一种dc细胞的冻存液及冻存方法
【专利摘要】本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种DC细胞的冻存液及冻存方法。本发明所述DC细胞的冻存液，包括海藻糖、牛血清白蛋白、丙二醇、DMSO、低分子右旋糖酐、DMEM培养基和维生素C。本发明所述DC细胞的冻存方法为向DC细胞中加入本发明所述冻存液，混匀后冻存。采用本发明所述冻存液冻存DC细胞，明显提高了DC细胞的冻存效果，不管是复苏后的活率还是增殖方面都可以保持较好的状态。
【专利说明】
一种DC细胞的冻存液及冻存方法
技术领域
[0001 ]本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种DC细胞的冻存液及冻存方法。
【背景技术】
[0002] DC细胞又叫做树突状细胞，属于已知细胞中抗原提呈能力最强的一种细胞，因此 有许多肿瘤病患的临床治疗方案都以DC细胞作为研究对象。但是DC细胞培养需要较长时 间，并且冻存后的血液无法培养出DC细胞，因此在治疗肿瘤病人的时候，必须抽取病人的新 鲜血液然后再通过14-30天的培养过程来扩增细胞再进行回输。这样就会有一些问题存在， 首先就是肿瘤病人血液质量较差，很难扩增出足够的DC细胞;其次扩增时间较长，病人等待 时间过长等。因此如果能够在病人情况较好的时候抽取外周血，并培养出DC细胞并冻存起 来，在需要的时候复苏细胞进行回输，便可以大大方便治疗过程，提高疗效。
[0003] 然而现在尚无明确能够冻存DC细胞的冻存液配方，通常采用通用的90%FBS+10% DMS0进行DC细胞的冻存。但90 %FBS+10 % DMS0的冻存液冻存DC细胞效果很差，复苏后DC细 胞的活率偏低，并且无法再继续增殖。现有冻存液中含有大量牛血清，有可能会引起严重的 过敏反应，并且带来了外源性病毒的风险，因此无法进行临床使用。而且现有冻存液中DMS0 含量过高，在临床输注时风险较大。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种DC细胞的冻存 液及冻存方法。
[0005] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种DC细胞的冻存液，包括海藻糖、牛血清白蛋白、丙二醇、DMS0、低分子右旋糖 酐、DMEM培养基和维生素 C。
[0007] 作为优选，所述冻存液由下述成分组成： 海藻糖 10 mg/ml-40 mg/ml. 牛血清白蛋白 5 mg/ml -25mg/ml 丙二醇 丨 v/v%-8 v/v%
[0008] DM SO 1 v/v%-3v/v% 低分子右旋糖Sf 40.ug/m丨-丨80 ^ug/m I DMEM培养基 82 v/v%-96 v/v% 维生素 C 0.5 mg/ml ~3 mg/ml e
[0009] 在一些实施方案中，所述冻存液由下述成分组成： 海藻糖 30nig/ml 牛血清白蛋白 丨Omg/m i 丙二醇 5v/v%
[0010] DM SO ! v/v% 低分子右旋糖酐丨00,ug/ml DMEM培养基 90 w'v% 维生素 C !.5mg/ml,
[0011] 在一些实施方案中，所述冻存液由下述成分组成： 海叙糖 10mg/ml 牛血清白蛋白 5 mg/m丨 兩二.醇 1 v/v%
[0012] DMSO 2 v/v% 低分子右旋糖針40pg/m丨 DMEM培养基 96 v/v% 维生素 C 0.5 mg/mI。
[0013] 在一些实施方案中，所述冻存液由下述成分组成： 海蒸糖 40 mg/ml
[0014] 牛血清白蛋白 25iTig/ml 兩二醇 8 v/v% DMSO 3 v/v% 低分子右旋糖Sf 180 pg/m丨
[0015] … DMEM培养基 82 v/v% 维生素 C 3 mg/ml。
[0016] 本发明还提供了一种DC细胞的冻存方法，向DC细胞中加入本发明所述冻存液，混 匀后冻存。
[0017] 其中，本发明所述的冻存方法中所述冻存液的加入量为至DC细胞密度为1 X 107-3 X107〇
[0018] 本发明所述的冻存方法中所述冻存优选为放入-80°C冰箱，24小时后转入液氮保 存。
[0019] 将单个核细胞(PBMC)用DMEM培养基按照2 X10%L的密度重悬，然后和所述培养 基的组分1按照1:1的体积比混合后，37°C，5%C02培养箱中培养；期间每3天按照总体积的 二分之一补加所述培养基的组分2。
[0020] 本发明所述冻存方法中所述DC细胞可以由单个核细胞(PBMC)培养得到。
[0021] 在一些实施方案中，所述DC细胞培养方法具体为PBMC用RPMI1640培养基重悬至密 度为5\105-1\10 6/1111，37°(：，5%0)2培养3小时;弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞用含有10% FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培养6天，收集DC细胞。
[0022]本领域技术人员可知，本发明所述单个核细胞可以由外周血或脐带血分离得到。 [0023]在一些实施方案中，所述单个核细胞的制备方法为外周血或脐带血加入生理盐水 稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清 晰，500-800g 离心 20-30min。
[0024] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种DC细胞的冻存液及冻存方法。本发明所 述DC细胞的冻存液，包括海藻糖、牛血清白蛋白、丙二醇、DMS0、低分子右旋糖酐、DMEM培养 基和维生素 C。本发明所述DC细胞的冻存方法为向DC细胞中加入本发明所述冻存液，混匀后 冻存。采用本发明所述冻存液冻存DC细胞，明显提高了DC细胞的冻存效果，不管是复苏后的 活率还是增殖方面都可以保持较好的状态。
【附图说明】
[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0026] 图1示试验例中实施例1冻存液冻存1个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0027]图2示试验例中实施例1冻存液冻存2个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0028]图3示试验例中实施例1冻存液冻存3个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0029]图4示试验例中实施例2冻存液冻存1个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0030]图5示试验例中实施例2冻存液冻存2个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0031]图6示试验例中实施例2冻存液冻存3个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0032]图7示试验例中实施例3冻存液冻存1个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0033]图8示试验例中实施例3冻存液冻存2个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0034]图9示试验例中实施例3冻存液冻存3个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0035]图10示试验例中对比例冻存液冻存1个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0036]图11示试验例中对比例冻存液冻存2个月的DC细胞复苏后的增殖曲线；
[0037]图12示试验例中对比例冻存液冻存3个月的DC细胞复苏后的增殖曲线。
【具体实施方式】
[0038] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0039] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。如无特殊 说明本发明所述丙二醇为注射级。
[0040] 实施例1:
[0041] 冻存液配方： 海藻糖 30mg/ml 牛血清白蛋白 1 Omg/ml
[0042] 注射级丙二醇 5v/v% DMSO 1 v/v% 低分子右旋糖肝丨OOpg/m丨 [0043] DMEM培养基 90 v/v% 维生素 C 1.5mg/ml
[0044] 冻存方法：
[0045] 第0天抽取一定量外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用 RPMI1640培养基重悬至密度为5X 105-1 X 106/ml，放入培养瓶中培养箱中37°C，5%C02培养 3小时。
[0046] 弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞用含有10%FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4 的RPMI1640培养基培养6天。
[0047]收集DC细胞，离心后去除上清，取一部分细胞用RPMI1640培养基重悬后检测细胞 表面标志物。
[0048]向沉淀中缓慢加入上述冻存液，混匀，调整细胞密度到1 X 107-3 X 107,检测细胞活 率。
[0049]将混匀的细胞悬液加入冻存管中，放入-80 °C冰箱，24小时后转入液氮保存。
[0050]选取冻存1个月、3个月、6个月的DC细胞，37°C水浴锅解冻复苏，保证复苏时间小于 2分钟。
[0051 ]将复苏后的细胞加入RPMI1640培养基重悬，用1640培养基将细胞悬液中原本带有 的冻存液的比例稀释至5%以下，离心去除上清，再次用RPMI1640培养基重悬后抽取部分检 测细胞表面标志物以及细胞活率。
[0052]剩余细胞用含有 10%FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培 养6天，观察细胞增殖情况并制定增殖曲线。
[0053] 实施例2:
[0054] 冻存液配方： 海藻糖 1:0 mg/ml 牛血清白蛋白 5mg/ml
[0055] 注射级丙二醇 1 v/v%. DMSO 2 v/v% 低分子右旋糖奸40pg/ml DMEM培养基 96 Wv%
[0056] … 维生素 C 0.5 mg/ml
[0057] 冻存方法：
[0058]第0天抽取一定量外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用 RPMI1640培养基重悬至密度为5X 105-1 X 106/ml，放入培养瓶中培养箱中37°C，5%C02培养 3小时。
[0059] 弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞用含有10%FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4 的RPMI1640培养基培养6天。
[0060]收集DC细胞，离心后去除上清，取一部分细胞用RPMI1640培养基重悬后检测细胞 表面标志物。
[0061 ]向沉淀中缓慢加入上述冻存液，混匀，调整细胞密度到1 X 107-3 X 107,检测细胞活 率。
[0062]将混匀的细胞悬液加入冻存管中，放入-80°C冰箱，24小时后转入液氮保存。
[0063]选取冻存1个月、3个月、6个月的DC细胞，37°C水浴锅解冻复苏，保证复苏时间小于 2分钟。
[0064]将复苏后的细胞加入RPMI1640培养基重悬，用1640培养基将细胞悬液中原本带有 的冻存液的比例稀释至5%以下，离心去除上清，再次用RPMI1640培养基重悬后抽取部分检 测细胞表面标志物以及细胞活率。
[0065]剩余细胞用含有 10%FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培 养6天，观察细胞增殖情况并制定增殖曲线。
[0066] 实施例3:
[0067] 冻存液配方： 海藻糖 40 mg/ml 牛血清白蛋白 25mg/ml 注射级丙二醇 8 v/v%
[0068] DMSO 3 v/v% 低分子右旋糖酐180pg/ml DMEM 培养基 82 v/v%
[0069] 维生素 C 3 mg/ml
[0070] 冻存方法：
[0071] 第0天抽取一定量外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用 RPMI1640培养基重悬至密度为5X 105-1 X 106/ml，放入培养瓶中培养箱中37°C，5%C02培养 3小时。
[0072] 弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞用含有10%FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4 的RPMI 1640培养基培养6天。
[0073]收集DC细胞，离心后去除上清，取一部分细胞用RPMI 1640培养基重悬后检测细胞 表面标志物。
[0074] 向沉淀中缓慢加入上述冻存液，混匀，调整细胞密度到1 X 107-3 X 107,检测细胞活 率。
[0075] 将混匀的细胞悬液加入冻存管中，放入_80°C冰箱，24小时后转入液氮保存。
[0076]选取冻存1个月、3个月、6个月的DC细胞，37°C水浴锅解冻复苏，保证复苏时间小于 2分钟。
[0077]将复苏后的细胞加入RPMI1640培养基重悬，用1640培养基将细胞悬液中原本带有 的冻存液的比例稀释至5%以下，离心去除上清，再次用RPMI1640培养基重悬后抽取部分检 测细胞表面标志物以及细胞活率。
[0078] 剩余细胞用含有 10%FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培 养6天，观察细胞增殖情况并制定增殖曲线。
[0079] 对比例：
[0080] 冻存液：90%FBS+10%DMS0 [0081 ] 冻存方法：
[0082] 第0天抽取20ml外周血，用ficoll法分离其中的PBMC，将分离出来的PBMC用 RPMI1640培养基重悬至密度为5X 105-1 X 106/ml，放入培养瓶中培养箱中37°C，5%C02培养 3小时。
[0083] 弃去非贴壁细胞，将贴壁细胞用含有10%FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4 的RPMI1640培养基培养6天。
[0084]收集DC细胞，离心后去除上清，取一部分细胞用RPMI1640培养基重悬后检测细胞 表面标志物。
[0085] 向沉淀中缓慢加入上述冻存液，混匀，调整细胞密度到1 X 107-3 X 107,检测细胞活 率。
[0086] 将混匀的细胞悬液加入冻存管中，放入-80°C冰箱，24小时后转入液氮保存。
[0087]选取冻存1个月、3个月、6个月的DC细胞，37°C水浴锅解冻复苏，保证复苏时间小于 2分钟。
[0088]将复苏后的细胞加入RPMI1640培养基重悬，用1640培养基将细胞悬液中原本带有 的冻存液的比例稀释至5%以下，离心去除上清，再次用RPMI1640培养基重悬后抽取部分检 测细胞表面标志物以及细胞活率。
[0089] 剩余细胞用含有 10%FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培 养6天，观察细胞增殖情况并制定增殖曲线。
[0090] 试验例:细胞活率检测及增值曲线
[0091 ]对实施例1-3及对比例冻存后复苏的细胞进行细胞活率检测，并观察细胞增值情 况。结果见表1和表2以及图1-12。
[0092] 表1冻存前及复苏后的细胞活率检测结果
[0093]
[0094]细胞活率代表存活细胞占总细胞数的比例，比例越高说明活细胞数越多，死亡细 胞越少。表1结果显示实施例1-3冻存后复苏的细胞活力与冻存前变化不大，而对比例冻存 后复苏的细胞活率要远低于冻存前，表明本发明所述冻存液冻存效果好，复苏后细胞活率 尚。
[0095] 表2细胞增值结果
[0096]
[0097] 由表2和图1-12可见各实施例冻存后的细胞复苏后的细胞生长速度明显要快于对 比例，最后所得到的细胞数也更多。
【主权项】
1. 一种DC细胞的冻存液，包括海藻糖、牛血清白蛋白、丙二醇、DMSO、低分子右旋糖酐、 DMEM培养基和维生素 C。2. 根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述成分组成： 海藻糖 10 mg/ml-40 牛血清白蛋白 5 mg/ml -25nig/ml 丙二醇 lv/v%-8v/v% DMSO I v/v%-3 v/v% 低分子右旋糖酐40}.ig/inl-180 ,ug/ml DMEM培养基 82 v/v%-96 v/v% 维生素 C 0.5 mg/ml -3 rng/ml〇3. 根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述成分组成： 海藻糖 30mg/ml 牛血清白蛋白 I Omg/m I 芮二醇 5v/v% DMSO 1 v/v% 低分子右旋糖辭I OOfig/m I DMEM培养基 90 v/v% 维生素 C 1.5 mg/ml 〇4. 根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述成分组成： 海漠糖 10 mg/ml 牛血清白蛋白 5 m g/m 1 丙二醇 1 v/v% DMSO 2 v/v% 低分子右旋糖Sf 40,ug/ml DMEM培养基 96 v./v% 维生素 .C 0.5 mg/ml〇5. 根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液由下述成分组成： 海藻糖 40 mg/ml 牛血清白蛋白 25mg./ml 丙二醇 8vA/% DMSO 3v./v% 低分子右旋糖酐180 pg/ml DMEM培养基 82 v/v% 维生素 C 3 mg/ml 〇6. -种DC细胞的冻存方法，向DC细胞中加入权利要求1所述冻存液，混匀后冻存。7. 根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存液的加入量为至DC细胞密度 为1 X 107-3 X 107。8. 根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存具体为放入-80°C冰箱，24小 时后转入液氮保存。9. 根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，所述DC细胞由单个核细胞培养得到。10. 根据权利要求9所述的冻存方法，其特征在于，所述培养具体为PBMC用RPMI1640培 养基重悬至密度为5 X IO5-I X IOfVml，37°C，5 %C02培养3小时;弃去非贴壁细胞，将贴壁细 胞用含有10 %FBS、500U/ml的GM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI1640培养基培养6天，收集DC细 胞。
【文档编号】A01N1/02GK105994254SQ201610615577
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】陈海佳, 王飞, 王一飞, 葛啸虎, 万桦, 张维敏
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司