苏云金芽胞杆菌3-1-a、杀虫基因cry8Ax表达蛋白及其应用

文档序号:10637626阅读:878来源:国知局
苏云金芽胞杆菌3-1-a、杀虫基因cry8Ax表达蛋白及其应用
【专利摘要】本发明涉及“苏云金芽胞杆菌3?1?a、杀虫基因cry8Ax、表达蛋白及其应用”,属于生物防治技术领域。苏云金芽胞杆菌3?1?a,其保藏编号为:CGMCC No.12440。从菌株3?1?a中分离得到的杀虫蛋白,具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,及编码该杀虫蛋白的基因,优选所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。上述基因对农业害虫具有一定的毒杀力,以应用于转化微生物和植物,使之表现出对相关害虫的毒性,并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。CGMCC No. 1244020160513
【专利说明】
苏云金芽胞杆菌3-1 -a、杀虫基因 crySAx表达蛋白及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物防治技术领域,特别是本发明设及对銷翅目农业害虫具有高毒力 的化杀虫基因及由该基因所编码的蛋白质。
【背景技术】
[0002] 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称化)是一种分布广泛的革兰氏阳 性细菌,是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物,对高等动物和人无毒性。 它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂,对16个目3000多种害虫有活性。Bt 在芽胞形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteinsJCPs),也称δ-内毒 素(delta-endotoxin),它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf .Ε, Cri ckmore.N, Van Rie.J.,Lereclus.D,Baum.J,Feitelson.J,Zeigler.D.R., Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins .Microbiol .Mol. Biol .Rev,1998,62(3): 775-806.]。自 1981 年Schnepf等克隆了 化的第一个ICPs基因,并于1985年发表了它的DM碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起, 目前(2014年4月)共776个,其中C巧基因738个,C巧模式基因289个;巧t基因38个,巧t模式 基因11个。当今,采用喷施化学农药防治手段固然可W减轻害虫对农作物的为害,但化学农 药造成环境污染,长期W来,大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性,使益虫及其 它生态区系遭受破坏,而且严重污染环境,提高生产成本,破坏生态平衡。苏云金芽胞杆菌 杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。苏云金芽胞 杆菌除了直接作为生物农药W外,1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用, 它使用的基因来自化C巧lAc。在接下来的几年里,转crylAb基因的抗虫玉米,转cry3Aa基 因的抗虫±豆等相距问世。在中国,自1998年开始正式推广含有crylAc/c巧lAb基因的抗虫 棉W来,已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中,由于能得到 持续稳定的收益,农民种植转基因作物量逐年增加。自1996年W来,2015年已是转基因作物 成功商业化种植的第20年。据统计,2015年全球转基因作物的种植面积约1.797亿公顷,与 2014年1.815亿公顷相比减少1%。在运20年里,全球已累积种植转基因作物面积约20亿公 顷,相当于美国总陆地面积的两倍,保守估计农民获益超过约1500亿美元。截止到2015年12 月,已有28个国家成功种植转基因作物,其中20个为发展中国家,且转基因作物的种类、范 围W及种植面积也在随着转基因技术的不断发展而增长并将继续保持增长趋势。中国750 万资源匿乏的小农户种植了420万公顷的化棉花,采用率为90%,平均每户农民种植0.5公 顷的化棉花。转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效 益。苏云金芽胞杆菌及其基因发掘已成为可持续发展农业中重要课题。
[0003] 由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一,如此大面积推广种 植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基 因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此,筛选分离克隆新的、高毒力的化杀虫基因,可 W丰富杀虫基因资源,为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源,提高化转基因产品的 抗虫效果,并且可w降低害虫对化毒蛋白的抗性风险,避免新的生态灾难降临,具有重要的 经济、社会和生态效益。

【发明内容】

[0004] 本发明提供一种对銷翅目害虫大猿叶甲,马铃馨甲虫等活性的苏云金芽胞杆菌3- 1-曰,及其杀虫新基因基因 crySAx和其晶体杀虫蛋白,W应用于转化微生物和植物,使之表 现出对相关害虫的毒性,并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。
[0005] 苏云金芽胞杆菌菌株3-1-a,其保藏编号为:CGMCC No. 12440。
[0006] 苏云金芽胞杆菌菌株3-1-a在杀灭銷翅目大猿叶甲,马铃馨甲虫农业害虫中的应 用。
[0007] 杀虫蛋白化784^,其氨基酸序列如569 10^:2所示。
[000引杀虫基因 crySAx,编码杀虫蛋白CrySAx。
[0009] 杀虫基因 crySAx,其核巧酸序列如沈Q ID N0:1所示。
[0010] -种表达载体,其特征是含有crySAx基因。
[0011] 所述表达载体为祀B-cry8Ax,其骨架载体为祀B,其结构如图4所示。
[0012] 一种微生物转化体,其特征是含有crySAx基因。
[0013] 杀虫基因 crySAx在杀灭銷翅目农业害虫大猿叶甲,马铃馨甲虫中的应用。
[0014] 所述应用是将杀虫基因 crySAx转化到植物中,使植物表达对农业害虫的抗性,或 者是将杀虫基因 crySAx表达的蛋白作为生物杀虫剂的有效成分杀灭农业害虫。
[0015] 本发明人从黑龙江省安达市附近±壤中分离得到一株苏云金芽胞杆菌菌株3-1- 曰,其保藏编号为CGMCC No. 12440,该菌株生物学特性为在生长周期中可W产生芽胞,并且 同时产生有毒杀銷翅目农业害虫大猿叶甲杀虫活性作用的伴胞晶体;从该菌株中得到一个 新基因的阳性克隆,即祀B-C巧8Ax(见图4),对其进行测序分析,在NCBI网站上应用BLAST并 应用DNAMAN等生物软件进行分析,分析结果证明所克隆的基因是crySAx基因,该基因编码 框是由大小为2217bp,编码738个氨基酸残基,与CrySAb的氨基酸相似度为80.2 %,所W该 基因应属于第二等级的新基因。
[0016] crySAx基因可按生物技术的常规方法转化微生物、植物,表现出对相关銷翅目害 虫毒性。
[0017] 将上述基因转化菌株,表达得到的蛋白可W制成生物农药用于杀死銷翅目害虫。 同时,可W转入植物构建抗虫转基因植物,用于害虫的防治。
[0018] 本发明分离克隆的化crySAx基因序列及其基因表达产物能够对农业害虫大猿叶 甲有一定的毒杀力,crySAx可扩大对銷翅目害虫大猿叶甲,马铃馨甲虫的杀虫谱。通过应用 于转化微生物和植物,使它们表现出对相关害虫的毒性,可克服或延缓昆虫对工程菌和转 基因植物抗药性的产生。
[0019] 苏云金芽胞杆菌菌株3-1-a,保藏信息:
[0020] 菌种分类命名:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)
[0021] 保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0022] 保藏日期:2016年5月13日
[0023] 保藏编号:CGMCC No.12440
【附图说明】
[0024] 图1光学显微镜下观察菌株3-1-a菌体的形态,
[0025] 图2 crySAx基因全长PCR结果,
[0026] 图3 crySAx基因在大肠杆菌中表达蛋白的SDS-PAGE,
[0027] 其中:1 .Bt 3-1-a蛋白质组分M:高分子量蛋白Marker; 2 :C;ry8Ax蛋白组分,3 : 化y8化蛋白组分4:祀B空载体组分
[002引图4重组载体祀B-cry8Ax的结构图,
[0029] 图5序列同源性分析。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明
[0031] 实施例1、分离得到苏云金芽胞杆菌菌株3-1-a
[0032] 本
【申请人】的实验室工作人员从黑龙江省安达市±壤中分离的得到一株苏云金芽 胞杆菌,苏云金芽胞杆菌的芽胞由外向内依次为芽胞外壁、芽胞衣、皮层、芽胞内壁,原生质 膜和原生质体。其中皮层的主要成分是肤聚糖,不含营养细胞的多聚糖憐壁酸,它保持着芽 胞的脱水状态和耐热性,另一方面,芽胞形成过程中,会产生大量DPA-Ca藝合物,使得芽胞 中的生物大分子形成耐热凝胶,在80°C下热处理20min,苏云金芽胞杆菌芽胞也不会死亡并 且休眠的芽胞在75°C的亚致死溫度下处理15min,活化效果最好,不但促其快速萌发,还可 提高芽胞的成活率(喻子牛1990)。依据运一特性,可实施溫度筛选化nowles B H,Ellar D J.Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis d-endotoxins with different specificity[J].Biochimica et bio地ysica acta,1987,924:509-518.;戴莲韵,王学聘等.中国八个自然保护区森林± 壤中苏云金芽胞杆的分布[J].微生物学报,1994,30(2)117-121)。
[0033] 1、1菌株的分离
[0034] 1)取分装的±样加入到50ml大离屯、管中,至锥形管锥形处。
[00巧]2)加灭菌水至15ml处,放入玻璃珠5~10颗。
[0036] 3)用振荡器将±样打碎。
[0037] 4)放入水浴锅中80°C,20分钟。
[003引 5)取1.5ml的EP管,每个管中加1ml灭菌水,再从50ml管中取10微升菌液加入到EP 管中混匀。
[0039] 6)从EP管中取100微升喷至ljl/2LB培养基中,涂匀。
[0040] 7)放入到30°C溫箱中培养2~3天。
[0041] 8)镜检观察。
[0042] 晶体观察
[0043] 光学显微镜:
[0044] 将胞晶混合液滴于载玻片上,涂抹均匀,烘干固定,石炭酸复红染液染色3min,清 水冲洗,lOOx油镜进行镜检,石炭酸复红染液配制方法参见文献(Baroy F,Lecadet Μ M, Deleluse A.Cloning and sequencing of three new putative toxin genes from Clostridium bifermentansU] .Gene, 1998,211: 293-295)。见图 1所示。在1/化B培养基上 培养4她后形成单菌落,光学显微镜下观察到菌株3-1-a菌体为长杆状,芽胞为长圆棒状,晶 体为双锥形。
[0045] 电镜显微观察:
[0046] 扫描电镜制样:抱晶混合液滴于玻璃片上,干燥,经饿酸固定,而后经酒精梯度脱 水,临界点干燥,离子瓣射喷金(2nm厚),化W Bio-TEM H-7500扫描电镜观察拍照。如图1B所 /J、- 〇
[0047] 生物学测定表明,对大猿叶甲的初筛生测结果为校正死亡率为80%。
[004引将该菌株保藏,其保藏编号CGMCC No. 12440。
[0049] 化菌株3-1-a产生的晶体形态,如图1中光学显微镜下箭头所示,从左到右依次为 球形晶体和芽胞;
[0050] 实施例2.获得新基因
[0051] 通过全基因组测序,发现菌株化3-1-a基因组上含有一个与crySAbl相似度极高的 〇巧基因,设计全长引物84尸(5'4了644了46了6了417644了43')和
[0052] 8AR(5'ATAAAGTGGTGAAAGATTAGTTGGS'),
[0053] 采用快速克隆方法对该菌株中的新cry 8Ax基因进行分离克隆。
[0054] 用时uDNA聚合酶,用如下体系进行PCR扩增。 KiyPCR buffer 5,uL ciNTP( lOmVi) 1 uL
[0055] 引物对(lOmM) 1μΙ7 个 模板 luL kodDNA 聚合酶口 υ/μ〇 0.5μΙ^
[0化6] 超纯水补至50yL,混匀离屯、。
[0057]扩增循环:94°C变性1分钟,54°C退火1分钟,72°C延伸1分钟,25个循环,最后72°C 延伸10分钟。如图2所示。
[0化引2.2连接方案 载体 0.1-0,2 μ g 目的片段DNA 0.5-1.0 μ g
[0化9] 5 X Ligation BulTor 2 \xL· T4 DNA Ligasc 1 μL^
[0060] 用超纯水补足体积到lOyL,充分混匀,16°C连接4h或4°C连接过夜。
[0061] 设计crySAx类基因的全长引物,扩增得到全长基因,将其与载体祀B(公开载体,本 所实验室有保存,可W对外公开发放)载体进行连接,转化入感受态JM109中,经抗性筛选、 PCR鉴定分析,筛选出含有crySAx基因的阳性重组质粒见图4。图3 PCR鉴定结果。将纯化片 段与载体祀B连接转化大肠杆菌JM109,得到阳性转化子。对插入片断进行测序分析,得到序 列SEQ ID NO 1,其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。由PCR扩增得到了大小正确的目的条 带,将目的条带进行纯化并测序。测序结果显示,3-1-a菌株中的crySAx基因大小为2217bp, 编码738个氨基酸残基,与crySAbl的氨基酸相似度为80.2%。见图5
[0062] 2.3转化方案
[0063] 2.3.1大肠杆菌转化
[0064] 1.挑取单菌落于5ml LB震荡培养过夜;
[0065] 2.按1 %接种量接种于LB液体培养基中,37°C,230巧m培养2-2.化r,(0化日日=0.5- 0.6);
[0066] 3.4°C,4,000rpm离屯、lOmin;
[0067] 4.弃上清,加入预冷的O.IM化Cl2 50ml悬浮细胞,置于冰上30minW上;
[006引 5.4°C,4,000巧m离屯、lOmin,回收细胞;
[0069] 6.用2-4ml冰预冷的0.1M CaCb重悬细胞,分装成200μ1/0.5血离屯、管中,于4°C保 存(可保存一周)。
[0070] 7.取20化1感受态细胞与化L连接产物充分混匀,冰浴30min。
[0071] 8.42°C 热激 1.5min,冰浴 3min。
[0072] 9.加入800μ1 LB 培养基 37°C 培养 45min。
[0073] 10.取200μ 1涂板,加入相应的抗生素,及IPTG,X-ga 1,37 °C培养。
[0074] 实施例3、基因表达与活性测定
[00巧]3.1.1在上述克隆提取质粒DNA,转入受体菌Rosetta(DE3)中,获得表达菌株。
[0076] IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。
[0077] 诱导表达过程如下:
[007引 1)活化菌种(371:、1化');
[00巧]2) 10 %接种于LB培养基中(37 °C、2虹);
[0080] 3)加入诱导物 IPTG,150 巧m,18-22°c 低溫诱导 4-20h;
[0081] 4)离屯、收集菌体,加入lOmM Tris · Cl(pH 8.0)悬浮;
[0082] 5)破碎菌体(超声波破碎完全);
[0083] 离屯、12,000rpm lOmin 4°C ;
[0084] 收集上清及沉淀各10-1化L,分别电泳检测。
[0085] 聚丙締酷胺凝胶配置如下。 分离胶8% (ml) 堆积胶5% (ml) Distilled waver 4.6 2.7 30% [)巧化sed Acrylamide 2.7 0.67 1.5M Tris(pH8.8) 2.5 LOOooJ l.OM Tris(pH6.8) 0.5 !0%SDS 0.1 0.04 !0%APS 0.1 0.04 TEMED 0.006 0.004
[0087] 上样:上样10-1化1,电泳:130-150V恒压。
[0088] 染色与脱色:电泳后取出凝胶,用蒸馈水冲洗后,放入染色液中,6化pm振荡染色 化r左右,脱色液中脱色化r左右,脱色至凝胶背景透明,清水中漂洗至蛋白带清晰。
[0089] 将重组质粒祀B-cry8Ax,(见图4)转化到E.coli Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达, SDS-PAGE(12 % )凝胶电泳。结果表明,crySAx基因都能通过表达载体祀B在大肠杆菌中高效 表达大约为80kDa蛋白,而经IPTG诱导的转入Rosetta(DE3)的祀B空载体没有特异的目的条 带产生(图3)。
[0090] 3.2化菌株3-1-A及crySAx基因编码蛋白的杀虫活性测定
[0091] 将化菌株3-1-A及crySAx基因表达蛋白,用水稀释到不同浓度,对大猿叶甲的杀虫 活性,具体方法如下,量取10-20mL的待测样品加入到灭菌培养皿中,然后选取新鲜的青菜 叶片,放入到培养皿中并均匀地浸入待测样品溶液,10s。在试验台上事先铺上一层保鲜膜, 将浸泡过样品的叶片置于保鲜膜上室溫惊干,保证叶片两面均惊干,分别置于培养皿中。用 毛笔轻轻地接入二龄幼虫,每个培养皿中接30头虫,每处理重复Ξ次,接完虫子后盖好盖 子,并用橡皮筋固定,防止幼虫逃逸。将培养皿置于光照培养箱中,光照周期为14h,10h,培 养箱中放置水盆来调节湿度,并且需要每天来检查叶片是否有干枯或腐烂的现象,是否有 水蒸气凝结的现象。对供试昆虫的培养条件为27°C,相对湿度在80% W上,9化后对大猿叶 甲进行调查死、活虫数,并计算死亡率和LCso。、大黑觸金龟、暗黑觸金龟的杀虫活性,具体方 法如下采用饲料混合法进行杀虫生物活性测定。将制备好不同浓度梯度的表达蛋白样品并 分装于经过消毒的培养皿中,分别与饲料揽拌混匀,挑选活跃的初解幼虫接于饲料上,每个 处理重复3次,每个重复为30头试虫。阴性对照为lOmmol/L Tris-Cl溶液作。试虫的饲养条 件为相对湿度为70%-80%、溫度为27°C的光照培养箱中培养,饲育4她后调查死、活虫数 量,计算死亡率。
[0092] W銷翅目昆虫大猿叶甲(Colaphellus bowringi)初解幼虫为测试昆虫,利用诱导 表达的化y 8 Αχ蛋白对大猿叶甲进行生物活性测定初筛。生物活性测定结果显示:当化y 8 Αχ 蛋白的浓度为l(K)yg/mL时,死亡率为62.5%,与对照组相比,校正死亡率为56.89%。对大猿 叶甲的LC50为83.329yg/mL(54.418-124.408)yg/血。对大黑觸金龟、暗黑觸金龟的杀虫活 性比较低2(K)yg/mL时,分别为死亡率为24,36 %。
[0093] 本发明的有益效果:本发明分离克隆的化crySAx基因序列及其基因表达产物能 够对鱗翅目产生毒力,特别对于大猿叶甲有一定的毒杀作用,可扩大对銷翅目害虫昆虫大 猿叶甲大黑觸金龟、暗黑觸金龟的杀虫谱,通过应用于转化微生物和植物,使它们表现出对 相关害虫的毒性,可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。
【主权项】
1. 苏云金芽胞杆菌菌株3-1-a,其保藏编号为:CGMCC No. 12440。2. 权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌菌株3-1-a在杀灭农业害虫中的应用。3. 杀虫蛋白Cry8Ax,其氣基酸序列如SEQ ID N0:2所不。4. 杀虫基因 cry8Ax,编码权利要求3所述的杀虫蛋白Cry8Ax。5. 权利要求4所述的杀虫基因 cry8Ax,其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。6. -种表达载体,其特征是含有权利要求4或5所述的Cry8Ax基因。7. 根据权利要求6所述表达载体,为pEB-cry8AX,其骨架载体为pEB,其结构如图4所示。8. -种微生物转化体,其特征是含有权利要求4或5所述的cry8Ax基因。9. 权利要求4或5所述的杀虫基因 crySAx在杀灭鞘翅目农业害虫中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用,是将权利要求4或5所述的杀虫基因 crySAx转化到植物 中,使植物表达对农业害虫的抗性,或者是将权利要求4或5所述的杀虫基因 cry8Ax表达的 蛋白作为生物杀虫剂的有效成分杀灭农业害虫。
【文档编号】A01N63/00GK106011013SQ201610472022
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】李海涛, 高继国, 刘荣梅, 张 杰
【申请人】东北农业大学
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