贝莱斯芽孢杆菌JS25R及其应用的制作方法

本发明涉及微生物学和植物病害生防技术领域，具体地说，涉及一株贝莱斯芽孢杆菌js25r及其应用。

背景技术：

禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)是禾本科作物的重要病原菌之一，可引起麦类赤霉病(fusariumheadblight，fhb)，禾谷镰刀菌为限制小麦产量的一个主要因素(dubin,1997)。我国气候条件十分有利于麦类赤霉病的发生，长江中下游地区常年病害造成产量损失10％-15％，大流行年份减产近50％。由于全球气候变暖以及秸秆还田、免耕栽培等耕作制度改变的影响，我国麦类赤霉病的发生区域由长江流域迅速向西北、华北扩展，特别是在2008、2010和2012年，全国麦类赤霉病发生十分严重，造成了严重的产粮损失和不良的社会影响，严重威胁我国粮食安全。

禾谷镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don，3,7,15三羟基-12,13环氧单端孢霉-9烯-8酮)是存在于赤霉病菌感染麦粒中的主要天然毒素之一。don已被认定为最危险的自然发生食品污染物之一，被列入国际研究的优先地位。don可致人免疫力下降、贫血、头痛、腹痛、恶心；致动物拒食、生长延滞和流产(rochaetal.,2005；sobrovaetal.,2010；pestka,2010)。don广泛存在并大量污染小麦及其制品，对人畜构成很大危害，严重威胁我国食品安全。因此，加强禾谷镰刀菌防控研究已成为保障我国粮食安全和食品安全的迫切需求。

多年来对麦类赤霉病防治主要依靠化学农药，但随着化学农药带来的环境问题，加之多年用药已导致病原菌抗药性禾谷镰刀菌菌株的出现，使防治难度加大。虽然在赤霉病抗性品质方面国内外投入大量的精力开展相关研究，但至今尚无理想的高抗小麦品种(李正辉等，2007)。

生物防治不仅可降低对环境的影响，还不易产生抗药性，相关理论和技术的研究日益为人们所关注。贝莱斯芽孢杆菌营养简单，在自然界中广泛存在,对人畜无毒无害,不污染环境,能产生多种抗菌素和酶,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，较其他微生物更具有开发为生物防控菌剂的潜力。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株贝莱斯芽孢杆菌js25r及其在生物防治由镰刀菌引起的植物病害中的应用。

本发明从江苏采集的小麦病穗中分离纯化出对禾谷镰刀菌拮抗能力强的一株菌命名为js25r，根据其菌落和菌体形态特征，生理生化特性以及16srdna序列分析，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。菌株js25r现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmccno.14240，保藏日期2017年6月13日。

本发明还提供所述的贝莱斯芽孢杆菌js25r在生物防治由镰刀菌引起的植物病害中的应用。

本发明所述镰刀菌为禾谷镰刀菌(f.graminearum)。所述病害为赤霉病或穗腐病或根腐病。所述植物为谷物，所述谷物为小麦或玉米，优选小麦。

在本发明的一个具体实施方式中，验证了贝莱斯芽孢杆菌js25r在减轻由禾谷镰刀菌(f.graminearum)j07引起的小麦品种‘石新828’赤霉病病害中的作用。

本发明还提供含有所述贝莱斯芽孢杆菌js25r的微生物菌剂。

本发明还提供所述贝莱斯芽孢杆菌js25r或所述菌剂在制备防治由镰刀菌引起的植物病害的药物中的应用。

本发明还提供一种含有所述贝莱斯芽孢杆菌js25r或所述菌剂的用于防治由镰刀菌引起的植物病害的药物。

所述药物可按如下方法制备得到：

通过常规的液体后固体培养，获得包括细菌菌体培养物，通过常规的液体发酵生产，加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或吸附载体按一定比例混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

本发明还提供所述贝莱斯芽孢杆菌js25r或所述菌剂在制备农用复混肥中的应用。

本发明进一步提供一种农用复混肥，其由含有所述贝莱斯芽孢杆菌js25r的微生物菌剂，与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥组成。

利用本发明的贝莱斯芽孢杆菌s25r防治镰刀菌引起的植物病害的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理。喷雾制剂为该贝莱斯芽孢杆菌的菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的农药制剂。

本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌js25r不仅在平板培养时可高效抑制禾谷镰刀菌，而且在温室实验中其防治效果高达77.4％。作为小麦和玉米赤霉病的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都都具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2中js25r对禾谷镰刀菌的对峙培养实验结果；其中，a为以仅接种禾谷镰刀菌菌盘的pda平板对照组，b为在距pda平板中心25mm处四点划线接种相同体积和浓度的js25r。

图2为本发明实施例4中js25r产生的挥发性气体的抑菌实验结果；其中，a为接种禾谷镰刀菌菌盘的pda平板的对照组，b为在na平板中心接种js25r，倒扣于接有禾谷镰刀菌的平板。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

nb液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为蛋白胨、牛肉膏和nacl，溶剂为水；蛋白胨在nb液体培养基中的浓度为1％，牛肉膏在nb液体培养基中的浓度为0.3％，nacl在nb液体培养基中的浓度为0.5％，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。

na固体培养基：在nb液体培养基中加入琼脂(琼脂与液体培养基的比例为1.5g：100ml)，得到na固体培养基。

pda培养基：马铃薯200g,加入少量水煮20min，三层纱布过滤，取滤液用水定容至1l，加入20g葡萄糖，15g琼脂，121℃高压灭菌20min。

磷酸盐缓冲液：由溶剂和溶质组成；溶质为磷酸二氢钾和氯化镁，溶剂为水；磷酸二氢钾的浓度为0.004％,氯化镁的浓度为0.019％，所述％均为质量体积百分比(g/100ml)。

禾谷镰刀菌(f.graminearum)j07已在文献“王瑶、赵月菊、邢福国、王龑、刘阳.禾谷镰刀菌拮抗菌株的筛选及鉴定.核农学报2017，31(6):1128-1136.”中公开，公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。

小麦石新828品种已在文献“孙志军，杨晓丽，张辉，张广辉.小麦新品种石新828选育过程及高产栽培技术.现代农业科技，2011(09)，96-97.”中公开，公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。

实施例1菌株js25r的分离与鉴定

一、菌的分离

(一)在超净工作台中，将30穗江苏采集(2012年6月)的小麦病穗放在100ml无菌蒸馏水中震荡15分钟制备菌悬液，然后80℃水浴处理10分钟。

(二)将菌悬液用无菌蒸馏水进行浓度梯度稀释后涂布在na培养基平板上，30℃条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于禾谷镰刀菌对峙培养实验。将得到的对禾谷镰刀菌拮抗能力强的一株菌命名为js25r。

二、鉴定

(一)按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)中描述的方法，对菌株js25r进行形态特征、培养特性和生理生化特性鉴定，具体结果如下：

菌体的形态和生理生化特性：

在na培养基，28℃培养1天，菌体杆状，直径约为0.6μm×2.0-2.5μm；菌落奶白色，圆形，微凸，边缘整齐。

生理生化特征：

氧化酶：+；精氨酸双水解酶：-；明胶水解：+；淀粉水解：+；过氧化氢酶：+；三丁酸甘油脂水解：+；硝酸盐还原：+；七叶灵水解：+；酪素水解：+；tween80水解：-；吲哚实验：-；脲酶：-；柠檬酸利用：+；h2s生成：-；vp实验：+；厌氧生长：-；4％nacl：-；ph4.0：+；50℃：-；20℃：+。

可利用甘油、d-阿拉伯糖、l-阿拉伯糖、d-核糖、d-木糖、l-木糖、阿东醇、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-果糖、d-甘露糖、l-鼠李糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-d-葡萄糖苷、n-乙酰葡糖胺、七叶灵、水杨苷、d-纤维二糖、d-麦芽糖、d-乳糖、d-蜜二糖、d-蔗糖、d-棉籽糖、淀粉、糖原、d-来苏糖、d-塔格糖、d-岩藻糖和l-岩藻糖产酸。

(二)16srdna序列测定

提取js25r的总dna，以其为模板，利用细菌16srdna通用引物进行pcr扩增，得到长度约为1.4kb的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序，测得的序列如seqidno.1所示。

根据genbank序列同源性比较，菌株js25r与bacillusmethylotrophicusstrainlk6(genbank登录号kc790234.1)同源性为99％，与bacillussp.ap-1(2015)(genbank登录号km974803.1)同源性为99％，初步判定该菌为芽孢杆菌属细菌(bacillussp.)。

基于以上特征，将菌株js25r鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌js25r对禾谷镰刀菌的拮抗作用

采用对峙培养法检测贝莱斯芽孢杆菌js25r对禾谷镰刀菌的拮抗。

一、用直径为5mm的打孔器在培养好的病原真菌禾谷镰刀菌(f.graminearum)j07菌落边缘打取菌盘，用灭菌的牙签将菌盘挑入pda平板中心。

二、在距pda平板中心25mm处四点划线接种相同体积和浓度的js25r，以仅接种禾谷镰刀菌菌盘的pda平板为对照组，28℃培养4-5天，观察有无抑菌带形成。每个组做三个平行。结果如表1和图1所示：

表1培养5天后js25r对禾谷镰刀菌的抑制作用

如图1和表1可知，贝莱斯芽孢杆菌js25r对禾谷镰刀菌有很强的抑制效果。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌js25r发酵液对禾谷镰刀菌的抑制效果

采用对峙培养法检测贝莱斯芽孢杆菌js25r对禾谷镰刀菌的拮抗。

一、用直径为5mm的打孔器在培养好的病原真菌禾谷镰刀菌(f.graminearum)j07菌落边缘打取菌盘，用灭菌的牙签将菌盘挑入pda平板中心。

二、在距pda平板中心25mm处四点打孔接种相同体积和浓度的js25r，以仅接种禾谷镰刀菌菌盘的pda平板为对照组，28℃培养4-5天，观察有无抑菌带形成。每个组做三个平行。结果如表2所示，表明js25r对禾谷镰刀菌有很强的抑制效果。

表2培养5天后js25r对禾谷镰刀菌的抑制作用

实施例4贝莱斯芽孢杆菌js25r挥发性气体对禾谷镰刀菌的抑制效果

采用对峙培养法检测贝莱斯芽孢杆菌js25r产生的挥发性气体对禾谷镰刀菌的拮抗。

一、用直径为5mm的打孔器在培养好的病原真菌禾谷镰刀菌(f.graminearum)j07菌落边缘打取菌盘，用灭菌的牙签将菌盘挑入pda平板中心。

二、在na平板中心接种js25r，倒扣于接有禾谷镰刀菌的平板，以仅接种禾谷镰刀菌菌盘的pda平板为对照组，28℃培养4-5天，观察有无抑菌效果。每个组做三个平行。结果如图2所示。表明js25r可产生抑制禾谷镰刀菌的挥发性气体。

进一步对挥发性气体的成分进行了分析，gc-ms检测结果显示，共检测到36种物质(表3)。

表3通过gc-ms分析鉴定js25r的vocs

实施例5贝莱斯芽孢杆菌js25r对禾谷镰刀菌抑制效果的温室实验

一、将js25r在nb培养基中28℃振荡过夜培养，采用磷酸盐缓冲液稀释至浓度为2×10⁸cfu/ml。

二、将禾谷镰刀菌j07用绿豆汤培养基振荡培养(28℃，5天)，得到菌悬液，采用磷酸盐缓冲液稀释菌液浓度为2×10⁵cfu/ml。

三、将稀释后的js25r与禾谷镰刀菌j07按照1:1的体积比混合，终浓度分别为10⁸cfu/ml和10⁵cfu/ml。

四、在石新828品种的扬花早期进行麦穗中部接种，接菌体积为10μl，作为实验组。同时以仅含有禾谷镰刀菌的磷酸盐缓冲液作为阳性对照组，以仅接种磷酸缓冲液的作为阴性对照。每组设10个重复，实验重复3次，结果取平均值。

禾谷镰刀菌菌悬液接种16天后，观察麦穗的发病，有麦穗干枯发白或发红，内部籽粒不饱满、重量减轻表现的麦穗为发病麦穗。其中赤霉病指数＝发病率×发病指数/100。

表4js25r对禾谷镰刀菌的田间防治效果

结果如表4所示，贝莱斯芽孢杆菌js25r在温室条件下能很好防治禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

1.dubinhj.fusariumheadscab:globalstatusandfutureprospects:proceedingsofaworkshopheldatcimmyt,elbatan,mexico,13-17october,1996.cimmyt；1997.

2.rochao,ansarik,doohanfm.effectsoftrichothecenemycotoxinsoneukaryoticcells:areview.foodadditivesandcontaminants:parta:chemistry,analysis,control,exposureandriskassessment,2005,22:369-378.

3.sobrovap,adamv,vasatkovaa,beklovam,zemanl,kizekr.deoxynivalenolanditstoxicity.interdisciplinarytoxicology,2010,3:94–99.

4.pestkajj.deoxynivalenol:mechanismsofaction,humanexposure,andtoxicologicalrelevance.archivesoftoxicology,2010,84:663-679.

5.李正辉,向晶晶,陈婧鸿,葛翠风,葛绍荣.小麦赤霉病拮抗菌的分离与鉴定.麦类作物学报,2007:149-152.

6.王瑶、赵月菊、邢福国、王龑、刘阳.禾谷镰刀菌拮抗菌株的筛选及鉴定.核农学报2017，31(6):1128-1136.

序列表

<110>中国农业科学院农产品加工研究所

<120>贝莱斯芽孢杆菌js25r及其应用

<130>khp171113873.2

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1448

<212>贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)

<213>人工序列

<400>1

taattcggcggctataatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagc60

ggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaa120

ccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcg180

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