一种猪胰岛细胞冻存液及冻存方法与流程

本发明涉及细胞的冻存领域，属于生物
技术领域：
，尤其涉及猪胰岛细胞的冻存液和冻存方法。
背景技术：
：糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷或者胰岛素功能障碍导致的代谢性疾病。糖尿病容易引起长期代谢紊乱，使全身组织器官尤其使是眼、肾、心血管及神经系统造成功能障碍和衰竭。严重者引起失水，电解质紊乱和酸碱平衡失调等急性并发症酮症酸中毒和高渗昏迷。注射胰岛素是目前控制糖尿患者血糖的有效手段，但是外源性胰岛素不能达到生理性调节血糖的作用，因此糖尿病并发症难以得到改善，从而大大降低患者的生活质量，最终导致死亡。研究发现明胰岛细胞移植可以使糖尿病慢性并发症延缓6年以上，这对于提高糖尿病患者的生活质量非常重要。因此，胰岛细胞移植治疗糖尿病如同肾移植治疗终末期肾功能衰竭一样，将成为糖尿病的最有效治疗手段。近年来随着胰岛细胞移植技术的日趋成熟和临床应用的发展，猪胰岛细胞异种移植有望成为治疗糖尿病的有效方法之一。猪胰岛的移植的实施过程中的关键之一就是获得足够量的猪胰岛细胞，而猪胰岛细胞分离、消化、纯化过程是一个十分复杂的、技术性强的过程，往往需要10多头新生猪才能满足一个病人的使用。满足猪胰岛细胞移植往往需要大量细胞，临时提取纯化猪胰岛细胞显然无法满足猪胰岛移植的应用和推广。因此，猪胰岛细胞的冻存尤为重要，影响到猪胰岛细胞移植的技术的应用和推广。常规的细胞冻存保存剂为dmso10％+fbs10-20％+细胞培养液(主要有dmem,prim1640等)，它主要是适用于单细胞悬液的冻存保护剂。但胰岛细胞不同于普通的细胞，它是由β、α、γ、θ等细胞组成的细胞团，共同发挥调节血糖水平的作用。用常规单细胞悬液的冻存液并不能有效的保护胰岛细胞团，冻存的胰岛细胞团活率极低，并且无法进行长期保存。因此用于临床移植的猪胰岛细胞团冻存液配方需要改良成适合临床使用的配方。针对上述问题，本发明提供了一种用于大规模有效地冻存胰岛细胞团的冻存液及其冻存方法，避免其受冷冻损伤，以提供临床应用的胰岛细胞团。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于针对上述现有技术存在的问题，提供一种猪胰岛细胞的冻存液及其冻存方法，为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种猪胰岛细胞冻存液，包括以下质量百分比的组分：基础培养基20-40％，猪血清为40-50％，dmso为7～9％，其余为保护因子；所述的保护因子及其浓度分别为过氧化氢酶100～200μg/ml，生育酚10～50μg/ml，海藻糖0.01～0.1mml/l，细胞凋亡抑制剂z-vad-fmk10～30μμ。所述的猪胰岛细胞冻存液优选：基础培养基40％，猪血清为50％，dmso为7～9％，其余为保护因子；所述的保护因子及其浓度分别为过氧化氢酶100～200μg/ml，生育酚10～50μg/ml，海藻糖0.01～0.1mml/l，细胞凋亡抑制剂z-vad-fmk10～30μμ。所述的猪胰岛细胞冻存液，氧化氢酶优选浓度为150μg/ml，生育酚优选浓度为20μg/ml，海藻糖优选浓度为0.05mml/l，细胞凋亡抑制剂z-vad-fmk优选浓度为20μμ。使用所述的猪胰岛细胞冻存液的冻存方法，细胞冻存悬液中冻存密度为1×104-1×105ieq/ml。所述的冻存方法：三个降温经历的温度区间及其降温速度：降至温度>-25℃，1℃/min的降温速度；降至-25℃≥温度≥-40℃，0.25℃/min的降温速度；降至-40℃＞温度≥-80℃，5℃/min的降温速度。当温度降到-80℃时，将细胞放置到液氮中长期保存。本发明的优势：胰岛细胞是细胞团样结构，用常规的单细胞冻存保护液冻存胰岛细胞团，大部分胰岛细胞容易在冻存过程凋亡坏死。本发明冻存液添加了1、过氧化氢酶可以减轻低温引起的细胞凋亡。2、生育酚减少氧化应激引起的细胞损伤。3、海藻糖是一种非渗透性保护剂，冻存过程中减少胞内结晶，复苏时减轻渗透压改变引起的细胞肿胀，具有膜稳定的作用，提高复温后活率。4、细胞凋亡抑制剂z-vad-fmk，纯度>95％，具有抑制细胞凋亡的作用。本发明方法在-25℃≥温度≥-40℃时，降温速度为0.25℃/min降低降温速度，让胰岛细胞团内外降温一致。本发明的冻存液能有效的保护胰岛细胞团，冻存的胰岛细胞团活率高，并且能进行长期保存。以提供临床应用的胰岛细胞团。附图说明图1为实施例中冻存前猪胰岛细胞；图2为实施例中冻存1月后复苏猪胰岛细胞形态图；a为现有常规冻存液及方法；b为改良的冻存液及方法；c为本发明冻存液及方法；图3为实施例中冻存1月后复苏猪胰岛细胞流式细胞凋亡检测的结果；a为现有常规冻存液及方法；b为改良的冻存液及方法；c为本发明冻存液及方法。具体实施方式：以下结合实施例进一步说明本发明，而不会形成对本发明的限制。实施例1猪胰岛细胞的冻存实验胰岛细胞计数：每次于细胞悬液中取出50μl的样品，镜下计数dtz阳性细胞团并重复取样3次，按下列公式计数胰岛：胰岛产量＝(3次阳性胰岛数值之和/3)×[样本总量(ml)/50μl]。将分离提取的猪胰岛细胞分成两份冻存：第一份猪胰岛细胞用普通冻存液(50％血清+10％dmso+40％基础培养基)重悬，密度为10000ieq/ml；装入冻存管中，每管约1ml；降温至-80℃，置入液氮中长期保存。第二份猪胰岛细胞用改良的冻存液(50％血清+10％dmso+40％基础培养基+海藻糖0.05mml/l+生育酚20μg/ml)重悬，密度为10000ieq/ml；装入冻存管中，每管约1ml；降温至-80℃，置入液氮中长期保存。第三份猪胰岛细胞用本发明的冻存液重悬，密度为10000ieq/ml；装入冻存管中，每管约1ml，4℃平衡30min，然后放入程序降温仪中，以温度>-25℃时，1℃/min的速率降温，-25℃≥温度≥-40℃时，0.25℃/min的速率降温，-40℃＞温度≥-80℃时，5℃/min的速率降温，温度降到-80℃时，放入液氮中长期保存。实施例2冻存1个月猪胰岛细胞复苏后活率检测分别将实施例1所述的普通冻存液、改良冻存液和本发明冻存液冻存的细胞冻存1个月后复苏。复苏后培养一天，胰岛细胞计数计算细胞回收率，然后用annexinv–pi染色，通过facscaliburflowcytometer观察细胞发生凋亡的情况。实验结果表明常规冻存液组冻存一个月以后大部分猪胰岛细胞凋亡了，存活的细胞仅剩下22.07％，改良冻存液组冻存一个月以后存活的猪胰岛细胞活率提升到了41.69％，使用本发明的细胞冻存液冻存和冻存方法冻存一个月后的猪胰岛细胞的活率大大提升，达到62.62％。表明本发明冻存液和冻存方法更适合猪胰岛细胞的冻存。表1冻存1月后复苏胰岛细胞活率分组冻存1月后活率常规冻存液组22.07％改良冻存液组41.69％本发明冻存液组62.62％实施例3冻存1个月猪胰岛细胞复苏后功能检测分别将实施例1所述的普通冻存液冻存的猪胰岛细胞和本发明冻存液冻存的细胞冻存1个月后复苏。复苏后立即检测细胞胰岛素释放能力以及培养一天检测细胞胰岛素释放能力。实验结果显示本发明冻存方法组复苏的猪胰岛细胞葡萄糖刺激指数2.56＞1.8，表明本发明的冻存液和冻存方法复苏的猪胰岛细胞具有功能，而常规方法冻存的猪胰岛细胞葡萄糖刺激指数1.24＜1.8不具有功能。说明使用本发明的冻存液和冻存方法能较好的保护猪胰岛细胞的功能。表2冻存1月后复苏猪胰岛细胞胰岛素释放当前第1页12