一种无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液配方及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种无二甲基亚砜无蛋白-80°c细胞冻存液配方及其制备方法，属于 组织细胞培养技术领域。
【背景技术】
[0002] 细胞冻存技术是细胞生物学技术中一个非常重要的手段，常规的细胞冻存液中， 往往需要添加10%浓度的二甲基亚砜和人或动物源的血清或蛋白。随着近年来干细胞治疗 技术和免疫细胞治疗技术的发展，细胞冻存液在临床上的使用的需求越来越大，冻存的细 胞复苏后理论上需要洗涤，去除细胞冻存液中的二甲基亚砜和其它动物源的成分，但该过 程在实验室操作起来简便，对于临床上的使用非常麻烦，往往二甲基亚砜被直接输入人体。 国内临床使用的细胞冻存液中的二甲基亚砜往往使用的是国外进口的医药级试剂，价格非 常昂贵，即使使用国外进口的高质量二甲基亚砜，在临床上依然有很多病人会出现严重的 副反应。临床上对更为安全的细胞冻存液的需求非常迫切，我们在前面申报的专利，申请号 为20151074667913,发明名称为《无蛋白液氮冻存液及其制备方法》基础上，对冻存液的配 方做进一步的改进，实现在_80°C，使用无二甲基亚砜无蛋白的冻存液，可以达到高效率的 细胞冻存和复苏。新的配方为冻存液在临床的使用带来了便利，可以避免由二甲基亚砜给 病人带来的副作用，使用更为安全。
【发明内容】
[0003] 本发明主要提供了一种无二甲基亚砜无蛋白-80°C细胞冻存液配方及其制备方 法，该冻存液完全由化学成分组成配制，不含二甲基亚砜，细胞复苏率高，稳定性好。
[0004] 本发明的技术方案如下：一种无二甲基亚砜无蛋白_80°C细胞冻存液，其每IOOmL 的细胞冻存液中含有6. Og的右旋糖苷、1.0~9. Og的马来酰化的多聚赖氨酸，余量为RPMI-1640细胞基础培养基。
[0005] 优选的，所述的马来酰化的多聚赖氨酸的修饰度为30~90%。
[0006] 优选的，所述每IOOmL细胞冻存液中含有7.Og的60%修饰度的马来酰化多聚赖氨 酸。
[0007] 本发明的另一技术方案如下：一种无二甲基亚砜无蛋白_80°C细胞冻存液的制备 方法，其特征在于:包括以下步骤：
[0008] (1)称取配方量的右旋糖苷，溶解于70%量的RPMI-1640细胞基础培养基中；
[0009 ] (2)在上述溶液中添加配方量的60 %修饰度的马来酰化多聚赖氨酸；
[0010] (3)最后添加剩余的RPMI-1640细胞基础培养基；
[0011] (4)在无菌条件下将上述混合液先用0.45μπι滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条件 下再用0.22μπι滤膜进行过滤除菌，即得到无二甲基亚砜无蛋白液氮细胞冻存液。
[0012] 有益效果：
[0013] 本发明的无二甲基亚砜无蛋白细胞冻存液，完全由化学成分组成配制，不含二甲 基亚讽和蛋白质，细胞复苏率尚，能达到90 %以上；因不添加二甲基亚讽，冻存液用于临床 上细胞的冻存，直接输入人体，可避免由二甲基亚砜引起的副作用、同时不添加人白蛋白、 动物血清等，减少了细胞感染病原的可能性。将配好的细胞冻存液采用分级过滤的方法进 行制备，避免高温消毒引起冻存液成分的破坏，被破坏的部分成分会导致细胞毒性。该冻存 液的配方对细胞有极好冻存效果，同时因配方中避免使用价格昂贵的进口二甲基亚砜，生 产成本更低，操作简化。
[0014] 本发明的配方中一个成分是我们依据细胞冻存的原理，用有机合成的方法获得的 高分子。然后在我们的无蛋白液氮冻存液配方基础上做进一步的改进和优化。本发明采用 有机合成的方法，合成特定的酸酐修饰的多聚赖氨酸，然后和其它不同的高分子混合，得到 合适的无二甲基亚砜无蛋白-80 °C细胞冻存液。
[0015] 这种无二甲基亚砜无蛋白-80°c细胞冻存液的使用方法之一，具体的为，取人淋巴 细胞，用细胞洗涤液洗涤后，调整至每管中含有IO 6个细胞，离心去除洗涤液，每管中加入 Iml无二甲基亚砜无蛋白-80 °C细胞冻存液悬浮细胞，于-80 °C在冰箱中直接冻存。
[0016] 右旋糖酐系鹿糖经肠膜状明串珠菌-1226(Leuconostoc mesenteroides)发酵合 成的一种高分子葡萄糖聚合物，经处理精制而得。由于聚合的葡萄糖分子数目不同，而产生 不同分子量的产品。有高分子右旋糖酐（平均分子量10万-20万）、中分子右旋糖酐(平均分 子量6万-8万）、低分子右旋糖酐(平均分子量2万-4万）小分子右旋糖酐(平均分子量1万-2 万）。右旋糖酐在临床上有着非常广泛的用途，主要用作血浆代用品：中分子右旋糖酐用于 出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等。低、小分子右旋糖酐，能改善微循环，预防或消除 血管内红细胞聚集和血栓形成等，亦有扩充血容量作用。中分子右旋糖酐在其它领域也有 着非常广泛的用途，最常用的是可用做淋巴细胞分离液的主要成分，鉴于其独特的天然亲 水性高分子材料，在申请号为20151074667913，发明名称为《无蛋白液氮冻存液及其制备方 法》，在液氮冻存液的配方中，右旋糖苷起到了很好的效果。我们把它作为无二甲基亚砜和 无蛋白-80°C细胞冻存液的一个基础配方，和其它试剂配伍，以期获得无二甲基亚砜无蛋 白-80°C细胞冻存液配方。
[0017] ε-多聚赖氨酸是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能的微生物类食品防腐剂。它 是由25~30赖氨酸残基聚合而成，具有强烈的抑菌能力，可以作为防腐剂用于食品的保鲜。 ε_多聚赖氨酸抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、 霉菌均有一定的抑菌效果，ε_多聚赖氨酸对其他天然防腐剂不易抑制的革兰氏阴性的大肠 杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好，而且其对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用。常被 用做食品和药物的保护试剂，我们将多聚赖氨酸链上的α氨基，用马来酸酐进行修饰，测定 不通修饰程度的修饰的多聚赖氨酸，和上面的右旋糖苷混合配伍，配制出无二甲基亚砜无 蛋白质的-80 °C细胞冻存液。
[0018] 本发明在现有的RPMI-1640细胞基础培养基的基础上添加右旋糖酐、马来酸酐修 饰的多聚赖氨酸，配制成一种无二甲基亚砜无蛋白的_80°C细胞冻存液。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1
[0020] I、修饰多聚赖氨酸的合成
[0021] A，乙酰基修饰的多聚赖氨酸的合成:将20 %的多聚赖氨酸水溶液，控制在10度以 下，用5NNa0H将pH值调节到9，不断添加乙酸酐，用氢氧化钠控制反应液的pH值，依据加入的 乙酸酐的量不同，得到不同程度修饰的乙酰化多聚赖氨酸。得到的产物用凝胶过滤的方法， 去掉盐和副产物，冻干，得到白色固体。
[0022] B，马来酰化多聚赖氨酸的合成:将20%的多聚赖氨酸水溶液，控制在10度以下，用 5NNa0H将pH值调节到9，不断添加马来酸酐，用氢氧化钠控制反应液的pH值，依据加入的马 来酸酐的量不同，得到不同程度修饰的马来酰化多聚赖氨酸。得到的产物用凝胶过滤的方 法，去掉盐和副产物，冻干，得到白色固体。
[0023] 实施例2
[0024] 1.无二甲基亚砜无蛋白细胞-80 °C细胞冻存液的配制，包括以下步骤：
[0025] (1)称取6.(^的右旋糖苷，溶解于7〇1111的1?^1-1640细胞基础培养基中；
[0026] (2)在上述溶液中添加7. Og的60 %修饰度的马来酰化的多聚赖氨酸；
[0027] (3)最后添加 RPMI-1640细胞基础培养基定容至100mL;
[0028] 2.先在非无菌条件下将上述混合液先用0.45μπι滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条 件下再用〇.22μπι滤膜进行过滤除菌，即得到无二甲基亚砜无蛋白-80°C细胞冻存液。
[0029] 实施例3
[0030] 1.无二甲基亚砜无蛋白_80°C细胞冻存液的配制，包括以下步骤：
[0031] (1)称取6.(^的右旋糖苷，溶解于7〇1111的1?^1-1640细胞基础培养基中；
[0032] (2)在上述溶液中添加不同量的60 %修饰度的乙酰化多聚赖氨酸，加入的乙酰化 多聚赖氨酸的量使得终浓度分别为1%，3%，7%，9% ;
[0033] (3)最后添加 RPMI-1640细胞基础培养基定容至100mL;
[0034] 2.先在非无菌条件下将上述混合液先用0.45μπι滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条 件下再用〇. 22μπι滤膜进行过滤除菌，即得到无蛋白细胞冻存液。
[0035] 实施例4
[0036] 1.无二甲基亚砜无蛋白-80 °C细胞冻存液的配制，包括以下步骤：
[0037] (1)称取6. Og的右旋糖酐，溶解于70ml的RPMI-1640细胞基础培养基中；
[0038] (2)在上述溶液中添加不同量的60 %修饰度的马来酰化的多聚赖氨酸，加入的量 是的终浓度分别为1 %，3%，7%，9% ;
[0039] (3)最后添加 RPMI-1640细胞基础培养基定容至100mL;
[0040] 2.无二甲基亚砜无蛋白-80°c细胞冻存液的配制和制备方法，先在非无菌条件下 将上述混合液先用0.45μπι滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条件下再用0.22μπι滤膜进行过滤 除菌，即得到无蛋白-80细胞冻存液。
[0041 ] 实施例5
[0042] 1. 一种无二甲基亚砜无蛋白-80°C细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
[0043] (1)称取6. Og的右旋糖酐，溶解于70ml的RPMI-1640细胞基础培养基中；
[0044] (2)在上述溶液中添加马来酰化的多聚赖氨酸，加入的量是的终浓度分别为7% ; 共配置三种，其中不同之处在于添加马来酰化的多聚赖氨酸修饰度分别为30%，60%，90% [0045] (3)最后添加 RPMI-1640细胞基础培养基定容至100mL;
[0046] 2.无二甲基亚砜无蛋白-80°C细胞冻存液的配制和制备方法，先在非无菌条件下 将上述混合液先用0.45μπι滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条件下再用0.22μπι滤膜进行过滤 除菌，即得到无蛋白_80°C细胞冻存液。
[0047]对比细胞冻存液(含蛋白）
[0048] 1.冻存液的配方和配制方法
[0049] 将二甲基亚砜、胎牛血清和RPMI-1640培养基按照体积比为1:1:8的比例配制成 100mL的冻存液，除菌过滤。
[0050] 细胞活率测试
[0051 ] 取实施例2-5及对比细胞冻存液，分别冻存在-80 °C冻存人淋巴细胞，冻存4周后进 行细胞复苏，进行以下细胞活率分析操作：
[0052] 将冻存的细胞于37°C水浴复苏，使其在2分钟内复苏，用RPMI-1640基础培养基稀 释，取1〇〇μ1细胞悬液和1〇〇μ1的台盼兰染液混合，染色分析细胞活率，多做几组，取平均值。 [0053]实施例2的结果：
[0054] 表1细胞活率
[0056]实施例3的结果：
[0057] 表2细胞活率
[0059]实施例4的结果：
[0060] 表3细胞活率
[0062]实施例5的结果：
[0063] 表4细胞活率
[0065] 由表1可知，用本发明制备的无二甲基亚砜无蛋白冻存液-80 °C细胞冻存液，用 60 %修饰度的马来酰化的多聚赖氨酸，在7 %的浓度，和右旋糖苷配伍，可以配置出比经典 冻存液更好的冻存效果的冻存效果。说明本发明的无 DSMO无蛋白-80 °C细胞冻存液，复苏效 率高，适于细胞在-80度冻存。
[0066] 本发明中，细胞的冻存只实验分离的人淋巴细胞，对于其它细胞的冻存，也会取得 类似的效果，也在我们的保护范围中。对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方 案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于 本发明权利要求的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种无二甲基亚砜无蛋白-80 °C细胞冻存液，其特征在于：每lOOmL的细胞冻存液中 含有6.0g的右旋糖苷、1.0~9.0g的马来酰化的多聚赖氨酸，余量为RPMI-1640细胞基础培 养基。2. 根据权利要求1所述的无二甲基亚砜无蛋白-80°C细胞冻存液，其特征在于:所述的 马来酰化的多聚赖氨酸的修饰度为30~90 %。3. 根据权利要求2所述的无二甲基亚砜无蛋白-80°C细胞冻存液，其特征在于:所述每 1 OOmL细胞冻存液中含有7.0g的60 %修饰度的马来酰化多聚赖氨酸。4. 一种如权利要求3所述的无二甲基亚砜无蛋白-80°C细胞冻存液的制备方法，其特征 在于:包括以下步骤： (1) 称取配方量的右旋糖苷，溶解于70 %量的RPMI-1640细胞基础培养基中； (2) 在上述溶液中添加配方量的60 %修饰度的马来酰化多聚赖氨酸； (3) 最后添加剩余的RPMI-1640细胞基础培养基； (4) 在无菌条件下将上述混合液先用0.45μπι滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条件下再 用0.22μπι滤膜进行过滤除菌，即得到无二甲基亚砜无蛋白-80°C细胞冻存液。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液及其制备方法，每100ml无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液中含有6g的右旋糖酐、1.0-9.0g的60％修饰度的马来酰化多聚赖氨酸，余量为RPMI-1640细胞基础培养基。本发明的无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液由化学成分组成配制，不含二甲基亚砜和蛋白质，细胞复苏率高，稳定性好。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105707058
【申请号】CN201610261608
【发明人】徐念沁, 郁庆明, 徐炜华
【申请人】南京三生生物技术有限公司