本发明涉及组织细胞培养技术领域，具体涉及一种人脂肪干细胞冻存液及其制备方法和应用。
背景技术：
脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，adscs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有可迅速扩增、不易衰老等一般干细胞的特点。人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。adscs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示g0/g1期的细胞占69％，s期占24％，g2/m期占8％。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖i倍。多次传代(10-20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15％。
由于人脂肪间充质干细胞分离培养周期较长，原代细胞铺满的时间约2周以上，达到一定的数量需要3周左右。人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失去其多向分化的潜能。所以为保证实验的连续性，必须随时提供大量的实验或组织工程用的种子细胞。因此，对于细胞的需求非常强烈。现在，将生产好的细胞进行冷冻保存，使用时再几种解冻使用也是常规的使用模式。然而现有技术中干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。低温保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚砜(dmso)和血清的保护。常用到的细胞保护剂还有羟乙基淀粉0es)、聚乙二醇(peg)等。但是，dmso会对细胞产生毒性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的神经干细胞，开展有效的神经干细胞冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种长期低温保存人脂肪干细胞的方法对于促进人脂肪干细胞的研宄和应用具有重大意义。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种人脂肪干细胞冷冻保存液以及相应的制备方法及使用方法。
红果黄肉楠是一种小乔木，申请人经过研究发现，该植物中具有能够耐寒冷的物质存在，因此，申请人通过高通量筛选获得了相应的具有耐寒的多肽，因此，申请人尝试将其加入到冷冻保存液中，用于保存细胞。
本发明的技术方案如下：
一种人脂肪干细胞冷冻保存液，其特征在于由如下各组分组成：其特征是冷冻存液中含有:0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1-32任一所示。所述多肽有申请人通过前期的大量的基因库筛选得到，所述多肽具有保护细胞免受损伤的功能。其名称分别为kats-1、kats-2、kats-3、kats-4、kats-5、kats-6、kats-7、kats-8、kats-9、kats-10、kats-11、kats-12、kats-13、kats-14、kats-15、kats-16、kats-17、kats-18、kats-19、kats-20、kats-21、kats-22、kats-23、kats-24、kats-25、kats-26、kats-27、kats-28、kats-29、kats-30、kats-31、kats-32，其依次对应于seqidno：1-32。
在本发明的细胞的冻存液中，海藻糖以及维生素e和多肽具有明确的抵御外来伤害对细胞的损伤，特别是多肽，还具有保护细胞免受冻存时冰结晶对细胞的损伤。
本发明还提供了一种人脂肪干细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。
本发明还提供了一种人脂肪干细胞冻存方法，包括以下步骤:
a.冻存液制备:制备所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法将各组分按照相应的比例混合即可获得；
b.细胞悬液制备:培养生长成单层的人脂肪细胞一瓶，0.20％胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入dmem培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入步骤a冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
c.冷冻:先将冻存管在4℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存lh，再放入-80℃冻存3h，最后移入液氮中保存；
d.细胞复苏:取出冻存管快速置于37℃水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5倍dmem液稀释，1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次。所述细胞悬浮浓度为108细胞/ml-1010细胞/ml。
本发明的有益效果:
本发明的人脂肪干细胞冻存液，复苏细胞存活率可达97％以上，较使用常规细胞冻存液的复苏存活率有了显著提高，基本上没有细胞的损耗。
本发明的干细胞冻存液可以长期保存干细胞，细胞活性不发生变化，保证了细胞生物学活性。
本发明神经细胞冻存方法，操作简单可行，价格适宜，具有较好的实用价值。
具体实施方式
实施例1多肽的制备
取红果黄肉楠叶片5g，清洗干净，绞碎，榨汁，加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，加酶量8000iu/g叶片，酶解温度47℃，ph值7.5，酶解时间1.5h，酶解完成后90℃灭酶10min；灭酶后的物料过滤除去不溶物，得到溶液，所得多肽溶液加入4％活性炭吸附脱色，用葡聚糖g-50(sephadexg-50)进行多肽分离，20mmol/lhcl溶液洗脱，流速1.3ml/分钟，分别收集不同时间段的洗脱产物，调节溶液至ph7.0，10000转/分钟离心15分钟，经大孔树脂da201-c脱盐处理后，真空浓缩，上清液冷冻干燥备用；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，回收小分子量的条带，其中经过功能验证，共得到32个小肽的序列具有稳定人脂肪干细胞，促进干细胞生长，保持干细胞正常生长状态的功效。根据色谱柱中不同的峰值分离时间，可以批量获得相应的小肽，也可人工合成所述的多肽。所述多肽的序列如seqidno：1-32所示。分别命名为kats-1～32。
实施例2人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：1所示。
实施例3人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：2所示。
实施例4人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：3所示。
实施例5人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：4所示。
实施例6人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：5所示。
实施例7人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：6所示。
实施例8人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：7所示。
实施例9人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：8所示。
实施例10人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：9所示。
实施例11人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：10所示。
实施例12人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：11所示。
实施例13人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：12所示。
实施例14人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：13所示。
实施例15人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：14所示。
实施例16人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：15所示。
实施例17人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：16所示。
实施例18人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：17所示。
实施例19人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：18所示。
实施例20人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：19所示。
实施例21人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：20所示。
实施例22人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：21所示。
实施例23人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：22所示。
实施例24人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：23所示。
实施例25人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：24所示。
实施例26人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：25所示。
实施例27人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：26所示。
实施例28人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：27所示。
实施例29人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：28所示。
实施例30人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：29所示。
实施例31人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：30所示。
实施例32人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：31所示。
实施例33人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：32所示。
实施例34人脂肪干细胞冻存液的制备
将0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培养基定容至100ml。
实施例35比较例
以cn102550542b中授权的无血清冻存液作为对照冻存液。
实施例36冻存液的效果验证
以上实施例2-34及比较例所制备的细胞冻存液，分别按照下述方法进行细胞冻存和复苏实验。
细胞冻存过程:
培养生长成单层的人脂肪干细胞，其细胞密度约6*109个/ml，加入ph7.0的pbs洗细胞表面一次。
将细胞用0.20％胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入dmem培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入实施例1-33和比较例1所制备的冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
冷冻:先将冻存管在4℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存lh，再放入-80℃冻存3h，最后移入液氮中保存；分别冻存1周，4个月，8个月。每组3个重复。
细胞复苏:取出冻存管快速置于37℃水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5倍dmem液稀释，1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次，计算细胞存活率。结果如下：
由以上结果可以看出，本发明的冻存液，特别适合于人脂肪干细胞的冻存培养，具有较好的细胞保护活性。
实施例37干细胞抗原检测
脂肪干细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有3、13、d29、34、45、cd49e、cd59、cd73、cd90、cd105、hla-abc等。
取实施例36冻存4个月的脂肪干细胞，去掉培养液，用1:1的2.5％的胰蛋白酶溶液和0.0296edta溶液混合消化，用含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs洗涤后制成每100ul含有1*1o6个单细胞悬液，等分为7份，分别加入7个eppendorf管中并编号，一号管加入共20μl的fitcmouseiggl、apc_cy7mouseigg2b和染色缓冲液用于检测由于抗体非特异性结合产生的背景作为对照，其他试管分别加入cd29、cd34、44、45、105、hla.dr单克隆抗体各20μl，每管分别加入细胞悬液100μl(含1*106个细胞)，室温孵育25min，用含1％bsa的pbs洗涤后，流式细胞仪检测。分析结果:流式细胞仪分析人脂肪干细胞六种表面抗原29，34，44，cd45，cd105和hla.dr,结果表明使用实施例2-34培养基培养出的细胞具有人脂肪干细胞特性。hla.dr阴性，排除该类细胞是成纤维细胞。
实施例38成脂诱导及检测
由于脂肪干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下对脂肪干细胞进行分化诱导，能够得到特定功能的已分化的细胞。
取实施例36冻存4个月的脂肪干细胞，向培养液中加入地塞米松，使用通用的方法对脂肪干细胞进行成脂诱导。通过培养发现，所有的冻存的干细胞均可以向脂肪细胞分化，并且基本上全部都分化为脂肪细胞，具有较高的活性。这充分说明，冻存后的脂肪干细胞仍然保留原始的细胞活性。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明造构思的前提下，还可以做出若干改变和改进，这些都属于发明的保护范围。
序列表
〈110〉李倩
〈120〉一种人脂肪干细胞用的细胞冻存液
〈160〉32
〈210〉1
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-1
lmshcqmhephcpaigvw
〈210〉2
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-2
isrwetriengvfhnpgy
〈210〉3
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-3
yceqqnhrtcdavgkliq
〈210〉4
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-4
gwmmcidpimpgmqamqk
〈210〉5
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-5
prrsmryrrlawsqslpf
〈210〉6
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-6
qdsrifrkwiqgqsyyqf
〈210〉7
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-7
gdilrpknfyrwskadvg
〈210〉8
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-8
fqhcnyqyemslwaeqcy
〈210〉9
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-9
rkttkrkckggeqgrqa
〈210〉10
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-10
vlydnrpwqsarqser
〈210〉11
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-11
disygnrrsggfksega
〈210〉12
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-12
cdigrgpascditvqi
〈210〉13
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-13
pwsitpimcrrgrrifs
〈210〉14
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-14
rhwampnqcrqcyhnf
〈210〉15
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-15
amqdkaesflldlkssew
〈210〉16
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-16
irtwrlcgcnirhmfig
〈210〉17
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-17
rvtqniwnwqltilqc
〈210〉18
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-18
emfkvkndvtwysyqwgs
〈210〉19
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-19
qfqhlgwqvdrnmrekd
〈210〉20
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-20
rmnaqledkltflmie
〈210〉21
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-21
kgsrpwrpfqgpmrdid
〈210〉22
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-22
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〈210〉23
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