全局转录机器的改造的制作方法

专利名称：全局转录机器的改造的制作方法
技术领域：
本发明涉及改造全局转录机器以产生具有改进表型的改造细胞，以及这些细胞在 生产方法中的用途。
背景技术：
现在公认，许多重要细胞表型(从疾病状态到代谢物过量产生)受到许多基因的 影响。然而，由于载体构建和转化效率的实验限制，多数细胞及代谢改造方法几乎完全依赖 单基因的缺失或过表达。这些限制排除了同时研究多基因修饰，并将基因修饰研究局限在 一次修饰一个基因的限制性顺次方法中。 美国专利5， 686， 283描述了由rpoS编码的o因子用于激活在细菌细胞中休眠或 低水平表达的其他细菌基因表达的用途。然而，该专利未描述诱变o因子以全局式地改变 基因转录。 美国专利5， 200， 341提供了鉴定为温度敏感型rpoD基因抑制子的突变rpoH基 因，所述鉴定通过选择包含温度敏感性rpoD基因的温度抗性突变体菌株来实现。未进行细 菌诱变，也未针对除温度抗性以外的表型对抑制子菌株进行选择。当在经修饰而表达异源 蛋白质的其他细菌中加入突变rpoH基因时，该异源蛋白质以更高的水平在该细菌中积累。
美国专利6， 156， 532描述了通过引入编码热休克蛋白的基因和编码o因子的基 因(rpoH)来进行修饰的微生物，所述o因子特异性作用于热休克蛋白基因，从而增强细胞 中热休克蛋白的表达量。该经修饰的微生物可用于生产发酵产品，如氨基酸。该微生物中 使用的o因子未突变。 已通过改组(shuffling)细菌基因组而对微生物应用定向进化，用于链霉菌的 抗生素(泰乐菌素)产生(Zhang等，Nature, 415， 644-646 (2002))以及乳杆菌的耐酸性 (Patnaik等，Nature Biotech. 20， 707-712 (2002))。这些方法不耙向任何特定基因的突变， 而是使用原生质体融合来非重组地改组具有期望表型的菌株的基因组，然后选择改进了期 望表型的菌株。
发明概沭 本发明应用全局转录机器(global transcription machinery)改造来产生具有 改进表型的改造细胞。特别地，本发明涉及产生在整个基因组水平上具有不同启动子偏好 的突变酵母RNA聚合酶II因子例如TATA结合蛋白(SPT15)。通过引入突变的RNA聚合酶
5II因子得到的细胞具有快速且显著的表型改进，如对有害培养条件的耐受或者提高的代谢 物产生。 结合定向进化的方法和概念，将突变体转录机器引入细胞允许人们以高通量方式 研究大大扩展的研究领域，这通过评估同时发生的多基因改变从而改进复杂的细胞表型来 实现。 通过反复多轮诱变和选择进行的定向进化已成功地扩展了抗体和酶的特性 (W. P. Stemmer， Nature 370,389-91(1994))。最近，这些概念已在对启动子活性文库的检 索中延伸和应用到DNA的非编码功能区，所述文库跨越以不同方式衡量的宽强度动态范 围(H. Alper， C. Fischer, E. Nevoigt， G. St印hanopoulos， Proc Natl Acad Sci USA 102， 12678-12683(2005))。然而，还没有基于进化的方法涉及将系统性修饰全局转录机器作为 改进细胞表型的手段。然而，详尽的生物化学研究提示，给定启动子序列的转录速率和体外 偏好均可通过修饰细菌o因子上的关键残基来改变(D.A. Siegele， J. C. Hu， W.A.Walter, C. A. Gross, J Mol Biol 206,591-603(1989) ;T. Gardella， H. Moyle， M. M. Susskind， J Mol Biol 206,579-590(1989))。这些修饰的转录机器单元提供引入同时发生的全局转录水平 变化的独特机会，所述全局转录水平变化可能以非常复杂的方式影响细胞特性。
在本文中就酵母和SPT15描述本发明，但是本发明可广泛适用于其他真核细胞， 尤其是真菌，因为其涉及乙醇生产以及这些真核细胞中相关的RNA聚合酶II因子。本文所 述的特定突变可在其他细胞中SPT15直系同源物的相应氨基酸位置复制，得到基本相似的 结果。同样，可使用其他氨基酸(优选作为突变氨基酸的保守性替换的氨基酸)来代替本 文的突变体SPT15基因中所用的特定氨基酸替换，得到基本相似的结果。因此，本发明包括 其他真核细胞和这些细胞的相应全局转录机器用于改进表型特征的用途，所述表型特征尤 其是对培养基中葡萄糖(和其他糖)和/或乙醇的耐受性，和/或细胞由本领域已知的多 种原料来生产乙醇。 根据本发明的一个方面，提供了经遗传修饰的酵母菌株。该菌株包含突变的SPT15 基因。任选地，在引入突变的SPT15基因或者突变内源SPT15基因之前，不含有突变SPT15 基因的酵母菌株与野生型酵母菌株相比就具有改进的乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或乙醇 生产。相对于野生型酵母和不含突变SPT15基因的酵母菌株而言，突变的SPT15基因进一 步改进乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或乙醇生产。 在一些实施方案中，突变的SPT15基因在F177、Y195和K218中两个或更多位置上 包含突变，优选地在所有三个位置(F177、Y195和K218)上包含突变。在一些优选的实施方 案中，突变的SPT15基因包含突变F177S、 Y195H和K218R中的两个或更多个或者该突变氨 基酸的保守性替换，优选地包含F177S、 Y195H和K218R的全部或者该突变氨基酸的保守性 替换。 在另一些实施方案中，突变的SPT15基因在经遗传修饰的酵母菌株中重组表达。 在一些实施方案中，突变的SPT15基因在质粒上引入酵母细胞中，或引入酵母细胞的基因 组DNA中。在另一些实施方案中，突变的SPT15基因是酵母细胞基因组DNA中原位突变的 内源基因。 在另一些实施方案中，酵母菌株选自酵母菌(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母(Pichia spp.)、法夫酵母(Paffia spp.)、克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)、假丝酵母(Candidaspp. ) 、 Talaromyces spp.、酒香酵母 (Brettanomyces spp. ) 、 Pachysolen spp.、德巴利酵母(Debaryomyces spp.)禾口工业多倍 体酵母菌株。优选地，酵母菌株为酿酒酵母(S. cerevisiae)菌株。 在一些实施方案中，不含突变的SPT15基因的酵母菌株是这样的酵母菌株，其经 遗传改造、选择而具有用于增强乙醇生产的一种或多种期望的表型，或者已知具有这样的 表型。优选地，所述一种或多种期望的表型是乙醇耐受性和/或C5或C6糖发酵提高。C5 和C6糖发酵提高的表型优选地是木糖发酵提高。在这些后面的实施方案的某些中，所述经 遗传修饰的酵母菌株转化有外源木糖异构酶基因、外源木糖还原酶基因和外源木糖醇脱氢 酶基因和/或外源木酮糖激酶基因。在另一些实施方案中，经遗传修饰的酵母菌株包含进 一步的遗传修饰，其为非特异性或特异性的醛糖还原酶基因的缺失、木糖醇脱氢酶基因的 缺失和/或木酮糖激酶的过表达。 在另一些实施方案中，不含突变的SPT15基因的酵母菌株是呼吸缺陷型的酵母菌 株。在一些实施方案中，该酵母菌株显示正常或提高的Spt3表达和/或不是Spt3敲除或 无效突变体。 根据本发明的另一方面，提供了前述经遗传修饰的酵母菌株的产生方法。所述方 法包括向酵母菌株中引入突变SPT15基因的一个或多个拷贝，和/或在酵母细胞的基因组 DNA中原位突变内源基因。 在本发明的又一方面中，提供了生产乙醇的方法。所述方法包括在含有一种或多
种可代谢成乙醇之底物的培养基中将前述经遗传修饰的酵母菌株培养至足以产生含有乙
醇的发酵产物的时间。在一些实施方案中，所述一种或多种可代谢成乙醇的底物包括C5和
/或C6糖。优选地，所述一种或多种C5和/或C6糖包括葡萄糖和/或木糖。 根据本发明的另一方面，提供了用于生产乙醇的方法。所述方法包括在含有一种
或多种可代谢成乙醇之底物的培养基中将包含突变SPT15基因的经遗传修饰的酵母菌株
培养至足以产生含有乙醇的发酵产物的时间，所述突变SPT15基因含有突变F177S、 Y195H
和K218R。在一些实施方案中，所述一种或多种可代谢成为乙醇的底物包括C5和/或C6
糖。优选地，所述一种或多种C5和/或C6糖包括葡萄糖和/或木糖。 在本发明的另一方面中，提供了前述方法的发酵产物，其为从发酵产物中分离的
乙醇。优选地，所述乙醇通过对发酵产物进行蒸馏而分离的。 根据本发明的另一方面，提供了产生具有改进的乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或 乙醇生产的酵母菌株的方法。所述方法包括提供包含突变的SPT15基因的酵母菌株，和针 对改进的乙醇和/或葡萄糖耐受性和/或改进的乙醇生产进行遗传改造和/或选择。
在一些实施方案中，突变的SPT15基因在F177、Y195和K218中两个或更多的位置 上包含突变，优选地在所有三个位置(F177、Y195和K218)上包含突变。在一些优选的实施 方案中，突变的SPT15基因包含突变F177S、 Y195H和K218R中的两个或更多个或者该突变 氨基酸的保守性替换，优选地包含F177S、 Y195H和K218R的全部或者该突变氨基酸的保守 性替换。 在另一些实施方案中，在经遗传修饰的酵母菌株中重组表达突变的SPT15基因。 在一些实施方案中，突变的SPT15基因在质粒上引入酵母细胞中，或引入酵母细胞的基因 组DNA中。在另一些实施方案中，突变的SPT15基因是酵母细胞基因组DNA中原位突变的内源基因。 在另一些实施方案中，酵母菌株选自酵母菌、裂殖酵母、毕赤酵母、法夫酵母、克 鲁维酵母、假丝酵母、Talaromyces spp.、酒香酵母、Pachysolenspp.、德巴利酵母和工业 多倍体酵母菌株。优选地，所述酵母菌株为酿酒酵母菌株。更优选地，所述酵母菌株是 Sptl5-300。 根据本发明的另 一方面，提供了通过前述方法产生的酵母菌株。 本发明的又一方面提供了生产乙醇的方法。所述方法包括在含有一种或多种可代
谢成乙醇之底物的培养基中将前述经遗传修饰的酵母菌株培养至足以产生含有乙醇的发
酵产物的时间。在一些实施方案中，所述一种或多种可代谢成为乙醇的底物包括C5和/或
C6糖；优选地，所述一种或多种C5和/或C6糖包括葡萄糖和/或木糖。 在本发明的另一方面中，提供了前述方法的发酵产物，其为从发酵产物中分离的
乙醇。优选地，所述乙醇通过对发酵产物进行蒸馏而分离。 根据本发明的另一方面，提供了下述酵母菌株，其过表达至少2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13或所有14个表5中所列基因的任何组合，或具有一种或多种基本相似或冗余 的生物/生物化学活性或功能的基因。 根据本发明的又一方面，提供了经遗传修饰的酵母菌株。所述酵母菌株在含有提
高的乙醇水平的培养基中培养时，达到至少4倍于在含有提高的乙醇水平的培养基中培养
的野生型菌株的细胞密度。在一些实施方案中，该菌株达到野生型菌株4-5倍的细胞密度。
在另一些实施方案中，所述提高的乙醇水平为至少约5%或至少约6%。 在前述经遗传修饰的酵母菌株的一些实施方案中，培养基包含一种或多种糖，其
浓度为至少约20g/L、优选地至少约60g/L、更优选地至少约100g/L、进一步更优选地至少
约120g/L。 参照附图和本发明的详细说明，本发明的这些和另一些方面及其多个实施方案将 更为明显。


图1描绘了全局转录机器改造的基本方法。通过将改造的全局转录机器引入细胞 而改变了转录组(transcriptome)，并以全局方式改变基因表达水平。在本研究中，对细菌 的o因子70(由rpoD编码)进行易错PCR，以产生多种突变体。然后将所述突变体克隆 进低拷贝表达载体中，在此期间由于存在近乎完整的内部限制酶位点而使出现截短形式o 因子的概率提高。然后将该载体转化进大肠杆菌中并基于期望的表型进行筛选。然后将分 离的突变体进行后续轮次的诱变和选择，以进一步改进表型。 图2显示乙醇耐受性o因子突变体的分离。分离包含乙醇耐受性提高的突变体 o因子的菌株。图2A:突变体因子的多轮定向进化对表型的总体增强。在乙醇浓度为0、 20、40、50、60、70和80g/L时，通过计算与对照相比突变体倍增时间减少倍数的总和来评估 总体增强(y轴)。至第三轮时，生长速率的改善似乎增量很小。图2B:相对于先前鉴定的 关键功能区，标出07°蛋白上突变的位置。第二轮诱变导致鉴定到了截短的因子，其仅包含 该区域中先前两个突变中的一个。图2C:展示了第三轮突变体(红色)和对照(蓝色)菌 株的生长曲线。第三轮突变体在所有测试的乙醇浓度下具有显著提高的生长速率。图2D:
8乙醇耐受性突变体o因子(天然的，SEQID NO :17 ;第一轮，SEQ ID NO :18 ;第二轮，SEQ ID NO :19 ;第三轮，SEQ ID NO :20)的氨基酸序列比对。 图3显示针对另外表型的o因子序列分析。图3A:相对于先前鉴定的关键功能 区域，标出o"蛋白区域乙酸和pHBA突变体中的突变位置。绝大多数乙酸突变体是全长 o因子。所鉴定的pHBA突变体是截短的因子，预计其作为特定基因转录的抑制剂。图3B: 乙酸耐受性突变体o因子(天然的，SEQ ID NO :17 ;Acl， SEQ ID NO :21 ;Ac2， SEQ ID NO : 22 ;Ac3， SEQ ID NO :23 ;Ac4， SEQ ID NO :24 ;Ac5， SEQ ID NO :25)的氨基酸序列比对。图 3C :pHBA耐受性突变体o因子(天然的，SEQ ID NO :17 ;pHBAl， SEQ ID NO :26)的氨基酸 序列比对。 图4描绘了具有己烷耐受性o因子突变体的分离菌株培养物的细胞密度。图4 还显示最佳己烷耐受性突变体Hex-12和Hex-18的序列。 图5显示具有环己烷耐受性o因子突变体的分离菌株培养物的细胞密度。
图6描绘了在逐渐提高的萘啶酸浓度下，抗生素抗性o因子突变体的分离菌株培 养物的细胞密度。 图7A-7D显示培养所选菌株并测定其在15和24小时时的番茄红素产生的结果， 以及来自最优菌株的o因子突变体的序列。 图8是描绘在发酵期间与对照相比番茄红素产生的最大增加倍数的散点图。圆的 大小与增加倍数成比例。 图9举例说明15小时后几种目的菌株的番茄红素含量。该图将通过全局转录机 器改造提供的改进与通过依次基因敲除的传统菌株改进方法进行比较。在该实例中，全局 转录机器改造法在提高表型方面比一系列多基因敲除更加有效。另外，在预先改造菌株中 实现了改进。 图10显示了在葡萄糖基本培养基中选择PHB指数期提高的菌株。图7A展示使用 o因子改造获得的多种菌株(红色和黄色柱代表对照)的结果。图7B展示从使用转座子 诱变获得的随机敲除文库中所选菌株的结果。 图11描绘了在逐渐提高的SDS浓度下，SDS耐受性o因子突变体的分离菌株培 养物的细胞密度，以及来自最优菌株的o因子突变体的序列。 图12显示酵母中LiCl gTME突变体的生长分析。通过在合成基本培养基中升高 的LiCl水平下进行连续传代培养来分离包含突变体Taf25或Sptl5的菌株。显示了 16小 时后突变体和对照菌株的生长量(以0D600来衡量)。在较低浓度LiCl下Taf25突变体优 于对照，而所述Sptl5突变体在较高浓度下更有效。 图13描绘了酵母中LiCl gTME突变体的序列分析。突变显示在显示每个因子的 关键功能组分的示意图上。发现每种突变体仅具有单个氨基酸替换。 图14显示酵母中葡萄糖gTME突变体的生长分析。通过在合成基本培养基中提高 的葡萄糖水平下进行连续传代培养来分离包含突变体Taf25或Sptl5的菌株。此时，两种 蛋白质均在相似的浓度范围内显示出改进，其中SPT15显示出最大的改进。
图15描绘了酵母中葡萄糖gTME突变体的序列分析。突变显示在显示各个因子的 关键功能组分的示意图上。发现每种突变体仅具有单个氨基酸替换，然而分离了若干另外 的SPT15蛋白，其中一些包含许多突变。
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图16显示酵母中乙醇-葡萄糖gTME突变体的生长分析。通过在合成基本培养基
中提高的乙醇和葡萄糖水平下进行连续传代培养来分离包含突变体Taf25或Sptl5的菌
株，并测定20小时时的生长。此时，SPT15蛋白远远超过TAF25突变体的影响。 图17描绘了酵母中乙醇-葡萄糖gTME突变体的序列分析。突变显示在显示各个
因子的关键功能组分的示意图上。发现每种突变体在DNA或蛋白质接触的关键区域中包含
若干单氨基酸替换。 图18显示对提高的乙醇和葡萄糖浓度具有更高耐受性的酵母gTME突变体。(A) 从sptl5-300或taf25-300突变体文库分离的最佳克隆的突变，显示在各个因子的关键功 能组件的示意图上(补充文本，a部分)。(B)在含有提高水平(按体积计6% )的乙醇和 葡萄糖的合成最小培养基上20小时后测定来自(A)的克隆的生长量(growth yield)。在 这些条件下，sptl5-300突变体远超出taf25-300突变体的性能。将生长量的提高倍数与 下述同基因株比较，所述同基因株带有质粒负载的野生型形式的SPT15或者TAF25。
图19展示了评价突变体在乙醇胁迫下的耐受性的细胞生存力曲线。与对照比 较的spt 15-300突变体菌株生存力测量为时间(小时)的函数，并表述为菌落形成单位 与在按体积计(A)12.5X和(B)15X乙醇存在下在标准培养基中处理和孵育的稳定期细胞 的O小时菌落计数相比的相对数量。在测试的所有按体积计高于10%乙醇的浓度下，spt 15-300突变均赋予显著增强的生存力(图23)。误差条表示生物学重复实验之间的标准差。 初始细胞计数约为3. 5X 106个细胞/ml。 图20显示用于查明突变体sptl5引发的转录组(transcriptome)水平应答的基 因敲除和过表达分析。(A)使用该突变体中十二个最高表达的基因(圆括号中给出1og2差 异性基因表达)进行表型丧失分析，并选择2个额外的基因用于进一步研究(补充文本，c 部分)。通过将质粒上含有sptl5-300突变的敲除菌株与含有野生型SPT15的菌株进行比 较，分别测试缺失14个基因之一的14种菌株(对5X乙醇，60g/L葡萄糖)的耐受性。除 PHM6以外的所有基因敲除均导致表型的轻微或完全丧失。所有这些基因敲除靶标的对照突 变体均显示相似的生长量。(B)针对来自微阵列的前3个候选基因(PH05、 PHM6和FMP16) 提供了基因过表达研究，并如先前所测定的在按体积计6%乙醇下进行测定(也见图26)。 这些基因的过表达未能传递抗性表型。 图21显示阐明和证实部分由SPT3/SAGA复合物介导的机制。(A)通过引入 sptl5-300突变体并在存在按体积计6%乙醇时进行测定来评价spt3敲除的影响。该突 变体不能传递表型，这证明了 SPT3作为所提供机制之一部分的必要性。(B)将三种突变 (F177S、Y195H和K218R)进行作图到由使用每个这些突变位点(22-24， 27， 28)进行的先前 研究所提出的全局转录机器分子机制上。这三种突变共同导致涉及Spt3p的机制。
图22显示分别从taf25和sptl5突变体文库中分离的最佳克隆在含有提高水平 (按体积计5% )的乙醇和葡萄糖的合成基本培养基中20小时后测量的生长量。
图23 :与对照比较的spt 15-300突变体菌株的生存力测量为时间(小时)的函 数，并表述为菌落形成单位与按体积计(A)10%、 (B)17X和(020%乙醇存在下在标准培 养基中处理和孵育的稳定期细胞的0小时菌落计数相比的相对數量。提供了 17. 5%和20% 乙醇的内插图，以更好地显示突变体与带有野生型SPT15形式的对照之间的差异。在测试 的所有按体积计高于10X乙醇的浓度下，spt 15-300突变均赋予显著增强的生存力(也见图2A、2B)。误差条表示生物学重复实验之间的标准差。初始细胞计数约为3. 5X1()6个细 胞/ml。 图24提供了与对照相比sptl5-300突变体菌株中差异表达基因的直方图，统计学 阈值为P值《0. 001。该sptl5-300具有造成基因上调超过造成基因下调的偏好。
图25 :在大肠杆菌乙醇耐受性o因子突变体与对提高的乙醇和葡萄糖有耐受性 的酵母sptl5-300突变体之间比较改变基因的基因分类(geneontology)富集情况。该比 较显示，尽管转录机器存在差异，但是二者均能够引发氧化还原酶和电子传递基因发生改 变的相似的保守性应答。这些蛋白质功能在这些菌株中的乙醇耐受性中起重要作用。环的 大小与功能富集的P值成正比。 图26 :针对来自微阵列的前3个候选基因(ra05、PHM6和FMP16)提供了基因过表 达研究，并在按体积计5%乙醇下进行测定(也见图3B)。 图27 :对产生三重sptl5突变体的单突变和双突变的详尽评价证明，单突变或双 突变的组合性能均不如所鉴定的三重突变体好。针对每种修饰在y轴以及轨线(通过颜 色)上描绘了累积的相对适应度。补充文本d部分提供了每种突变体的数据和适应度数据 的解释。 图28描绘了在5%乙醇和多种葡萄糖浓度存在下孵育20小时后对照菌株的生长。
图29描绘了在6%乙醇和多种葡萄糖浓度存在下孵育20小时后对照菌株的生长。
图30显示含20g/L葡萄糖的低接种物发酵中突变体和对照的葡萄糖、细胞密度和 乙醇谱。突变体和对照之间生长速率相似，但是在延长的生长期继续生长(A)。突变体中乙 醇产量也更高(B)。 图31显示含100g/L葡萄糖的低接种物发酵中突变体和对照的葡萄糖、细胞密度 和乙醇谱。突变体菌株中的葡萄糖利用率和生长超过对照。另外，突变体中乙醇产量更高。
图32 :用OD 15 ( 4g DCW/L)原始细胞密度的高接种在100g/L葡萄糖中以生物 学重复培养细胞。上述图谱展示，突变体显示更有活力的生长(更高的生长量)、对葡萄糖 的完全利用和更高的乙醇生产力。
发明详述 在所有的细胞系统(原核的和真核的)中，全局转录机器均负责控制转录组。在 细菌系统中，o因子在协调全局转录中发挥关键作用，这通过致力于RNA聚合酶全酶的启 动子偏好来实现(R.R.Burgess，L. Anthony, Curr.Opin. Microbiol 4， 126-131 (2001))。大 肠杆菌(Escherichia coli)包含6种可替代的o因子和一种主要因子o7Q(由基因rpoD 编码)。在蛋白质水平上，已在与启动子位点及全酶接触的残基区进行了分析(J. T. Owens 等，PNAS 95,6021-6026(1998))。大肠杆菌和另一些细菌中o 7°的位点特异性诱变以及晶 体结构分析已证明了改变RNA聚合酶全酶的体外启动子偏好的能力，其证据为报告基因转 录的提高或降低(A. Malhotra， E. Severinova， S. A. Darst， Cell 87,127-36(1996))。本发 明开拓了产生在整个基因组水平上具有不同启动子偏好的突变体o因子的能力。
传统的菌株改进范例主要依赖于依次产生单个基因修饰，并且常常不能达到全 局的最高点。其原因是代谢情况是复杂的(H.Alper， K. Miyaoku， G. St印hanopoulos， Nat Biotechnol 23， 612-616 (2005) ;H. Alper， Y. -S. Jin， J. F. Moxley， G. St印hanopoulos， Metab Eng 7， 155-164 (2005))，并且增量式或贪婪搜索算法(greedy search algorithm)无法揭示仅在所有突变同时引入时才有益处的合成突变体。另一方面，通过随机诱变和选 择增强的抗体亲合力、酶特异性或催化活性，蛋白质工程可迅速地改进适合性(E. T. Boder， K. S.Midelfort， K.D.Wittrup， Proc Natl Acad Sci USA 97,10701-5(2000) ;A.Glieder， E. T. Farinas， F. H. Arnold, Nat Biotechnol 20,1135-9(2002) ;N. Varadarajan， J. Gam， M.
Olsen，G. Georgiou，B. L. Iverson，Proc Natl Acad Sci USA 102，6855—60(2005))。这 些实例中获得显著增强的重要原因是，这些方法能够通过评估许多同时发生的突变来探测 巨大的氨基酸组合空间。使用本发明，我们利用了 07°因子的全局调节功能，从而类似地引 入多个同时的基因表达改变，并因此通过选择负责改进的细胞表型的突变体来促进全细胞 改造。 本发明提供了用于改变细胞表型的方法。该方法包括突变编码全局转录机器蛋白 的核酸以及任选的其启动子；在细胞中表达所述核酸，以提供包含突变的全局转录机器蛋 白的改造细胞；以及培养所述改造细胞。本文使用的"全局转录机器"是调节多种基因转录 的一种或多种分子。所述全局转录机器可以是通过与RNA聚合酶分子相互作用以及调节其 活性来影响基因转录的蛋白质。所述全局转录机器还可以是改变细胞基因组转录能力的蛋 白质(例如，甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白乙酰化酶和脱乙酰基酶)。另外，全局 转录机器可以是改变多种基因转录的非蛋白质分子(例如小RNA (micro RNA))。
可用于本发明的全局转录机器包括细菌的o因子和抗o因子。编码o因子的 基因的实例包括rpoD(编码。,、rpoF(编码。2s)、rpoS(编码。3s)、rpoH(编码o 32)、 rpoN(编码。，、rpoE(编码。24)和feci (编码。19)。抗。因子与。因子结合，并控制 其可用性，因此控制转录。在大肠杆菌中，抗o因子由rsd(针对o因子70)或flgM等编 码。可突变抗o因子从而控制它们对正常细胞转录的影响。另外，可创造突变体o因子 与突变体抗o因子的新配对，从而获得细胞中对转录的进一步控制。例如，可使用诱导型 启动子表达抗o因子，所述启动子使得可调节地控制突变体o因子所传递的表型。
全局转录机器还包括与真核RNA聚合酶(如RNA聚合酶I、 RNA聚合酶II或 RNA聚合酶III)或者RNA聚合酶I、 RNA聚合酶II或RNA聚合酶III的启动子结合并且 调节其活性的多肽。这样的真核全局转录机器的实例包括TFIID或其亚基，如TATA结 合蛋白(TBP)或TBP相关因子(TAF)如TAF25，以及延伸因子。来自多种物种的TBP的 实例包括NPJ) 11075. 1;AAA35146. 1 ;XP_447540. 1 ;NP_986800. 1 ;XP454405. 1 ;1YTB ; 1TBP ;XP_462043.1 ;AAA79367.1 ;XP_501249.1 ;NP_594566.1 ;AAA79368.1 ;AAY23352.1 ; Q12731 ;BAE57713. 1 ;XP_001213720. 1 ;XP_364033. 1 ;XP_960219. 1 ;CAJ41964. 1 ; EAT85966. 1 ;XP_754608. 1 ;XP_388603. 1 ;P26354 ;EAU88086. 1 ;XP_758541. 1 ; XP_662580. 1 ;XP_710759. 1 ;XP_572300. 1和BAB92075. 1。来自酵母的全局转录机器的其它 实例包括GAL11 、 SIN4、 RGR1 、 HRS1 、 PAF1 、 MED2、 SNF6、 SNF2和SWI1 。 全局转录机器还包括改变染色体DNA转录能力的多肽，如核酸甲基转移酶(例 如DamMT、 DNMT1、 Dnmt3a)、组蛋白甲基转移酶(例如Setl、 MLL1)、组蛋白乙酰化酶(例如 PCAF、 GCN5、 Sas2p以及其他MYST型组蛋白乙酰化酶、TIP60)和组蛋白脱乙酰基酶(例如 HDACl、HDAl、HDAC2、HDAC3、RPD3、HDAC8、Sir2p)，以及相关因子(例如HDAC家族与mSin3A、 Mi-2/NRD、 CoREST/kiaa0071、 N-CoR和SMRT有关)。 另一些全局转录机器由真核细胞细胞器(如线粒体或叶绿体)的核酸分子编码。
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前述全局转录机器的实例仅旨在举例。本领域技术人员应当知道，全局转录机器 的许多其他实例是已知的，前述实例的来自其他物种的许多其他实例是已知的。本发明包 括所有前述内容的用途。 另外，可根据本发明使用的全局转录机器包括与目的分子具有至少XX同一性的 序列。例如，根据本发明考虑使用与酿酒酵母TBP SPT15共有相同序列的分子，即SPT15的 同源物。这些同源物具有至少约70%的同一性，优选至少约75%的同一性，更优选至少约 80%的同一性，进一步更优选至少约85%的同一性，进一步更优选至少约90%的同一性， 进一步更优选至少约95%的同一性，进一步更优选至少约97 %的同一性，最优选地至少约 99%的同一性。 在许多情况下，对全局转录机器进行突变的过程将包括反复产生多种全局转录机 器突变，但这并不是必需的，因为甚至全局转录机器中的单个突变也能导致显著的表型变 化，如本文中所述。 尽管本发明的方法通常通过对全局转录机器进行突变以及之后将突变的全局转 录机器引入细胞以产生改造细胞来进行，但也有可能突变内源全局转录机器基因，例如通 过用突变体全局转录机器进行替换或者对内源全局转录机器进行原位突变来实现。本文使 用的"内源"指对细胞而言是天然的；在对全局转录机器进行突变的情况下，"内源"是指细 胞中的全局转录机器基因。相反地，更典型的方法包括在细胞外突变全局转录机器基因，然 后将该突变基因引入细胞中。 所述全局转录机器基因可以属于与所引入细胞相同的或不同的物种。例如，如本
文所示，突变大肠杆菌o因子70并引入大肠杆菌中，以改变大肠杆菌细胞的表型。也可
以以同样的模式应用大肠杆菌的其它全局转录机器。类似地，可以突变特定酵母物种(例
如酿酒酵母(S. cerevisiae)或裂殖酵母(S.pombe))的全局转录机器并引入同样的酵母
物种中。同样，可以使用标准重组遗传技术以类似于本文所提供具体实施例的方式突变
线虫(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))或者哺乳动物(例如小鼠(M. musculus)、褐家鼠
(R. norvegicus)或人(H. sapiens))的全局转录机器并引入同样的物种中。 或者，可以使用来自不同物种的全局转录机器，以提供基因转录控制中的其它变
化。例如，可以突变链霉菌属(Str印tomyces)细菌的全局转录机器并引入大肠杆菌中。不
同的全局转录机器还可以来自生物的不同界或门。取决于所使用的突变方法，可以将相同
的和不同的全局转录机器组合，以用于本发明的方法，例如通过基因改组来组合。 任选地，可以诱变全局转录机器的转录控制序列，而非编码序列本身。转录控制序
列包括启动子和增强子序列。然后，可将与全局转录机器编码序列连接的突变启动子和/
或增强子序列引入细胞中。 将突变体全局转录机器引入细胞产生改造细胞后，接着确定/测定改造细胞的表 型。这可以通过对改造细胞选择具有(或不具有)特定表型来实现。以下有表型实例的详 细描述。还可通过将改造细胞的表型与改造前细胞的表型进行比较来确定表型。
在一些优选的实施方案中，将全局转录机器的突变和突变体全局转录机器的引入 重复进行一次或多次，从而得到"第n代"改造细胞，其中"n"是突变和引入全局转录机器 的重复次数。例如，重复突变并引入全局转录机器一次(在全局转录机器最初的突变和引 入之后)得到第二代改造细胞。再一次的重复得到第三代改造细胞，依此类推。然后，对包
13含反复突变的全局转录机器的细胞确定表型(或者与包含未突变的全局转录机器或之前 重复的突变体全局转录机器的细胞进行比较)，如本文中别处的描述。 反复突变全局转录机器使表型在连续突变步骤后得以改进，每个步骤可引起全局 转录机器的多个突变。反复诱变也有可能引起全局转录机器中的特定氨基酸残基突变在反 复过程中"出现"或"消失"。在工作实施例中提供了此类突变的实例。 在所述方法的典型用途中，通过突变编码全局转录机器的核酸分子对全局转录机 器进行定向进化。突变核酸分子的一个优选方法是对编码序列进行诱变，然后插入载体 (例如质粒)中。尽管优选在插入载体之前突变编码序列，但必要时该过程也可颠倒，即首 先将核酸分子插入载体中，然后对序列进行诱变。 当重复进行全局转录机器定向进化时(即在本发明的反复过程中)，一种优选的 方法包括从改造细胞中分离编码突变体全局转录机器的核酸以及任选地其启动子。然后突 变所分离的核酸分子(产生编码第二代突变体全局转录机器的核酸)，随后引入另一细胞 中。 在突变时，所述分离的核酸分子形成包含不同突变或突变组的突变核酸分子集 合。例如，当核酸分子在随机突变时可包含沿核酸分子长度上一个或多个位置突变的突变 组。因此，该组的第一成员可包含核苷酸nl处的一个突变(其中nx表示核酸分子的核苷酸 序列号，x是从分子的第一个至最后一个核苷酸的核苷酸位置)。该组的第二成员可包含核 苷酸n2处的一个突变。该组的第三成员可包含核苷酸nl和n3处的两个突变。该组的第 四成员可包含n4和n5位置上的两个突变。该组的第五成员可包含三个突变核苷酸n4和 n5的两个点突变以及核苷酸n6-n7的缺失。该组的第六成员可包含核苷酸nl、n5和n8的 点突变，以及3'端的核苷酸截短。该组的第七成员中核苷酸n9-nl0可能与核苷酸nll-n12 发生了交换。本领域的普通技术人员可以容易地预期多种其它组合，包括随机和定向突变 的组合。 所述核酸分子的集合可以是核酸文库，如插入载体中的许多不同的突变核酸分 子。这样的文库可根据分子生物学的标准方法贮存、复制、等分和/或引入细胞以产生改造 细胞。 用于定向进化的全局转录机器突变优选是随机的。然而，也可以限制全局转录机 器中所引入突变的随机性，以产生全局转录机器的非随机或部分随机突变或者这些突变的 某种组合。例如，对于部分随机突变，突变可局限在编码全局转录机器的核酸分子中的某个 部分。 可基于期望的突变类型来选择突变方法。例如，对于随机突变，可使用诸如核酸 分子的易错PCR扩增的方法。可使用定点诱变在核酸分子的特定核苷酸处引入特定突变。 可使用合成核酸分子来引入特定的突变和/或随机突变，后者位于一个或多个特定核苷酸 处，或者跨越整个核酸分子的长度。合成核酸的方法在本领域是公知的(例如，Tian等， Nature 432:1050-1053(2004))。 可使用DNA改组(也叫作基因改组)通过交换核酸分子区段来引入其它突变。参 见如美国专利6，518，065、相关专利及其引用的参考文献。用作改组源材料的核酸分子可以 是编码单一类型的全局转录机器(例如o7°)或者多于一种类型的全局转录机器的核酸分 子。例如，可以改组编码不同全局转录机器的核酸分子，如单一物种的不同o因子(例如，大肠杆菌的07°和028)，或者来自不同物种的o因子。同样地，可以改组编码不同类型全 局转录机器(例如o因子70和TFIID)的核酸分子。 突变核酸分子(以随机或非随机的方式)的多种其它方法是本领域普通技术人员 公知的。可以组合地使用一种或多种不同方法，以在编码全局转录机器的核酸分子中产生 突变。在这方面，"组合地"指不同类型的突变组合在单个核酸分子中，并且分配到核酸分 子组中。不同类型的突变包括点突变、核苷酸截短、核苷酸缺失、核苷酸添加、核苷酸替换和 核苷酸区段的改组(例如，再分配)。因此，任何单个核酸分子可包含一种或多种类型的突 变，并且它们可以随机地或非随机地分配到核酸分子组中。例如，一组核酸分子可以包含该 组中每个核酸分子共有的突变，以及不为该组中每个核酸分子共有的数量可变的突变。例 如，所述共有突变可以是发现对细胞的期望改造表型有利的突变。 优选地，所述一种或多种截短或缺失不破坏或除去全局转录机器的启动子结合区 域。 相对于未突变的全局转录机器，所述突变的全局转录机器可表现出提高或降低的 基因转录。另外，相对于未突变的全局转录机器，所述突变的全局转录机器可表现出提高或 降低的基因转录抑制。 本文使用的"载体"可以是许多核酸中的任意一种，所述核酸中可通过限制性处 理和连接而插入期望序列，用于在不同的遗传环境之间进行运输或者用于在宿主细胞中表 达。载体通常由DNA组成，然而RNA载体也是可用的。载体包括但不限于质粒、噬菌粒、病 毒基因组和人工染色体。 克隆载体是能够自主复制或整合进宿主细胞基因组的载体，并且其特征还在于一 个或多个核酸内切酶限制性位点，该载体可在所述位点处以可确定的方式切割，并且目标 DNA序列可连接进所述位点处，从而新的重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。对于质 粒而言，由于质粒在宿主细菌中拷贝数增加，所以目的序列可发生多次复制，或者在每个宿 主中仅在宿主通过有丝分裂复制前发生一次。对于噬菌体而言，复制可在溶胞阶段期间主 动发生，或者在溶原阶段期间被动发生。 表达载体是这样的载体，其中可通过限制性处理和连接插入期望DNA序列，从而 其与调节序列有效连接，并可表达为RNA转录物。载体还可包含一个或多个标记序列，其适 于鉴定被或未被该载体转化或转染的细胞。标记包括如编码提高或降低对抗生素或其它化 合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因、编码可通过本领域已知的标准测定检测其活性的酶 (例如，e-半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)的基因以及以可见方式影响转化或转染 的细胞、宿主、菌落或菌斑的表型的基因(例如，绿色荧光蛋白)。优选的载体是能够自主复 制和表达结构基因产物的载体，所述结构基因产物存在于与载体有效连接的DNA区段中。
如本文使用的，当以将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制之下的 方式共价连接时，编码序列和调节序列称为"有效"连接。如果期望编码序列翻译为功能蛋 白，那么如果诱导5'调节序列中的启动子导致编码序列转录，并且如果两个DNA序列间连 接的性质不会(1)导致引入移码突变、(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力或者 (3)干扰相应的RNA转录物翻译成蛋白质的能力，则两DNA序列称为有效连接。因此，如果 启动子区域能够影响DNA序列的转录从而得到的转录物可翻译成期望的蛋白质或多肽，则 所述启动子区将是与编码序列有效连接的。
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基因表达所需调节序列的确切性质在物种或细胞类型之间可以不同，然而根据需 要通常应包括分别参与起始转录和翻译的5'非转录和5'非翻译序列，如TATA盒、加帽序 列、CAAT序列等。特别地，这样的5'非转录调节序列将包括启动子区，所述启动子区含有 控制有效连接基因转录的启动子序列。如有必要，调节序列还可包括增强子序列或上游激 活子序列。本发明的载体可任选地包括5'前导或信号序列。选择和设计合适的载体在本 领域普通技术人员的能力和判断力之内。 包含所有表达必要元件的表达载体是市售的，并为本领域技术人员所公知。参见 如Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Ma皿al， Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。通过向细胞中引入编码CT抗原多肽或其片段或变体的 异源DNA(RNA)来遗传改造所述细胞。所述异源DNA(RNA)置于转录元件的有效控制下，从 而允许该异源DNA在宿主细胞中表达。 用于在哺乳动物细胞中表达mRNA的优选系统为例如pRc/CMV或pcDNA3. 1 (可从 Invitrogen， Carlsbad, CA获得)，其包含选择标记如G418抗性基因(便于选择稳定转染细 胞系)以及人巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子序列。另外，适于在灵长类或犬类细胞系 中表达的载体是包含EB病毒(EBV)复制起点的pCEP4载体(Invitrogen)，其有助于维持质 粒作为多拷贝染色体外元件。 当编码突变全局转录机器的核酸分子在细胞中表达时，可使用多种转录控制序列 (例如启动子/增强子序列)指导全局转录机器的表达。所述启动子可以是天然启动子，即 该全局转录机器的启动子，其提供对全局转录机器表达的正常调节。所述启动子还可以是 广泛表达的启动子，如P-肌动蛋白、泛素B、噬菌体的启动子或者巨细胞病毒启动子。本 发明有用的启动子还可以是不广泛表达全局转录机器的启动子。例如，可以使用组织特异 性启动子、细胞特异性启动子或细胞器特异性启动子在细胞中表达全局转录机器。还可使 用多种条件启动子，如受分子存在与否控制的启动子，如四环素应答启动子(M.Gossen和 H. Bujard，Proc. Natl Acad. Sci USA，89，5547—5551 (1992))。 可使用本领域的标准方法和技术将编码突变全局转录机器的核酸分子引入细胞 或多种细胞中。例如，可通过多种转染方法、转导、电穿孔、粒子轰击、注射(包括细胞的显 微注射以及向多细胞生物注射)、脂转染、用于YAC(酵母人工染色体)的酵母原生质球/细 胞融合物、用于植物细胞的农杆菌介导的转化等引入核酸分子。 表达编码突变全局转录机器的核酸分子还可通过将该核酸分子整合进基因组或 者通过替换编码内源全局转录机器的核酸序列来实现。 通过突变全局转录机器提供了新的组成，包括通过多轮突变产生的编码全局转录 机器的核酸分子。多轮突变可包括定向进化，其中每轮突变之后是选择过程，以选择具有期 望表型的已突变全局转录机器。突变和选择突变全局转录机器的方法在本文中其他处描 述。还提供了利用这些核酸分子得到的全局转录机器。 在某些情况下，已发现突变的全局转录机器是截短形式的未突变全局转录机器。 特别地，对于o因子70来说，已发现仅保留07°蛋白羧基端的07°氨基端截短为所引入的 细菌提供了有利的表型。因此，提供了全局转录机器的片段，尤其是保持启动子结合特性的 未突变全局转录机器片段，更优选包含区域4的07°片段。还提供了编码截短的全局转录 机器的核酸分子，包括包含在载体和/或细胞中的核酸分子。
用于本发明的细胞包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括细菌细胞和古细菌 细胞。真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、干细胞和真菌细胞。 真核细胞可包含在例如多细胞生物的一部分或整体中。多细胞生物包括哺乳动物、线虫 如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、植物如拟南芥(Arabidop sis thaliana)、家 蚕(Bombyx mori)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)、海胆和黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster)。 细菌的实例包括埃希氏菌(Escherichia spp.)、链霉菌(Str印tomycesspp.)、 发酵单胞菌(Zymonas spp.)、醋杆菌(Acetobacter spp.)、柠檬酸杆菌(Citrobacter spp.)、集胞蓝细菌(Synechocystis spp.)、根瘤菌(Rhizobium spp.)、梭菌(Clostridium spp.)、棒杆菌(Corynebacteriumspp.)、链球菌(Streptococcus spp.)、黄单胞菌 (Xanthomonas spp.)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)、乳5求菌(Lactococcus spp.)、芽 包杆菌(Bacillusspp.)、产碱菌(Alcaligenes spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、 气单胞菌(Aeromonas spp.)、固氮菌(Azotobacter spp.)、从毛单胞菌(Comamonas spp.)、分丰支木干菌(Mycobacterium spp.)、纟工5求菌(Rhodococcus spp.)、葡糖木干菌 (Gluconobacter spp.)、雷尔氏菌(Ralstoniaspp.) 、 Acidithiobacillus spp.、小月 菌(Microlunatus spp.) 、 Geobacter spp. 、 Geobacillus spp.、节杆菌(Arthrobacter spp.)、黄杆菌(Flavobacteriumspp.)、沙雷氏菌(Serratia spp.)、糖单孢菌 (Saccharopolyspora spp.)、栖热菌(Thermus spp.)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas spp.)、色杆菌(Chromobacterium spp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium spp.)、糖多孢菌 (Saccharopolyspora spp.)、农杆菌(Agrobacterium spp.)禾口泛菌(Pantoeaspp.)。
古菌(也称为古细菌)的实例包括甲基单胞菌(Methylomonas spp.)、硫化叶 菌(Sulfolobus spp.)、甲基杆菌(Methylobacterium spp.)、盐杆菌(Halobacterium spp.)、甲烷杆菌(Methanobacterium spp.)、甲烷球菌(Methanococci spp.)、甲烷嗜热菌 (Methanopyri spp.)、古生球菌(Archaeoglobus spp.)、铁球菌(Feiroglobus spp.)、热原 体(Thermoplasmata spp.)禾口热球菌(Thermococci spp.)。 酵母的实例包括酵母菌(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母(Pichia spp.)、法夫酵母(Paffiaspp.)、克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)、假丝酵母(Candida spp.) 、Talaromyces spp.、酒香酵母、Pachysolen spp.、德巴禾U 酵母和工业多倍体酵母菌株。 真菌的实例包括曲霉(Aspergillus spp.)、青霉菌(Penicillium spp.)、镰刀菌 (Fusarium spp.)、根霉(Rhizopus spp. )、丁页抱霉(Acremoniumspp.)、脉抱菌(Neurospora spp.)、类壳菌(Sordaria spp.)、禾舀瘤菌(Magnaporthe spp.)、异水霉(Allomyces spp.)、 黑粉菌(Ustilago spp.)、葡萄孢菌(Botrytis spp.)禾口木霉(Trichoderma spp.)。
昆虫细胞的实例包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞系如Sf9和 Sf21、果蝇细胞系如Kc、Ca、311、DH14、DH15、DH33Pl、P2、P4和SCHNEIDER-2 (D. Mel-S2)和 舞毒蛾(Lymantria dispar)细胞系如652Y。 哺乳动物细胞的实例包括原代细胞如干细胞和树突细胞，以及哺乳动物细胞系如 Vero、HEK 293、Sp2/0、P3UI、CH0、C0S、HeLa、BAE-l、MRC-5、NIH 3T3、L929、HEPG2、NS0、U937、 HL60、YACl、BHK、R0S、Y79、Neuro2a、NRK、MCF-10、RAW 264. 7和TBY-2。
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干细胞系包括hESC BG01、hESC BG01V、ES-C57BL/6、ES-D3GL、 J1、R1、RW. 4、7AC5/ EYFP禾口R1/E。另外的人类干细胞系包括(NIH命名)CHOl、 CH02、 GEOl、 GE07、 GE09、 GE13、 GE14、GE91、GE92、SA19、MB01、MB02、MB03、NC01、NC02、NC03、RL05、RL07、RL10、RL13、RL15、 RL20和RL21。 全局转录机器的定向进化产生改造细胞，其中一些具有改变的表型。因此，本发明 还包括选择具有预定表型的改造细胞。可通过在选择条件下培养所述改造细胞来选择预定 表型。还可通过高通量测定个体细胞的表型来选择预定表型。例如，可在细胞中对有害条 件的耐受性和/或代谢物产生的提高进行选择。耐受性表型包括耐受溶剂如乙醇、有机溶 剂如己烷或环己烷；耐受有毒代谢物如乙酸、对羟基苯甲酸(pHBA)、对羟基肉桂酸、羟基丙 醛、过表达的蛋白质、有机溶剂和免疫抑制分子；耐受表面活性剂；耐受渗透胁迫；耐受高 糖浓度；耐受高温；耐受极端PH条件(高或低)；抗凋亡；耐受有毒底物如有害废物；耐受 工业培养基；提高抗生素抗性等。实施例中示例了对乙醇耐受性、有机溶剂耐受性、乙酸盐 /酯耐受性、对羟基苯甲酸耐受性、SDS耐受性和抗生素抗性的选择。在其它一些实施例中， 示例了对提高的番茄红素和聚羟基丁酸酯产生的选择。在酵母细胞的实施例中，示例了对 高糖(葡萄糖)耐受性、渗透胁迫(LiCl)耐受性和对高葡萄糖和乙醇浓度的多重耐受性的 选择。 还可以选择多细胞生物所表现另一些表型。可将全局转录机器的突变体弓I入哺乳 动物或其它真核细胞系中，或者甚至引入完整生物中(例如，通过引入生殖细胞系或注射 进卵母细胞中)，以允许筛选表型。这些表型可以在生物的单细胞中表现或不表现，并包括 一种或多种生长特征、世代时间、对一种或多种害虫或疾病的抗性、果实或其他植物部分的 产生、一种或多种发育变化、一种或多种寿命变化、功能的获得或丧失、健壮性提高等。
涉及包含突变全局转录机器的改造细胞时，本文使用的"耐受性"指与未改造细胞 或先前改造的细胞相比，所述改造细胞能够耐受有害程度更高的条件。例如，所述未改造或 先前改造的细胞是"子代"改造细胞的"亲本"，或者与被测细胞(第n代)相比，所述未改 造或先前改造的细胞是第(n-l)代。"耐受有害条件"指与未改造或先前改造的细胞相比， 所述改造细胞具有提高的生长和/或存活。该概念还包括提高产生对细胞有毒的代谢物。
关于对高糖浓度的耐受性，这样的浓度可以是^ 100g/L、> 120g/L、> 140g/L、
> 160g/L、 > 180g/L、 > 200g/L、 > 250g/L、 > 300g/L、 > 350g/L、 > 400g/L、 > 450g/L、
> 500g/L等。关于对高盐浓度的耐受性，这样的浓度可以是^ 1M、 > 2M、 > 3M、 > 4M、 > 5M 等。关于对高温的耐受性，所述温度可以是例如对细菌细胞为^ 42°C、> 44°C、> 46°C、
> 48°C 、 > 50°C 。可根据所使用细胞类型选择其它的温度范围。关于对极端pH的耐受性，示 例性pH截止值为例如^ pH10、 > pHll》pH12、 > pH13，或者《pH4. 0、《pH3. 0、《pH2. 0、 《pHl.O。关于对表面活性剂的耐受性，示例性表面活性剂浓度为^ 5% (重量/体积)、
> 6% (重量/体积)、> 7% (重量/体积)、> 8% (重量/体积)、> 9% (重量/体 积)、> 10% (重量/体积)、> 12% (重量/体积)、> 15% (重量/体积)等。关于对 乙醇的耐受性，示例性乙醇浓度为>4% (体积/体积)、>5% (体积/体积)、>6% (体 积/体积)、> 7% (体积/体积)、> 8% (体积/体积)、> 9% (体积/体积)、> 10% (体积/体积)等。关于对渗透胁迫的耐受性，诱导渗透胁迫的示例性浓度(例如LiCl浓 度)为> 100rnM、》150rnM、》200mM、 > 250mM、 > 300mM、 > 350mM、 > 400mM等。
本发明包括获得细胞中提高的代谢物产生。本文使用的"代谢物"是在或能在细胞中产生的任何分子。代谢物包括代谢中间体或终产物，任何所述产物均能可对细胞具有毒性，在这些情况下提高的产生可涉及对该有毒代谢物的耐受性。因此，代谢物包括小分子、肽、大的蛋白质、脂质、糖等。示例性代谢物包括实施例中展示的代谢物(番茄红素、聚羟基丁酸和乙醇)；治疗性蛋白质(如抗体或抗体片段)。 本发明还提供了对多种表型的选择，如对多种有害条件的耐受性、多种代谢物产生的提高，或者其组合。 一个实例是实施例中展示的酵母对高葡萄糖和乙醇浓度的多重耐受性。 使用在引入突变全局转录机器之前预先为预定表型进行优化的细胞可能是有利的。因此，例如在番茄红素的产生中，优选使用产生较多量番茄红素(更优选最佳量的番茄红素)的细胞，而不是从仅产生少量番茄红素的细菌细胞开始。在这些情况下，突变全局转录机器用于进一步改进已有改进的表型。 通过所述突变全局转录机器的作用，所述改造细胞将具有改变的基因表达。在某些方面，本发明的方法可包括鉴定改造细胞中基因表达的变化。可使用多种本领域公知的方法鉴定基因表达的变化。优选地，使用核酸微阵列测定基因表达的变化。
在本发明的一些方面，细胞中通过突变全局转录机器产生的一种或多种基因表达变化可以在另一细胞中再现，从而产生相同的(或相似的)表型。可以如上所述鉴定突变全局转录机器产生的基因表达变化。然后，可通过重组基因表达或其它手段将调控靶向个体基因。例如，突变的全局转录机器可提高基因A、B、C、D和E的表达，并降低基因F、G和H的表达。本发明包括调节一种或多种上述基因的表达，以再现突变全局转录机器所产生的表型。为了再现预定的表型，可提高或降低基因A、 B、 C、 D、 E、 F、 G和H中的一种或多种，所述提高例如通过向细胞中引入包含该基因序列的表达载体来实现；通过提高编码所述一种或多种基因产物的一种或多种内源基因的转录来实现，或者通过突变该一种或多种基因的转录控制(例如，启动子/增强子)序列来实现；所述降低例如通过向第一细胞中引入降低所述一种或多种基因产物表达的核酸分子(如siRNA核酸分子或表达siRNA分子的核酸分子)来实现，或者通过突变编码所述一种或多种基因产物的一种或多种基因或者所述一种或多种基因的转录控制(例如，启动子/增强子)序列来实现。 任选地，包含突变全局转录机器的细胞中的基因表达变化用于构建基因或蛋白质网络的模型，然后使用所述模型选择改变网络中一种或多种基因产物中的一种。可以通过Ideker及其同事的方法(参见，例如Kelley等，Proc Natl Acad Sci USA 100(20)，11394-11399(2003) ;Yeang等GenomeBiology 6 (7)， Article R62(2005) ;Ideker等，Bioinformatics. 18 Suppll :S233_40 (2002))或Liao及其同事的方法(参见，例如Liao等，Proc NatlAcad Sci USA 100 (26) ， 15522-15527 (2003) ;Yang等，BMC Genomics 6，90(2005))产生基因或蛋白质网络的模型。 本发明还包括通过本文所述的任何方法得到的细胞，以及包含所述细胞的多细胞生物。所述细胞可用于多种目的，包括分子的工业生产(例如，许多耐受性表型和代谢物产生提高的表型)；生物除污(例如，有害废物耐受性表型)；鉴定在癌症病因中有活性的基因(例如，抗凋亡表型)；鉴定细菌及其它原核生物对抗生素的抗性中有活性的基因；鉴定害虫对杀虫剂的抗性中有活性的基因等。
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在另一方面，本发明提供用于改变代谢物产生的方法。所述方法包括根据本文别处描述的方法突变全局转录机器以产生改造细胞。所述细胞优选为产生所选代谢物的细胞，并且如上所述，优选对代谢物产生预先进行优化。然后，可分离所选代谢物的产生发生提高或降低的细胞。该方法还可包括培养分离细胞以及从该细胞或细胞培养物中回收代谢物。可使用本领域公知的方法进行培养细胞以及回收代谢物的步骤。本文别处提供了多种优选的细胞类型、全局转录机器和代谢物。 如本文中进一步举例的，本发明包括可用于生产乙醇的经遗传修饰的酵母菌株。可根据本发明修饰多种酵母中的任一种并用于生产乙醇。示例性的酵母在上文中提到，并包括例如酵母菌、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、毕赤酵母、汉逊酵母(Hanse皿la)、丝孢酵母(Trichosporon)、酒香酵母、Pachysolen和Yamadazyma属的酵母和工业多倍体酵母菌株。在某些实施方案中，所述酵母是酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母(K. marxia皿s)、乳酸克鲁维酵母(K. lactis) 、 K. thermotolerans、 C. sonorensis、 C. methanosorbosa、C. diddensiae、 近平滑假丝酵母(C. par即silosis) 、 C. naeodendra、 C. balnkii、C. entomophila、 C. shecatae、 P. t靈ophilus或树干毕赤酵母(P. stipitis)。马克斯克鲁维酵母、C. sonorensis、C. shehatae、Pachysolen t靈ophilus禾口树干毕赤酵母是在木糖上生长的酵母细胞的实例。它们具有天然的木酮糖_5-磷酸到甘油醛-3-磷酸途径、天然的功能性醛糖和/或木糖还原酶基因、活性木糖醇脱氢酶基因以及将木糖转运穿过细胞壁或膜的天然能力。在本发明的多个实施方案中，所述酵母可以是单倍体、二倍体或多倍体(具有多于两个拷贝的其基因组的部分或全部)。 在本发明的某些实施方案中，酵母经遗传改造以表达或过表达(相对于野生型水平) 一种或多种下述蛋白质，所述蛋白质赋予提高的摄取或代谢糖的能力。所述糖可以是例如单糖、二糖或寡糖。该糖可以是通常被酵母大量利用的糖。该糖可以是木糖、阿拉伯糖等。本领域已知针对木糖代谢改造酵母的多种方法。见例如Jeffries等，Curr.Op. Biotechnol. ，17 :320-326， 2006和其中的参考文献，其通过参考整体并入本文。酵母可以被改造为进行戊糖磷酸途径(PPP)——存在于许多生物中的用于木糖代谢的生物化学途径。合适的蛋白质包括但不仅限于木糖还原酶、木糖醇脱氢酶、磷酸酮酶以及便于底物进入细胞的转运蛋白或通透酶。在某些实施方案中，酵母能够将至少两种糖例如葡萄糖和木糖代谢为乙醇。 在本发明的某些实施方案中，将来自第一微生物(例如酵母)的一种或多种蛋白质在第二微生物中表达。例如，可将来自天然代谢木糖的酵母(例如树干毕赤酵母)的一种或多种基因在不能有效利用木糖或利用木糖效率较低的酵母中表达。在某些实施方案中，过表达编码戊糖磷酸途径中蛋白质的基因。在某些实施方案中，醛糖还原酶基因被缺失、破坏或以其他方式使其无功能。 在某些实施方案中，使用发酵木糖的重组酵母菌株，所述菌株表达木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶，并具有降低的KTO13或KTO13直系同源物表达。见例如美国专利
发明者哈尔·S·阿尔珀, 杰拉尔德·芬克, 格里戈里·斯特凡诺普洛斯 申请人:麻省理工学院;怀特黑德生物医学研究院