 IE/cm2 (人工计数)(DNA计数为 927 IE/cm2)的、超过常规的表面密度，而与培养瓶对照和非GP装置相比 不损失比活力。需讨论的是，在设法使胰岛细胞处于均匀分布而不会因聚 集I (l J损伤健康的同时，按如上所述设置的培养室支架允许向胰岛细胞输送 足够的氧的能力。如果如实施例1中所示，胰岛细胞显示出与对照类似的 活力，培养室支架形成为替代几何形状的能力将得到体现。几何形状的主 要差别是，实施例1采用突起部，而实施例2使得格网宵.接位于平坦的塑 料底部上。为了对缺少突起部进行补偿，实施例2的几何形状中，气体通 行开口截面积与透气材料表面积的比率与实施例1相比增加约8倍。将胰 岛细胞放青到GP装置内，使得胰岛细胞均匀地分布在二甲基硅酮表面上。 基f GP装置的比活力与代表性的培养瓶对照的比活力的比率，GP装置表现出相等的活力，标准偏差为13.8%， p值为0.9681。因此，证实了替代几 何形状的培养室支架可以使得气体能以允许与传统方法相比至少平均增加 8倍的表面密度的速率被动传递进入培养室，而不损伤通过OCR/DNA测得 的胰岛细胞活力。
以与对照相比大幅度增加的表面密度(超过培养瓶的常规表面密度200 IE/cm2约7倍至41倍)，来考验所述透气试验装置。以平均比培养瓶的传 统表面密度增大约18倍的表面密度，对总共20例猪分离物进行评价。数 据具有较大程度的可变性，GP装置表现出代表性培养瓶对照的96.0%的平 均活力，标准偏差为21.9%， p值为0.43。
图19概括示出了与非GP装置比较的结果，结果以培养瓶对照的百分 比表示。显然，仅仅将培养室保持水平从而均匀分布胰岛细胞的培养室支 架必须包括提供足够气体交换的容量，如通过随着增加非GP装置内的表面 密度而损伤胰岛细胞健康所表明的。实施例1和实施例2说明了至少有两 种截然不同的培养室支架，在被集成到透气多层装置设计中时，可以获得 有效利用空间的独特优点。
该信息有利于表明透气多层装置相对传统多层装置的空间优势。例如， 在胰岛细胞移植来治愈I艰糖尿病的领域中，目标是培养至800,000IE (人 工计数)。目前的200 IE/cm2表面密度的培养瓶方法将需要4000 cm2的 培养表面积。如果使用市售传统多层培养瓶，例如NUNC Cell Factory, 形成4000 cm2的培养农面积将需要约六个它的632 cm4咅养层。这样构造 的NUNC Cell Factor将占用约416立方英、j-的空间，并且胰岛细胞处于 可能不均匀的生长条件。然而，考虑到上述实施例，透气多层装置可以在 小得多的空间内培养800,000IE。例如，其能以约1526 IE/cm2 1628 IE/cm2 的平均表面密度培养胰岛细胞，使得它只需要约500cm2的培养表面积来成 功培养800，000IE。如果在透气多层装置内采用六个培养层，如NUNCTM Cell Factory所耍求的，各层将只需耍83cm2的表面积。如果培养基且接位于胰 岛细胞上，各培养室的高度为约1.6cm (0.63英寸)以达到与Cell Factory (即luL/IE)相同的补料频次。培养室支架的卨度(即，培养室之问的垂 直距离)不需超过实施例中的高度。上述实施例表明，各培养室支架的高 度可以是0.344英寸。就尺寸而言，透气多层装置可以约5.8英寸高、3.6 英寸宽和3.6英寸长，占用空间约76英、j' 3。与传统多层培养瓶占用416 英、J'3空间相比，这样可以减少超过500%的货运、火菌、储藏、培养箱以 及废弃处理空间。而且，克服了传统培养瓶的培养条件不均匀的问题。注 意到使用例如图10中所示的构造可以进一歩降低培养室之间的距离，就象上述实施例的培养室的下底脚距离所展示的的那样。 实施例3
将伽马辐射期间的硅酮迁移减到最低
试验装置162构造成如图20的截面图所示。测试样品165由二甲基硅 酮构成，并被放置到市售聚苯乙烯组织处理六孔板167 (COSTAR 3516) 的本体的顶部上。然后将聚苯乙烯盖168放置到六孔板167上。通过在伽 马辐射之前对测试样品165充等离子体，对硅酮迁移到盖内表面169上以 及迁移到经组织培养处理表面166上最小化的能力进行评价。测试样品165 位于距离经组织培养处理表面166约1.78cm的位置，并距离盖内表面169 小于2mm。在一次评价中，在将测试样品165放置到试验装置162内之前， 对其进行充等离子体，通过水滴接触角为96度以及表面能小于30达因确 认等离子体电荷的存在。在另一次评价中，在将测试样品165放置到试验 装置162内前未进行充等离子体。在两次评价中，对装置依次进行伽马辐 射。然后，实施化学分析用电子能谱法(ESCA)，以定量分析各种表面的 元素组成。评估经组织培养处理表面166与作为对照的6孔板的经组织培 养处理表面相比是否存在硅酮、氧和碳，所述作为对照的6孔板在没有硅 酮测试样品165的情况下进行伽马辐射。对盖内表面169是否存在硅酮进 行评估。表1汇总了测试结果。
表1测试条件%硅酮%氧%碳
经组织培养处斑表面166 (对照)2.30920.18277.508
经组织培养处理表面166(存在充有等离 子体的硅酮测试样品165)2.68819.54977.783
盖内表面169(存在充有等离子体的硅酮 测试样品165)2.3246.90290.049
经组织培养处理表面166(存在未充等离 子的硅酮测试样品165)24.11650.6525.243
盖内表面169(存在未充等离子体硅酮测 试样品165)16.30759.51124.183
这些结果显示，在伽马辐射前将等离子电荷施加到硅酮防止了不希望
33的硅酮迁移，并且为细胞培养处理的表面保持基本不变。Corning⑧六孔板， 在不存在硅酮的条件下进行伽马辐射(即，对照)，就象集成了带等离子 体硅酮的Corning⑧六孔板那样，呈现出其经组织培养处理表面上存在约20 %的氧。相反，集成了不带等离子体硅酮的Corning⑧六孔板呈现出氧成分 变化很大，为51%。未带等离子体的硅酮迁移到所有表面。带等离子体的 硅酮则没有迁移到除靠近硅酮的表面之外的表面。
这为细胞培养装置的新的构造打开了一扇门。通常，可以有简单的方 法来制造细胞培养装置，包括但不限于如图17A和图17B所示的那些装置。 包括硅酮表面和经组织处理表面的培养装置可以进行伽马辐射，通过至少 对与经组织处理表面气体连通的硅酮表面充等离子体，经组织处理表面无 论与硅酮的距离是多少，在伽马辐射之后基本上没有变化。不可能迁移到 经组织处理表面的硅酮表面不需经等离子体照射，如由硅酮构成的培养室 外侧表面。需注意，只是部分由硅酮构成的表面也应该按说明充等离子体， 因为硅酮部分会在辐射期间迁移。通常，可以有简单的方法来制造细胞培 养装置。例如，可以通过成型硅酮外壳并插入供细胞驻留在上面的处理后 聚苯乙烯板，制造如基本培养瓶或OpticellTM透气培养器之类的单培养室装
置。硅酮独特的延伸能力使得开口 (培养表面穿过该开口加入)可以小于 被插入部件，并且在插入后很快恢复节端U形状。成型的硅酮中可以存在 隔膜，可以存在其它类型的通行口。对于基本培养瓶的情况，培养瓶的高 度可以大幅度减低，因为通过采用透气硅酮消除了以气-液界面的途经获取 氧的需要。参见图17A，当第-一壁110为透气硅酮，并且培养表面130为 如经组织培养处理聚苯乙烯之类的粘附表面时，可以获得附加的通用性。 这样，可以将装置定向为，第一壁110朝下以培养悬浮细胞，培养表面130 朝下以培养粘附细胞，或者如前所述培养粘附和悬浮细胞。如果期望共同 培养粘附细胞，可以将附加的培养表面，如非常薄的、透气聚苯乙烯插入 到第一壁110附近。装置的高度可以增加，以允许各种所需的培养基体积 与表面积之比率，以优化培养。制造具有褶铍侧壁的装置，使得容积可以 根据使用者的需要改变。透气多层培养瓶也可以将这些优点集成在-起。
本领域普通技术人员应理解，可以在不脱离本发明精神的前提下对其 进行各种改动。因此，本发明的范围不限于所阐述或记载的具体实施方式
。 而且，本发明的范围山所附权利要求禾l I其等价物确定。
权利要求
1.一种细胞生长装置，包括多个培养室，各培养室具有透气不透液表面以及相对表面；以及至少一个气体空间，其与至少一个培养室的至少一个透气不透液表面连通。
2. 如权利要求l所述的装置，其中所述至少一个气体空间和所述多个培养 室组合成至少一个整体单元。
3. 如权利要求2所述的装置，其中各所述培养室与所述气体空间在连续的 方向上交替设置。
4. 如权利要求3所述的装置，其中所述培养室是毗邻所述气体空间的并且 与所述气体空间连通。
5. 如权利要求2所述的装置，其中所述气体空间允许所述培养室的透气不 透液表面与外部大气之间的气体交换。
6. 如权利要求2所述的装置，所述整体单元具有至少一个通向各培养室的 通行口。
7. 如权利要求6所述的装究，其中至少一个通行口包括颈部。
8. 如权利耍求2所述的装置，还包括通向所述多个培养室的集流腔。
9. 如权利耍求2所述的细胞牛长装置，其中所述培养室可被培养基完全填 充以优化细胞-营养交换。
10. 如权利要求2所述的细胞生K装置，其中所述相对表面透气不透液。
11. 如权利要求2所述的细胞生长装置，其中细胞生长条件的均匀性包括 确定的每个单位表面积的培养基体积。
12. 如权利要求2所述的细胞生K装置，其中，至少一个培养室偏离另外 的培养室以供显微镜观察。
13. 如权利要求2所述的细胞生长装置，其中所述整体单元包括多个整体 培养室。
14. 如权利要求13所述的细胞生长装置，其中所述多个培养室以串联方式 互相连接。
15. 如权利要求2所述的细胞生长装置，其中所述整体单元包括一个或多 个培养室支架。
16. 如权利要求2所述的细胞生长装置，其中所述整体单元具有基本上呈 矩形的轮廓和基本 一 致的高度。
17. 如权利要求16所述的细胞生长装置，其中所述基本上呈矩形的轮廓内设置有颈部和/或帽部，所述颈部和/或帽部不超出所述整体单元的高度。
18. 如权利要求2所述的细胞生长装置，还包括从顶壁的外表面升起的和/ 或从底壁的外表面向下延伸的突起部。
19. 一种细胞生长装置，包括至少一个培养室，所述培养室具有透气不透液表面以及相对表面； 至少一个气体空间，其与所述至少一个培养室的至少一个透气不透 液表面连通；并且其中所述至少一个气体空间与外部环境连通并由气体空间壳体限定。
20. —种在根据权利要求1所述的装置中培养细胞的方法，所述方法包括将所述透气壁装配成期望的构造；将所述细胞和/或培养基引入所述培养瓶的所述培养室；以及 将所述培养瓶置于孵育条件中。
21. 如权利要求19所述的方法，还包括使所述装置旋转的步骤，以在所述 透气不透液表面的相对表面上培养细胞。
22. 如权利要求1所述的装置，包括至少一个培养室支架。
23. 如权利要求22所述的装置，其中所述培养室支架与所述透气不透液表 面接触，并且所述气体驻留在所述透气不透液表面的一部分与所述培 养室支架之间。
24. 如权利要求23所述的装置，其中所述培养室支架的高度不超过0.34 英寸。
25. 如权利要求23所述的装置，其中所述培养室支架与所述透气不透液表 面接触的部分被设置成敞口格网。
26. 如权利要求25所述的装置，其中所述格网至少有46%的开放度。
27. 如权利要求23所述的装置，其中所述培养室支架包括气休通行孔。
28. 如权利耍求27所述的装置，其中所述气体体积与所述透气不透液表面 的表面积之比率至少为约2%。
29. 如权利要求l所述的装置，其中所述透气不透液表面由硅酮构成。
30. 如权利要求8所述的装置，其中所述培养室平行地位于至少两个集流 腔之间。
31. 如权利要求30所述的装置，其中所述集流腔的容积不超过所述培养室 以及所述集流腔内的空间总容积的约7.0 % 。
32. 如权利要求l所述的装置，其中采用美国材料试验协会ASTM-1927方 法测量，在37'C下，所述透气不透液表面的氧传输速率至少为约 14，000ml /100平方英寸-24小时。
33. 如权利要求l所述的装置，其中所述培养室由二甲基硅酮一体成型。
34. 如权利要求33所述的装置，其中所述透气表面的厚度小于约0.008英 寸。
35. 如权利要求33所述的装置，其中所述刚性塑料材料通过包覆成型附着 于所述二甲基硅酮。
36. 如权利要求8所述的装置，其中所述集流腔包括可使其处于第一状态 和第二状态的结构，所述第一状态包括与所述第二状态不同的集流腔 容积。
全文摘要
本发明涉及提高细胞培养效率的方法和装置。它们包括使用透气培养室，以减少空间的使用，同时维持均匀的培养条件，并且更适合自动液体操作。它们包括将透气材料集成至传统的多层形式以解决培养条件不均匀的问题。它们包括培养装置，其使用由透气材料构成的表面，充有等离子体的硅酮，并且集成传统的附着表面，例如由传统的经组织培养处理的聚苯乙烯构成的那些表面。它们包括集成了透气透液膜的培养装置。这样产生多种优点，包括放大期间更优化的培养条件，以及对存量空间、培养箱空间和处理空间更有效的利用。还有，可以减少工作量和污染风险。
文档编号C12M1/12GK101611132SQ200780051036
公开日2009年12月23日 申请日期2007年12月7日 优先权日2006年12月7日
发明者约翰·R·威尔森 申请人:威尔森沃尔夫制造公司