新苏云金芽孢杆菌晶体多肽、多核苷酸及其组合物的制作方法

专利名称：新苏云金芽孢杆菌晶体多肽、多核苷酸及其组合物的制作方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及害虫控制领域，并且提供了与苏云金芽孢 杆菌(S"c/〃ws Awn'wg/e/^s7、 ) Cryl多肽相关的杀昆虫(insectiddal)多 肽和编码其的多核苷酸。本发明还涉及用于改变植物对昆虫捕食的抗
性的方法和组合物，包括但不限于转基因植物生产。
背景技术：
众多有商业价值的植物，包括常见的农业作物，易受昆虫和线虫 害虫的攻击。这些害虫可以引起农作物产量和品质中的相当大减少。 一般地，农民已在很大程度上依赖于化学杀虫剂以对抗害虫损害。然 而，化学杀虫剂的使用引起其自己的一套问题，包括应用杀虫剂的成 本和不便。此外，化学残余物引起环境和健康关注。为了这些和其他 原因，存在关于可替代的杀昆虫剂的需要。
控制害虫的环境友好的方法是使用衍生自土壤细菌苏云金芽孢杆 菌("份")的杀虫晶体蛋白质，通常称为"Cry蛋白质"。Cry蛋白质是 在苏云金芽孢杆菌的孢子形成后期过程中以结晶形式作为毒素原积聚 的球状蛋白质分子。由害虫摄入后，晶体在幼虫的碱性中肠环境中溶 解以释放毒素原。毒素原(~130 kDa)由肠蛋白酶转变为成熟的毒性 片段( 66 kDa N末端区域)。这些蛋白质中的许多对于特定靶昆虫是
7相当毒性的，但对于植物和其他非靶生物是无害的。 一些Cry蛋白质 已在农作物植物中重组表达，以提供抗虫性转基因植物。在这些中， 份-转基因棉花和玉米已进行广泛栽培。
许多Cry蛋白质已得到分离、表征且基于氨基酸序列同源性进行 分类(Crickmore等人，1998, Mc油o/.嵐肠/. Aev., 62: 807-813 )。 这个分类方案提供了用于命名且分类新近发现的Cry蛋白质的系统机 制。Cryl分类法是最为人所知的，并且包含目前总数超过130个的最 高凌史目的cry基因。
一般已发现个別Cry蛋白质具有相对窄的活性谱。例如，CrylAc 是在转基因棉花中用于控制烟芽夜蛾(//. w>Mcera)和谷实夜蛾(//. Ma)昆虫害虫中采用的第一种毒素。这种毒素因其针对烟芽夜蛾的高 水平毒性而已知。然而，它在其控制谷实夜蛾的能力方面略微不足， 并且对于灰翅夜蛾属(&oc/o^era)物种几乎没有活性。此外，CrylAb 毒素对于谷实夜蛾具有比Cryl Ac略微更少的活性，但针对甜菜夜蛾(& e;ag2^)具有优良得多的活性。
第二代转基因农作物可以对昆虫更有抗性，如果它们能够表达多 重和/或新汾基因的话。因此，具有宽活性镨的新杀昆虫蛋白质将是高 度需要的。

发明内容
本发明涉及衍生自苏云金芽孢杆菌Cryl多肽(例如CrylAa、 CrylAb、 CrylAc、 CrylAd、 CrylAe、 CrylAg和CrylCa)的Cry多肽， 包括但不限于，SEQIDNOS: 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26和28的Cryl书f生多肽。除了 Cryl书亍生多肽的多肽序列之 外，应当认识到本发明的多肽还包含其变体，包括但不限于，任何片 段包括肠激活的成熟毒素片段、类似物、同源物、天然存在的等位基 因、或其突变体。本发明的多肽还包含由本发明的任何Cryl衍生核酸 编码的那些多肽。在一个实施方案中，改组多肽具有至少一种Cryl功 能活性(例如杀昆虫活性)，并且与SEQIDNOS: 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28中任何一种或其变体的多肽序 列的成熟毒素部分至少90% 、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99 %或99.5 %等同。在另一个实施方案中，多肽具有至少一种Cryl功能活性(例如杀昆虫活性)，并且与SEQIDNOS: 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28中任何一种或其 变体的多肽序列的成熟毒素部分至少99%or 99.5%等同。还提供了例 如通过重组方法生产本发明多肽的方法。还包括了包含本发明的一种 或多种多肽的组合物。
本发明还涉及SEQ ID NOS: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25和27的Cryl衍生的核酸分子。本发明还包含了编码 多肽的片段和类似物，所述多肽是至少部分功能活性的，即，它们能 够显示与野生型Cryl多肽相关的一种或多种已知的功能活性。在一个 实施方案中，它包含与SEQIDNOS:1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27中的任何一种或其互补体(compliment)至 少至少90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或99.5%等同的分离的改组核酸分子。在另一个实施方案中，它 包含分离的核酸分子，其与SEQIDNOS:1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27中的任何一种或其互补体的多肽序列的 成熟毒素部分至少99%或99.5%等同。还包括了包含本发明的核酸的 载体。还包括了包含本发明载体的细胞或植物。
本发明还涉及表达本发明的核酸和/或多肽的转基因植物。转基因 植物可以以本领域已知的任何方式表达转基因，包括^旦不限于组成型 表达、发育调节的表达、组织特异性表达等。还包含了得自本发明的 转基因植物的种子。


图1显示了从CrylAb单基因改组分离的变体针对谷实夜蛾的杀昆 虫活性。将每种纯化的毒素原引入昆虫的饮食内，并且测定各自的 EC5o。随后将EC5o值转变成相对的倒数值。野生型CrylCa针对谷实夜 蛾的ECso给出1.0的值。剩余毒素原的EC5。指定相对值。
图2显示由改组的变体AR6编码的毒素原与野生型CrylAb、 CrylAc和CrylCa对烟芽夜蛾、谷实夜蛾和甜菜夜蛾的相对活性的比 较。将每种纯化的毒素原引入昆虫的饮食内，并且测定各自的EC, 随后将EC5Q值转变成相对的倒数值。对于每个昆虫类型显示最低EC50 (最高比活性)的毒素原给出1.0的值。剩余毒素原的EC5o指定较低的相对值。
图3显示CrylCa改组的变体针对甜菜夜蛾的相对功效。将每种纯 化的毒素原引入昆虫的饮食内，并且测定各自的EC50。随后将EC5o值 转变成相对的倒数值。野生型CrylCa针对甜菜夜蛾的EC5o给出1.0的 值。剩余毒素原的EC5。指定相对值。
图4显示合成AR6 (SEQIDNO: 5)、 MR8' ( SEQ ID NO: 11和 CR62 (SEQIDNO: 9 )基因在瞬时叶测定中的表达。合成基因使用土 壤杆菌属(爿graZ (2"enwm )叶浸润测定在本氏烟草( 6em^"薦"w")叶中进行表达。所产生的叶提取物的蛋白质印迹证实来 自AR6、 MR8'和CR62合成基因的毒素原的产生。泳道如下分子量 标记、100 ngCrylCa毒素原标准、200 ng CrylCa毒素原标准、来自表 达合成MR8'的叶的提取物、来自表达合成AR6的叶的提取物、来自表 达合成CR62的叶的提取物。针对纯化的CrylCa蛋白质产生的兔多克 隆抗血清用于探测蛋白质印迹(已预先确定CrylCa多克隆抗血清与 AR6、 CR62和MR8'蛋白质强交叉反应)。
图5A-5B显示合成AR6、 MR8'和CR62基因在植物中(z"; /朋to ) 的杀昆虫活性。每种变体使用土壤杆菌属浸润在本氏烟草中进行表达。 将每个叶盘饲喂给(A)谷实夜蛾或(B)甜菜夜蛾。24小时温育时间 段后，摄食活性通过目视观察进行测定。关于谷实夜蛾活性和甜菜夜 蛾活性的阳性对照分别是Cry2Ab样多肽(SEQ ID NO: 35 )和CrylCa 改组的基因CR62。对于每个实验对象组显示的比指包含目的基因的测 试土壤杆菌属与不包含测试基因的土壤杆菌属的相对量。这个稀释物 有效减少所产生的测试蛋白质的水平。应当注意到用不包含测试基因 的土壤杆菌属浸润的阴性对照叶在测定时间段期间由昆虫幼虫完全消 耗(未显示)。
图6显示MR8'改组的变体针对谷实夜蛾的在植物中活性。所示变 体使用土壤杆菌属浸润在本氏烟草叶中进行表达，随后为4天共培养 时间段。将每个所产生的叶盘祠喂给谷实夜蛾。24小时温育时间段后， 摄食活性通过叶盘的视频捕捉进行测定。y轴是捕捉的叶盘图像中存在 的像素数目。像素数目越大，剩余的未吃的(受保护的)叶量越大。x 轴是测试的变体。测定如所示的对于每种变体重复2-4次。
图7显示MR8'改组的变体针对甜菜夜蛾的在植物中活性。所示变体使用土壤杆菌属浸润在本氏烟草叶中进行表达，随后为4天共培养 时间段。将每个所产生的叶盘飼喂给甜菜夜蛾。24小时温育时间段后， 摄食活性通过叶盘的视频捕捉进行测定。y轴是捕捉的叶盘图像中存在 的像素数目。像素数目越大，剩余的未吃的(受保护的)叶量越大。x 轴是测试的变体。实验重复3次。
具体实施例方式
本发明提供了与芽孢杆菌属(Sac/〃us)Cryl多肽(例如，CrylAa、 CrylAb、 CrylAc、 CrylAd、 CrylAe、 CrylAg和CrylCa)相关的杀昆 虫多肽。还提供了编码本发明多肽的核酸分子。还包括了关于使用本 发明的多肽和核酸以增强植物对昆虫捕食的抗性的方法。
本发明的多肽
本发明涉及衍生自苏云金芽孢杆菌Cryl多肽(例如，CrylAa、 CrylAb、 CrylAc、 CrylAd、 CrylAe、 CrylAg和CrylCa)的Cry多肽。 在优选实施方案中，Cryl衍生多肽代表成熟的5-内毒素区域，并且选 自SEQIDNOS: 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28。本发明的多肽还包含由本发明的任何Cryl衍生核酸编码的那些多 肽。
除了 Cryl衍生多肽的多肽序列之外，应当认识到本发明的多肽还 包含其变体，包括但不限于，任何基本上相似的序列、任何片段、类 似物、同源物、天然存在的等位基因、或其突变体。由本发明包含的 变体是至少部分功能活性的多肽，即，它们能够显示与野生型Cryl多 肽相关的 一 种或多种已知的功能活性。此种功能活性包括但不限于， 生物活性，例如杀昆虫活性；抗原性，即结合或与野生型Cryl竟争结 合抗Cryl抗体的能力；免疫原性，即产生与野生型Cryl多肽结合的 抗体的能力。在一些实施方案中，变体具有与其亲本多肽基本上相似 的至少一种功能活性(例如，Cryl衍生多肽的变体将具有它与之最相 似的Cryl衍生多肽基本上相似的至少一种功能活性)。如本文所使用 的，变体的功能活性将被视为与其亲本多肽"基本上相似"，如果它在亲 本的一个标准差内的话。
在一个实施方案中，本发明包含了改组的成熟5-内毒素多肽，其具有至少一种Cryl功能活性(例如，杀昆虫活性)，并且与SEQ ID NOS: 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28中的任何一 种的多肽序列至少至少90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97°/Q、 98%、 99%或99.5%等同。
如本文所使用的，当序列定义为与参考序列"至少X。/。等同"时，例 如，"与SEQ ID NO: 2至少95 %等同的多肽"，应当理解除非另有说 明，"X。/。等同"指绝对百分比同一性。术语"绝对百分比同一性"指通过 将相同的氨基酸或核酸评分为1和任何置换评分为0而测定的序列同 一性百分比，而不考虑错配氨基酸或核酸的相似性。在一般的序列比 对中，2个序列的"绝对百分比同一性"呈现为氨基酸或核酸"同一性"的 百分比。在其中2个序列的最佳比对需要序列中的一个或两个中的缺 口的插入的情况下，为了测定百分比同一性的目的，与另一个序列中 的缺口比对的一个序列中的氨基酸残基计数为错配。缺口可以是内部 的或外部的，即，截短。绝对百分比同一性可以使用例如Clustal W程 序，版本1.8, 1999年6月，使用缺省参数容易地确定(Thompson等 人，1994, A^c/"'"c油化固rc/z 22: 4673-4680)。
在另一个实施方案中，具有至少一种Cryl功能活性(例如，杀昆 虫活性)的成熟的S-内毒素多肽与SEQ ID NOS: 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28中的任何一种的多肽序列至少99 % 或99.5%等同，并且由在严格条件下与这样的核酸杂交的多核苷酸编 码，所述核酸编码SEQIDNOS: 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28中的任何一种。
在具体实施方案中，本发明的片段对应于所加工的毒素原的长度。 毒素对应于全长Cryl多肽的N末端部分。在优选实施方案中，N末端 50kDa-75kDa片段对应于毒素。在更优选的实施方案中，N末端 66kDa 片段对应于毒素。对应于这种加工的Cryl片段的多肽可以在本发明直 接避免毒素原加工需要的方法中提供。
完全毒素原核苷酸或多肽序列由在毒素原5'或N末端和3'或C末 端毒素原区域的背景中的结构域I、 II和III毒素区域组成。在一些情 况下，毒素原和毒素区域衍生自相同Cryl型分子，例如CR62完全衍 生自CrylCa。在其他情况下，5'或N末端区域主要衍生自 一种分子， 而C末端毒素原区域衍生自另一种，例如关于AR6、 MR8'和衍生物，
12其中5'或N末端区域主要衍生自CrylAb,而对应于毒素原区域的3' 或C末端区域来自CrylCa。公认在衍生自其他Cryl分子的毒素原序 列的不同组的背景中，分子的活性S -内毒素区域可以保留确切活性。
在另一个具体实施方案中，本发明的片段对应于Cryl结构域。成 熟的Cryl毒素多肽具有3个结构域，包括i)涉及插入昆虫顶端中肠 膜内且影响离子通道功能的结构域I， ii)涉及在昆虫中肠上皮细胞膜 上的受体结合的结构域II,和iii)涉及离子通道功能、受体结合和插 入膜内的结构域III( Schnepf等人，1998，A^'craZno/. Mo/ec. Ao/. Aev. 62: 775-806 )。
在另一个实施方案中，本发明包含了类似物多肽。类似物多肽可 以具有已进行修饰的残基，即通过任何类型的分子与Cryl衍生多肽的 共价附着。例如，但非限制性地，本发明的类似物多肽可以通过下述 进行修饰例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化(pegylation)、磷酸化、 酰胺化、经由已知保护/封闭基衍生化、蛋白酶剪切、与细胞配体或其 他蛋白质连接等。本发明的类似物多肽可以通过化学修饰进行修饰， 其中使用本领域技术人员已知的技术，包括但不限于特定化学切割、 乙酰化、曱酰化、在衣霉素(N联糖基化和N-糖苷蛋白质-碳水化合物 键形成的抑制剂)的存在下的合成等。此外，本发明多肽的类似物可 以包含一个或多个非经典氨基酸。
还提供了例如通过重组方法生产本发明多肽的方法。 还包括了包含本发明的一种或多种多肽的组合物。本发明的组合 物可以进一步包含另外的试剂，包括但不限于，展布剂-粘着剂佐剂、 稳定剂、其他杀昆虫添加剂、稀释剂、最优化组合物的流变学性质或 稳定性的试剂，例如表面活性剂、乳化剂、分散剂和/或聚合物。
本发明的核酸
本发明还涉及Cryl衍生的核酸分子。在优选实施方案中，Cryl衍 生的核酸分子选自SEQ ID NOS: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25和27。本发明的核酸分子还包含编码本发明的任何Cryl 衍生多肽的核酸分子。
除了 Cryl衍生的核酸分子的核酸分子外，应当认识到本发明的核 酸也包含其变体，包括但不限于任何基本上相似的序列、任何片段包括毒素片段、同源物、天然存在的等位基因、或其突变体。由本发明 包含的变体核酸分子编码至少部分功能上活性的多肽，即，它们能够
显示与野生型Cryl多肽相关的一种或多种已知功能活性。此种功能活 性包括但不限于，生物活性，例如杀昆虫活性；抗原性，即结合或与 野生型Cryl竟争结合抗Cryl抗体的能力；免疫原性，即产生与野生 型Cryl多肽结合的抗体的能力。在一些实施方案中，变体具有与其亲 本核酸分子基本上相似的至少一种功能活性(例如，Cryl衍生的核酸 分子的变体将编码这样的多肽，所述多肽将具有所述变体与之最相似 的Cry 1衍生的核酸分子编码的多肽基本上相似的至少 一种功能活性)。 如本文所使用的，变体的功能活性将被视为与其亲本多肽"基本上相 似"，如果它在亲本的一个标准差内的话。
在一个实施方案中，本发明包含了改组的核酸分子，其与SEQID NOS: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27中的任 何一种核酸分子至少90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99 %或99.5 %等同。在另一个实施方案中，本发明包含 了这样的核酸分子，其与SEQIDNOS: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27中的任何一种核酸分子至少99 %或99.5 %等 同。
为了测定2种核酸分子的百分比同一性，序列就最佳比较目的进 行比对(例如，缺口可以在第一种核酸分子的序列中引入以用于与第 二种或核酸分子的最佳比对)。随后比较在相应核普酸位置处的核苷 酸。当第一种序列中的位置由与第二种序列中的相应位置相同的核普 酸占据时，那么分子在那个位置处是等同的。2个序列之间的百分比同 一性是由序列共享的相同位置数目的函数(即，％同一性=相同重叠位 置数目/位置总数目x 100%)。在一个实施方案中，2个序列是相同长 度的。
2个序列之间的百分比同一性的测定也可以使用数学算法来完成。 用于比较2个序列的数学算法的非限制性例子是Karlin和Altschul的 算法(Karlin和Altschul, 1990，尸roc.淑/. ytot/. 87: 2264-2268, 如在Karlin和Altschul， 1993,淑/. JcW. 90: 5873-5877中 修改的)。此种算法并入NBLAST和XBLAST程序内(Altschul等人， 1990,丄Mo/.215: 403和Altschul等人，1997, A^c/e/c^cW25: 3389-3402 )。用于扭J亍BLAST分析的软件是例如可通过国立生物 技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) 乂>开获 得的。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高 评分序列对(HSPs),当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，其 匹配或满足一些正值阈值评分T。 T指的是邻近字得分阈值(Altschul 等人，同上)。这些起始邻近字命中充当种子用于起始搜索以发现包含 其的更长HSPs。字命中随后沿着每个序列在2个方向上延伸，至累积 比对得分可以增加的程度。对于核苷酸序列，使用参数M(关于匹配 残基对的奖励得分；总是>0)和N (关于错配残基的罚分；总是<0) 计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵以计算累积得分。每 个方向中的字命中的延伸在下述情况时停止累积比对得分与其最大 达到的值下降量X;由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积得 分变为零或零以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、 T 和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使 用字长(W) 11、期望值(E) 10、截止值100、 M = 5、 N:-4和2条 链的比对作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W) 3、期望值(E) 10和BLOSUM62评分矩阵作为缺省值(参见Henikoff & Henikoff, 1989, PNAS, 89: 10915 )。
比对的Clustal V方法也可以用于测定百分比同一性(Higgins和 Sharp, 1989, CABIOS. 5: 151-153),并且在LASERGENE生物信息 学计算套件(DNASTARInc.， Madison， WI)的Megalign程序中发现。 "缺省参数"是由程序的制造商预先设定的参数，并且对于多重比对，它 们对应于GAP PENALTY-10和GAP LENGTH PENALTY=10，而对于 逐对比对，它们是KTUPLE 1、 GAP PENALTY=3、 WINDOW=5和 DIAGONALS SAVED=5。序列比对后，使用Clustal V程序，通过察看 相同程序上的"序列距离，，表可能获得"百分比同 一性"。
2个序列之间的百分比同一性可以使用类似于上文描述的那些的 技术进行测定，其中允许或不允许缺口。在计算百分比同一性中，一 般仅计算确切匹配。
在另一个实施方案中，本发明包含整合了任何本文描述的Cryl衍 生的核酸分子的核酸分子的核酸分子。包含具有至少一种Cryl功能活 性(例如杀昆虫活性)的核酸分子。在这点上，所描述的编码毒素的序列将与来自其他Cry蛋白质的结构域组合，以形成完整Cry蛋白质。 在具体实施方案中，组合对应于编码完整Cry蛋白质的核酸分子。 毒素对应于全长Cryl多肽的N末端部分。编码结构域I的核酸分子和 编码结构域II的核酸分子随后可以与所述核酸分子组合，以形成编码 成熟Cry蛋白质的核酸分子。
在另一个具体实施方案中，本发明的片段编码对应于成熟Cryl毒 素的结构域I、 II或III中的任何一个的多肽。
在另一个实施方案中，本发明包含了在严格条件下与SEQ ID NOS: 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21、 23、 25、 27中的任 何一种杂交的核酸分子。短语"严格条件"指这样的杂交条件，在该条件 下核酸将与其靶核酸杂交， 一般在核酸的复杂混合物中，但基本上不 与其他核酸杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同环境下将是 不同的。更长的核酸在更高的温度下特异性杂交。关于核酸杂交的广 泛指导可以在本领域中发现(例如，Tij ssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993 ))。 一般地，高严格条件选择为在限定离子强度和pH下比特定 核酸的热解链温度(Tm)低约5-l(TC。低严格条件一般选择为低于Tm 约15-30°C。 Tm是在其下与靶互补的50%探针在平衡状态中(因为靶 核酸过量存在，所以在Tm下，50%的探针在平衡状态中被占据)与靶 核酸杂交的温度(在限定离子强度、pH和核酸浓度下)。杂交条件一 般是其中在pH 7.0-8.3下盐浓度低于约1.0 M钠离子、一般约0.01-1.0 M 钠离子浓度(或其他盐)的那些，并且温度对于短探针(例如，10-50 个核普酸)是至少约30。C和对于长探针(例如，超过50个核苷酸)是 至少约60°C。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如曱酰胺来达到。 对于选择性或特定杂交，阳性信号是至少2倍背景，且优选10倍背景 杂交。在一个实施方案中，严格条件包括在0.2XSSC中于至少约50°C、 通常约55°C、或有时60。C或65。C的温度至少1次洗涤(通常2次)， 进行20分钟，或基本上等价的条件。在具体实施方案中，本发明的核 酸分子与编码SEQIDNOS: 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28中的任何一种的多肽的多核苷酸特异性杂交，遵循在 0.2X SSC中于55。C至少洗涤1次，进行20分钟。在另一个实施方案
16中，严格条件包括在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45'C杂交， 随后在0.2X SSC, 0.1 %SDS中于50-65。C洗涤1次或多次。
短语"特异性杂交"指当序列存在于复杂混合物(例如总细胞或文库 DNA或RNA )中时，在严格杂交条件下分子仅与特定核苷酸序列结合、 形成双链体或杂交。
还包括了包含本发明核酸的载体。还包括了包含本发明载体的细 胞或植物。
术语"核酸，，或"核酸分子"在本文中指从5'向3'末端阅读的脱氧核糖 核苷酸或核糖核苷酸碱基的单或双链聚合物。它包括发挥主要结构作 用的染色体DNA、自我复制的质粒和DNA或RNA。术语"编码"指编 码一种或多种氨基酸的多核苦酸序列。该术语不需要起始或终止密码 子。氨基酸序列可以在由多核苷酸序列及其互补体提供的6个不同读 框中的任何一个中编码。
表1公开了 Cryl衍生序列和相应的序列标识号。
Cryl-书f生序列
本发明的Cryl衍生多肽和核酸分子可以通过下述来产生将一种 或多种核普酸置换、添加和/或缺失引入野生型Cryl (例如，CrylAa、 CrylAb、 CrylAc、 CrylAd、 CrylAe、 CrylAg和CrylCa )或相关核酸 的核苷酸序列内，从而使得将一种或多种氨基酸置换、添加和/或缺失 引入所编码的蛋白质内。 一般地，产生Cryl衍生序列，以强调野生型 Cryl多肽的所需特征或减少其不希望有的特征。在一个实施方案中， Cryl衍生多肽具有超过相应野生型Cryl的改善的杀昆虫活性，包括但 不限于，更大的效力和/或增加的昆虫害虫范围。在另一个实施方案中， Cryl衍生的多肽在微生物宿主或植物宿主中比相应的野生型Cryl更好 地表达，包括但不限于，增加的半衰期、对降解更不易感、和/或更有 效的转录或翻译。
在一个实施方案中，苏云金芽孢杆菌衍生的CrylAb( SEQ IDNO: 33)或CrylCa (SEQIDNO: 29,编码区47-3616)核酸分子用作模 板以产生改组的co4核苷酸片段。在另一个实施方案中，从一轮改变 中分离的变体可以用作才莫板用于进一步的改变轮次(例如，AR6、 CR62 或MR8')。在另一个实施方案中，待改变或改组的编码Cryl蛋白质的 模板可以重新合成，以具有不同的核酸序列，以提供在宿主细胞中改善的表达用于筛选和/或商业化目的。本文描述的每种Cryl型分子无论 衍生自CrylAb还是CrylCa的5'或N末端区域都包含CrylCa的毒素 原3'或C末端区域。
序列改变可以通过标准4支术引入，例如定向分子进化4支术，例如 DNA改纟且方法(参见例》口， Christians等人，1999， M^wre A'o&c/mo/ogy 17: 259-264; Crameri等人，1998，淑跳391: 288-291; Crameri, 等人，1997, A^we5/o&c/mo/ogy 15: 436-438; Crameri等人，1996, 淑,S她c/mo/ogy 14: 315-319; Stemmer, 1994,淑騰370: 389-391; Stemmer等人，1994,尸亂淑/.,91: 10747-10751;美国专 利号5，605,793; 6,117,679; 6,132,970; 5,939,250; 5,965,408; 6，171,820; 国际
发明者D·切尔夫, K·麦布赖德, M·弗里曼, R·聪, 山本敬司 申请人:先锋高级育种国际公司