一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法与流程

本发明涉及一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：乳酸菌由于其独特的生理特性被广泛的应用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业中。酸胁迫作为乳酸菌生产应用中面临的最广泛存在的一种环境胁迫，严重影响了乳酸菌生理功能的发挥。因此提高乳酸菌的酸胁迫耐受性对于其在发酵生产中的应用有着重要的意义。二氢硫辛酰胺脱氢酶是一种黄素蛋白，其作用是将二氢硫辛酰胺脱氢转化为氧化型硫辛酰胺，属于氧化还原酶类，提供一些硫族基团，供nad+和nadp+接受，从而在生物的能量代谢中起重要作用。国内外对二氢硫辛酰胺脱氢酶进行了大量的研究，其中研究最多的原核生物为大肠杆菌，而真核生物主要是酵母、猪以及人类。随着研究的深入，研究者不断发现二氢硫辛酰胺脱氢酶在病原体的致病性以及耐药性方面起着重要的作用，同时其还具有较强的免疫原性。技术实现要素：本发明的目的是提供一种提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性的方法。本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达dldh蛋白，实现了乳酸乳球菌酸胁迫抗性的提高。本发明解决的第一个问题是提供了一株酸胁迫抗性提高的重组乳酸乳球菌，这株重组菌过量表达二氢硫辛酰胺脱氢酶dldh。所述dldh的氨基酸序列是seqidno.1所示的序列。所述dldh的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，是seqidno.2所示的序列。所述dldh的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，来源于乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000。所述重组菌，在本发明的一种实施方式中，以乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000为宿主。本发明解决的第二个问题是提供了一种所述重组菌的构建方法。是将编码seqidno.1所示氨基酸序列的dldh基因连接到表达质粒上获得重组质粒，再分别转化到宿主菌中获得重组菌。所述表达质粒为pnz8148。所述宿主菌，在本发明的一种实施方式中是lactococcuslactisnz9000。所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将seqidno.1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pnz8148上，获得重组质粒pnz8148-dldh，再将重组质粒转化到宿主菌lactococcuslactisnz9000中，得到重组菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)。本发明的第三个目的是提供一种提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性的方法，是在乳酸乳球菌中过量表达二氢硫辛酰胺脱氢酶dldh。所述方法，在本发明的一种实施方式中，dldh的氨基酸序列是seqidno.1所示的序列。所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将seqidno.2所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pnz8148上，获得重组质粒pnz8148-dldh，再将重组质粒转化到宿主菌lactococcuslactisnz9000中，得到重组菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)，诱导表达dldh。本发明的有益效果：通过在乳酸乳球菌中过量表达dldh蛋白，得到了一株酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)。在酸胁迫条件下，ph4.0胁迫3.5h后，重组菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)的存活率为对照的7.3倍。附图说明图1：重组质粒pnz8148-dldh的结构图；图2：重组菌株和对照菌株的生长曲线；图3：ph4.0条件下重组菌株与对照菌株的存活率对比。具体实施方式实施例1重组菌株的构建从ncbi数据库lactococcuslactisnz9000的基因组中得到如seqidno.2所示的dldh的基因序列，并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒pnz8148上，获得重组质粒pnz8148-dldh，再将其电转入宿主菌l.lactisnz9000中，得到重组菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)。具体如下：根据dldh的基因序列设计分别如seqidno.3、seqidno.4所示的引物dldh-f、dldh-r(表1)，以lactococcuslactisnz9000的基因组为模板，pcr扩增或采用化学合成的方法，获得seqidno.2所示的基因片段。将pcr产物和载体pnz8148分别用xbai和saci双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物转化大肠杆菌mc1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落pcr验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pnz8148-dldh(重组质粒结构如图1所示)。然后从重组mc1061中提取重组质粒，电转化l.lactisnz9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落pcr验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)。电转化条件为：1μl质粒中与40μl的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min。电压2000v，电容25μf，电阻200ω。电击完毕后，立即向电转杯中加入1ml含有20mmmgcl2和2mmcacl2的gm17培养基(培养基配方：m17培养基+0.5％glucose)。然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的gm17平板上，培养36h，挑取转化子验证。表1引物引物序列dldh-fatatatctagaatggttgttggtgcacaagcaacdldh-ratatagagctcttaaacgtgaattggcaagccatc实施例2dldh蛋白的诱导表达与检测诱导重组菌lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)表达dldh蛋白，并用sds-page蛋白电泳检测重组菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)中dldh蛋白的表达情况，发现与dldh蛋白大小相似的条带的量显著增加。具体过程如下：将菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148)(即含有pnz8148空质粒的lactococcuslactisnz9000菌株)和lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)接种于含有10μg/ml氯霉素的gm17(5ml)培养基中，30℃静置培养过夜，以4％的接种量转接至50ml含有10μg/ml氯霉素的gm17培养基中，待生长至od6000.4时加入10ng/ml的nisin(一种乳酸链球菌素)诱导培养8h，收集诱导后的细胞，经50mmtris-hcl缓冲液(ph7.4)离心洗涤两次后重悬于相同的缓冲液中。将菌悬液置于冰上超声破碎15min，离心收集上清液，进行sds-page分析。经sds-page分析，重组菌lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)成功地表达了dldh蛋白。sds-page中，在分子量约为49.87kda处的蛋白质条带显著变厚重，与目标蛋白dldh的分子量基本一致，说明成功地在lactococcuslactisnz9000中表达了dldh蛋白。实施例3过量表达dldh蛋白菌株的生长性能试验对于考察菌株在过量表达dldh蛋白时的生长情况，将菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)和lactococcuslactisnz9000(pnz8148)(对照)接种于加了10μg/ml氯霉素的gm17液体培养基(1ml)中进行活化，于30℃培养箱中静置过夜培养。再以2％的接种量将种子液转接至新鲜的(含10μg/ml氯霉素，ph5.5，乳酸调节)的gm17液体培养基中，30℃静置培养。每隔2h取样，测定600nm波长下的od值。培养至od6000.4时加入10ng/ml的乳酸链球菌素(nisin)诱导表达dldh蛋白。以时间为横坐标，od600值为纵坐标，绘制生长曲线。经生长性能试验分析，重组菌株的生物量相对对照菌株有所提高，约9.53％，说明在lactococcuslactisnz9000中过量表达dldh蛋白可提高菌株的酸胁迫抗性。实施例4酸胁迫条件下耐受性试验对于考察菌株对酸的耐受性分析试验，分别测定了重组菌株和对照菌株在ph4.0条件下的存活率。具体操作方式如下：将菌株诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的ph4.0(乳酸调节)的gm17(含有10μg/ml氯霉素)中，胁迫不同时间。胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μl重悬液，梯度稀释，选合适的梯度点种于gm17氯霉素平板上测定活菌数并计算存活率。经耐受性实验分析，在ph4.0的gm17中胁迫3.5h后，重组菌株lactococcuslactisnz9000(pnz8148-dldh)的存活率为对照的7.3倍，说明重组菌株对酸胁迫的耐受性显著提高。通过实施例3和实施例4结果分析，可知在lactococcuslactisnz9000中过量表达dldh蛋白后，菌株耐酸性能显著提高。说明通过lactococcuslactisnz9000中过量表达dldh蛋白的方法可以提高乳酸乳球菌酸胁迫抗性。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>472<212>prt<213>lactococcuslactisnz9000<400>1metvalvalglyalaglnalathrgluvalaspleuvalvalilegly151015serglyproglyglytyrvalalaalaileargalaalagluleugly202530lyslysvalthrileileglulysaspasnvalglyglyvalcysleu354045asnileglycysileproserlysalaleuileasnileglyhishis505560tyrglngluserleuglugluglulysglygluasnpropheglyleu65707580servalglyasnvallysleuasntrpgluseralaglnlystrplys859095glnasplysvalvalasnglnleuthrglyglyvallysmetleuleu100105110lyslyshislysvalaspvalileglnglythralaglupheileasp115120125asnasnthrileasnvalgluglngluaspglypheglnleuleugln130135140pheasnaspvalileileserthrglyserargproilegluilepro145150155160serphepropheglyglyargileileaspserthrglyalaleuser165170175leuprogluvalprolyshisleuileilevalglyglyglyvalile180185190glysergluleuglyglyalatyrargmetleuglyserlysilethr195200205ilevalgluglyleuasphisileleuasnglypheasplysglumet210215220seraspileilealaasnargvallysseralaglysergluilephe225230235240thrseralametalalysseralathrglnthrasplysaspvalthr245250255leuthrphegluvalaspglylysgluglnthrvalthrgly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