一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法与流程

本发明涉及一种病毒培养用的体外模型，具体地，涉及一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法。

背景技术：

在病毒学的发展史中，常利用易感动物如家兔、小白鼠、豚鼠等对目的病毒进行实验。动物模型可以观察病毒对机体的侵害，造成病理变化的部位，但动物个体差异大，价格昂贵，还需要特殊的动物房，因此推广起来成本巨大。随着科学的发展，也出现了很多体外培养病毒的模型，但常规的细胞培养技术模型往往并不能反应病毒在体内的致病过程。

技术实现要素：

发明目的：为了克服以上不足，本发明提供了一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，运用三维培养技术，既能避免动物体内实验带来的高成本，又能最大程度的模拟动物体内生长模式，使所培养的细胞呈现立体生长方式，形成类似体内的组织结构，进而有助于模拟病毒体内的致病过程，该模型方法简便，成本低廉，推广方便。

技术方案：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，包括以下操作步骤：

（1）微载体混悬液的准备：称取1-3份的微载体，置于玻璃容器内，按照微载体1份：50ml磷酸盐缓冲液的比例加入磷酸盐缓冲液，混匀1-3h，然后再用新鲜的清洗液洗涤2-3次，再按照微载体1份：50ml磷酸盐缓冲液的比例加入新鲜的磷酸盐缓冲液，高压灭菌，冷却后4℃保存；

（2）细胞贴壁阻滞剂制备：按照2.5%的浓度制备，称取细胞贴壁阻滞剂粉末，加入无水乙醇，密封后混匀10-30分钟，4℃保存；

（3）准备6孔板，将制备好的细胞贴壁阻滞剂均匀铺在6孔板里，静置风干，再将制备好的细胞以10⁵/ml的浓度接种于6孔板中，所述培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖80-90份、碳酸氢钠10-20份、丙酮酸钠8-18份、脂肪酸白蛋白4-16份、氯化钾30-50份、无水硫酸镁5-12份、氯化钠60-80份、无水磷酸二氢钠8-16份、叶酸0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、烟酰胺0.2-0.8份、无水氯化钙20-40份、硝酸铁0.1-0.5份、丁二酸5-10份、丁二酸钠9-18份、d-泛酸钙0.2-0.8份、n-异丙基甲基丙烯酰胺0.2-0.8份、酒石酸胆碱0.5-1份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.1-0.5份、盐酸吡哆辛0.1-0.6份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.2-1份、乙酸酯1-3份、生物素0.5-0.8份、硫辛酸0.2-0.8份、酚红钠0.8-1.5份和去离子水100份；

再加入制备好的微载体混悬液，细胞液与微载体混悬液比例为4:1，混匀后，放置于细胞培养箱内，3-4天等细胞三维结构成型后，即可进行病毒接种实验。

该模型的建立既能避免动物体内实验带来的高成本，又能最大程度的模拟动物体内生长模式，使所培养的细胞呈现立体生长方式，形成类似体内的组织结构，进而有助于模拟病毒体内的致病过程，该模型方法简便，成本低廉，推广方便。

进一步的，上述的一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，其所述微载体为cytodex3。与cytodex1/2相比，该种微载体实用性更广，适合更多类型的细胞接种，便于多种疾病模型的建立。

进一步的，上述的一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，其所述细胞贴壁阻滞剂为poly-hema。该阻滞剂可以有效的阻止细胞贴附在培养板底部，进而促进三维培养模型的顺利建立。

进一步的，上述的一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，其所述高压灭菌时的温度为120℃-140℃，灭菌时间30-50分钟。

进一步的，上述的一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，所述清洗液包括如下组份：按重量组份计，

氯化钠：50-80份

氯化钾：2-5份

磷酸氢二钠：10-15份

磷酸二氢钾：1-5份

氯化镁：8-10份

葡萄糖：5-10份

去离子水：40-50份。

进一步的，上述的一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，其所述磷酸盐缓冲液的制备方法包括如下步骤，

（1）精确称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸氢二钠13.96g，磷酸二氢钾2g，放入同一玻璃容器中；

（2）向上述玻璃容器中加去离子水至800ml，搅拌30分钟使盐溶解；

（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸盐缓冲液，临用时稀释10倍，调整ph=7.3。

进一步的，上述的一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，其所述的玻璃容器，为清洁干净并灭菌后的带盖玻璃瓶。

各种配方组成组分合理，操作步骤简便易行，并且生产成本低，适合推广。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所述的一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法既能避免动物体内实验带来的高成本，又能最大程度的模拟动物体内生长模式，使所培养的细胞呈现立体生长方式，形成类似体内的组织结构，进而有助于模拟病毒体内的致病过程，该模型方法简便，成本低廉，推广方便。

附图说明

图1为本发明所述的一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法示意图。

具体实施方式

下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。

实施例1

本发明提供了一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，包括以下操作步骤：

（1）微载体混悬液的准备：称取1份的微载体，置于玻璃容器内，加入50ml磷酸盐缓冲液，混匀1h，然后再用新鲜的清洗液洗涤2次，所述清洗液包括如下组份：按重量组份计，氯化钠：50份、氯化钾：2份、磷酸氢二钠：10份、磷酸二氢钾：1份、氯化镁：8份、葡萄糖：5份和去离子水：40份。再加入50ml新鲜的磷酸盐缓冲液，120℃高压灭菌30分钟，冷却后4℃保存；

（2）细胞贴壁阻滞剂制备：按照2.5%的浓度制备，称取细胞贴壁阻滞剂粉末，加入无水乙醇，密封后混匀10分钟，4℃保存；

（3）准备6孔板，将制备好的细胞贴壁阻滞剂均匀铺在6孔板里，静置风干，再将制备好的细胞以10⁵/ml的浓度接种于6孔板中，所述培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖80份、碳酸氢钠10份、丙酮酸钠8份、脂肪酸白蛋白4份、氯化钾30份、无水硫酸镁5份、氯化钠60份、无水磷酸二氢钠8份、叶酸0.2份、肌醇0.5份、烟酰胺0.2份、无水氯化钙20份、硝酸铁0.1份、丁二酸5份、丁二酸钠9份、d-泛酸钙0.2份、n-异丙基甲基丙烯酰胺0.2份、酒石酸胆碱0.5份、核黄素0.1份、盐酸硫胺0.1份、盐酸吡哆辛0.1份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.2份、乙酸酯1份、生物素0.5份、硫辛酸0.2份、酚红钠0.8份和去离子水100份；

再加入制备好的微载体混悬液，细胞液与微载体混悬液比例为4:1，混匀后，放置于细胞培养箱内，3天等细胞三维结构成型后，即可进行病毒接种实验。

其中，所述磷酸盐缓冲液的制备方法包括如下步骤，

（1）精确称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸氢二钠13.96g，磷酸二氢钾2g，放入同一玻璃容器中；

（2）向上述玻璃容器中加去离子水至800ml，搅拌30分钟使盐溶解；

（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸盐缓冲液，临用时稀释10倍，调整ph=7.3。

实施例2

本发明提供了一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，包括以下操作步骤：

（1）微载体混悬液的准备：称取2份的微载体，置于玻璃容器内，加入100ml磷酸盐缓冲液，混匀2h，然后再用新鲜的清洗液洗涤2次，其所述清洗液包括如下组份：按重量组份计，氯化钠：60份、氯化钾：3份、磷酸氢二钠：12份、磷酸二氢钾：3份、氯化镁：9份、葡萄糖：6份和去离子水：40份。再加入100ml新鲜的磷酸盐缓冲液，120℃高压灭菌，冷却后4℃保存；

（2）细胞贴壁阻滞剂制备：按照2.5%的浓度制备，称取细胞贴壁阻滞剂粉末，加入无水乙醇，密封后混匀15分钟35分钟，4℃保存；

（3）准备6孔板，将制备好的细胞贴壁阻滞剂均匀铺在6孔板里，静置风干，再将制备好的细胞以10⁵/ml的浓度接种于6孔板中，所述培养基包括90%的基础培养基以及10%的胎牛血清，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖90份、碳酸氢钠20份、丙酮酸钠18份、脂肪酸白蛋白16份、氯化钾50份、无水硫酸镁12份、氯化钠80份、无水磷酸二氢钠16份、叶酸0.6份、肌醇1.5份、烟酰胺0.8份、无水氯化钙40份、硝酸铁0.5份、丁二酸10份、丁二酸钠18份、d-泛酸钙0.8份、n-异丙基甲基丙烯酰胺0.8份、酒石酸胆碱1份、核黄素0.3份、盐酸硫胺0.5份、盐酸吡哆辛0.6份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽1份、乙酸酯3份、生物素0.8份、硫辛酸0.8份、酚红钠1.5份和去离子水100份；

再加入制备好的微载体混悬液，细胞液与微载体混悬液比例为4:1，混匀后，放置于细胞培养箱内，3天等细胞三维结构成型后，即可进行病毒接种实验。

其中，所述磷酸盐缓冲液的制备方法包括如下步骤，

（1）精确称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸氢二钠13.96g，磷酸二氢钾2g，放入同一玻璃容器中；

（2）向上述玻璃容器中加去离子水至800ml，搅拌30分钟使盐溶解；

（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸盐缓冲液，临用时稀释10倍，调整ph=7.3。

实施例3

本发明提供了一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，包括以下操作步骤：

（1）微载体混悬液的准备：称取2份的微载体，置于玻璃容器内，加入100ml磷酸盐缓冲液，混匀2h，然后再用新鲜的清洗液洗涤3次，所述清洗液包括如下组份：按重量组份计，氯化钠：70份、氯化钾：4份、磷酸氢二钠：12份、磷酸二氢钾：4份、氯化镁：9份、葡萄糖：8份和去离子水：50份。再加入100ml新鲜的磷酸盐缓冲液，140℃高压灭菌40分钟，冷却后4℃保存；

（2）细胞贴壁阻滞剂制备：按照2.5%的浓度制备，称取细胞贴壁阻滞剂粉末，加入无水乙醇，密封后混匀20分钟，4℃保存；

（3）准备6孔板，将制备好的细胞贴壁阻滞剂均匀铺在6孔板里，静置风干，再将制备好的细胞以10⁵/ml的浓度接种于6孔板中，所述培养基包括80%的基础培养基以及20%的胎牛血清，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖86份、碳酸氢钠18份、丙酮酸钠12份、脂肪酸白蛋白9份、氯化钾40份、无水硫酸镁8份、氯化钠75份、无水磷酸二氢钠12份、叶酸0.4份、肌醇1份、烟酰胺0.5份、无水氯化钙30份、硝酸铁0.3份、丁二酸7份、丁二酸钠14份、d-泛酸钙0.5份、n-异丙基甲基丙烯酰胺0.5份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.3份、盐酸吡哆辛0.4份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.6份、乙酸酯1.8份、生物素0.7份、硫辛酸0.6份、酚红钠1.2份和去离子水100份；再加入制备好的微载体混悬液，细胞液与微载体混悬液比例为4:1，混匀后，放置于细胞培养箱内，4天等细胞三维结构成型后，即可进行病毒接种实验。

其中，所述磷酸盐缓冲液的制备方法包括如下步骤，

（1）精确称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸氢二钠13.96g，磷酸二氢钾2g，放入同一玻璃容器中；

（2）向上述玻璃容器中加去离子水至800ml，搅拌30分钟使盐溶解；

（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸盐缓冲液，临用时稀释10倍，调整ph=7.3。

实施例4

本发明提供了一种便捷的病毒体外三维培养模型的建立方法，包括以下操作步骤：

（1）微载体混悬液的准备：称取3份的微载体，置于玻璃容器内，加入150ml磷酸盐缓冲液，混匀3h，然后再用新鲜的清洗液洗涤3次，所述清洗液包括如下组份：按重量组份计，氯化钠：80份、氯化钾：5份、磷酸氢二钠：15份、磷酸二氢钾：5份、氯化镁：10份、葡萄糖：10份和去离子水：50份。再加入150ml新鲜的磷酸盐缓冲液，140℃高压灭菌50分钟，冷却后4℃保存；

（2）细胞贴壁阻滞剂制备：按照2.5%的浓度制备，称取细胞贴壁阻滞剂粉末，加入无水乙醇，密封后混匀30分钟，4℃保存；

（3）准备6孔板，将制备好的细胞贴壁阻滞剂均匀铺在6孔板里，静置风干，再将制备好的细胞以10⁵/ml的浓度接种于6孔板中，所述培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖82份、碳酸氢钠25份、丙酮酸钠10份、脂肪酸白蛋白8份、氯化钾38份、无水硫酸镁8份、氯化钠70份、无水磷酸二氢钠10份、叶酸0.5份、肌醇1.2份、烟酰胺0.5份、无水氯化钙30份、硝酸铁0.4份、丁二酸6份、丁二酸钠12份、d-泛酸钙0.6份、n-异丙基甲基丙烯酰胺0.5份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.4份、盐酸吡哆辛0.3份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.8份、乙酸酯1.8份、生物素0.6份、硫辛酸0.7份、酚红钠1份和去离子水100份；再加入制备好的微载体混悬液，细胞液与微载体混悬液比例为4:1，混匀后，放置于细胞培养箱内，4天等细胞三维结构成型后，即可进行病毒接种实验。

其中，所述磷酸盐缓冲液的制备方法包括如下步骤，

（1）精确称取氯化钠80g，氯化钾2g，磷酸氢二钠13.96g，磷酸二氢钾2g，放入同一玻璃容器中；

（2）向上述玻璃容器中加去离子水至800ml，搅拌30分钟使盐溶解；

（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸盐缓冲液，临用时稀释10倍，调整ph=7.3。

以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。