专利名称：一种细胞冻存液及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及组织细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。
背景技术：
细胞冻存液是细胞冻存时必须的一种溶液，长期以来大量国内外生物细胞学术相关书籍介绍的常规冻存液配方和我们长期所使用的冻存液各组分体积百分比均为细胞培养液70 80%，牛血清10 30%，二甲基亚砜10%。常规使用的培养液如MEM、M199、 Eagle和DMEM等均已市场商品化。冻存液的作用是使细胞均勻地分散在溶液中，给细胞一个均勻分布的环境和空间，同时供给细胞生命代谢所必须的营养物质，防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤。在长期的生物学实验中，广泛使用上述配方冻存细胞。大量的实际生物细胞学实验和大量统计数据表明，采用这种冻存液所冻存的细胞复苏后存活率一般在50 70%，成活率比较低。冻存细胞经过复苏，培养12小时后在普通光学显微镜下观察，存活率一般在60%左右；当存活率小于50%时，细胞生长繁殖缓慢，形态不规则，细胞比较细小，长势比较差，基本上不能存活；当细胞存活率在60%左右时，细胞分布比较均勻，活细胞比较多，形态比较正常，长满单层需要6 8天。目前采用的细胞冻存液的冻存过程与复苏效果常规细胞冻存液包括以下体积百分比的各组分细胞培养液70%，小牛血清20%，二甲基亚砜10%。以上各组分混勻即成。细胞冻存过程培养生长成单层的VER0、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17细胞一瓶，其细胞密度约6X IOVcm2、培养面积为225cm2，0. 25%的胰酶消化2分钟，弃掉胰酶，加入培养液10ml，吹打混勻细胞悬液，离心1500转/10分钟，弃上清，加入常规的冻存液20ml混勻， 2ml/管分装入洁净的冻存管；将该冻存管置于2 8°C 2小时，-20°C 2小时，_80°C过夜， 然后浸入液氮中长期保存。细胞复苏过程从液氮中取出冻存的VER0、BHK-21、MRC-5、2BS或KMB17细胞一管 (2ml/管)，置入37°C水浴溶解，离心1500转/10分钟，弃掉上清，加入20 %小牛血清培养液10ml，置37°C培养；培养12小时候后观察，可见有60%左右的细胞贴壁；未长成单层细胞，更换10%的小牛血清培养液继续培养，6 8长满单层细胞后传代培养。在生物技术飞速发展的今天，人们在生物技术学及其相关科学的研究中，越来越多的运用组织细胞培养繁殖技术，将有研究意义或有应用前景的组织细胞采用低温度进行长期的保存，一旦有需要，可以随时对所的细胞进行复苏，恢复其完整的形态结构与生物学特征，供生命科学研究使用，细胞冻存和复苏的效果是直接影响细胞增殖成功与否的的关键技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞冻存液及其制备方法和应用。本发明提供的细胞冻存液，包括下述体积百分比的各组分细胞培养液5 20%，小牛血清65 80%，二甲基亚砜10%，3% (w/v)谷氨酰胺溶液 1 3%，7.5% (w/v)碳酸氢钠溶液2 4%。本发明提供的细胞冻存液，优选包括下述体积百分比的各组分细胞培养液10 15%，小牛血清70 75%，二甲基亚砜10%，3% (w/v)谷氨酰胺溶液 2%，7.5% (w/v)碳酸氢钠溶液3%。其中，所述的细胞培养液可任意选用MEM、M199、Eagle或DMEMD。本发明还提供所述细胞冻存液的制备方法，包括混合所述配方比例的细胞培养液、小牛血清、二甲基亚砜、3% (w/v)谷氨酰胺溶液和7. 5% (w/v)碳酸氢钠溶液。本发明所提供的细胞冻存液可应用于细胞冻存，可提高冻存细胞复苏培养后的存活率。本发明的优点与现有技术相比，本发明在常规细胞冻存液组分基础上增加了 3% (w/v)谷氨酰胺溶液，还增加了 7. 5% (w/v)碳酸氢钠溶液，同时调整了细胞培养液和小牛血清的含量。使用本发明改进的细胞冻存液，冻存细胞复苏培养后细胞存活率能达到90%以上，比常规细胞冻存液所冻存细胞复苏培养后的存活率有明显的提高，保证了细胞生长的质量和生物学特性，缩短了细胞复苏的增殖周期，使复苏后的组织细胞能及时、保质保量地提供给生物学实验研究。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1称取3g谷氨酰胺溶于适量水中，定容成100ml，配制成3% (w/v)的谷氨酰胺溶液。称取7. 5g的碳酸氢钠，溶于适量水中，定容成100ml，配制成7. 5% (w/v)的碳酸氢钠溶液。分别量取IOml的MEM细胞培养液、75ml的小牛血清、IOml的二甲基亚砜、2ml的 3% (w/v)的谷氨酰胺溶液和3ml的7. 5% (w/v)碳酸氢钠溶液，混合制得本发明细胞冻存液。实施例2
本实施例与实施例1的区别在于分别量取15ml的M199细胞培养液、70ml的小牛血清、IOml的二甲基亚砜、2ml的 3% (w/v)谷氨酰胺溶液和3ml的7. 5% (w/v)碳酸氢钠溶液，混合制得本发明细胞冻存液。实施例3本实施例与实施例1的区别在于分别量取5ml的Eagle细胞培养液、80ml的小牛血清、IOml的二甲基亚砜、2ml的 3% (w/v)谷氨酰胺溶液和3ml的7. 5% (w/v)碳酸氢钠溶液，混合制得本发明细胞冻存液。实施例4本实施例与实施例1的区别在于分别量取20ml的DMEM细胞培养液、65ml的小牛血清、IOml的二甲基亚砜、2ml的 3% (w/v)谷氨酰胺溶液和3ml的7. 5% (w/v)碳酸氢钠溶液，混合制得本发明细胞冻存液。实施例5本实施例与实施例1的区别在于分别量取15ml的M199细胞培养液、70ml的小牛血清、IOml的二甲基亚砜、Iml的 3% (w/v)谷氨酰胺溶液和細1的7. 5% (w/v)碳酸氢钠溶液，混合制得本发明细胞冻存液。实施例6本实施例与实施例1的区别在于分别量取5ml的Eagle细胞培养液、80ml的小牛血清、IOml的二甲基亚砜、3ml的 3% (w/v)谷氨酰胺溶液和2ml的7. 5% (w/v)碳酸氢钠溶液，混合制得本发明细胞冻存液。比较例1分别量取70ml的MEM细胞培养液、20ml的小牛血清、IOml的二甲基亚砜，混合制得常规细胞冻存液。实验例1以上实施例1 6及比较例1所制备的细胞冻存液，分别按照下述方法进行细胞冻存和复苏实验。细胞冻存过程培养生长成单层的VERO、BHK-21、MRC_5、2BS和KMB17细胞各一瓶，其细胞密度约6 X IOVcm2、培养面积为225cm2，加入pH7. 0的PBS洗细胞表面一次，用 0. 25%的胰酶消化2分钟，弃掉胰酶，加入细胞培养液10ml，吹打混勻细胞悬液，1500转/ 分离心10分钟，弃上清，加入15ml的细胞冻存液，混勻，1. 5ml/管分装入洁净冻存管；将冻存管置于2 8°C 2小时，-200C 2小时，-SO0C 12小时，然后浸入液氮中长期保存。细胞复苏的过程与效果从液氮中取出冻存的VERO、BHK-21、MRC-5、2BS和KMB17 细胞各一管(1. 5ml/管)，置入39 °C水浴溶解，1500转/分离心10分钟，弃掉上清，加入 20%小牛血清培养液10ml，置37 °C培养。使用实施例1 6中本发明细胞冻存液所冻存细胞复苏培养6小时候后观察，可见有90 %左右的细胞贴壁，细胞形态良好，细胞比较丰满，活细胞很多，大小均勻，已长成单层细胞；更换10%的小牛血清培养液继续培养，2 3天可长满单层细胞。使用比较例1中的常规细胞冻存液所冻存细胞复苏培养12小时候后观察，可见有 60%左右的细胞贴壁，未长成单层细胞，更换10%的小牛血清培养液继续培养，需6 8天长满单层细胞。
表1 各细胞冻存液用于冻存细胞并经复苏培养后的细胞存活率
权利要求
1.种细胞冻存液，其特征在于，包括下述体积百分比的各组分细胞培养液小牛血清、5 20%， 65 80%， 10%,甲基亚砜、3 % (w/v)谷氨酰胺溶液 1 3 %， 7. 5 % (w/v)碳酸氢钠溶液 2 4 %。
2.根据权利要求1所述细胞冻存液，其特征在于，包括下述体积百分比的各组分3% (w/v)谷氨酰胺溶液 2%， 7. 5 % (w/v)碳酸氢钠溶液 3 %。
3.根据权利要求1或2所述的细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞培养液为MEM、 M199、Eagle 或 DMEM。
4.权利要求1或2所述的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括混合所述配方比例的细胞培养液、小牛血清、二甲基亚砜、3% (w/v)谷氨酰胺溶液和7. 5% (w/v)碳酸氢钠溶液。
5.权利要求1或2所述的细胞冻存液在提高冻存细胞复苏后存活率中的应用。细胞培养液小牛血清、10 15%， 70 75%， 10%,甲基亚砜
全文摘要
本发明提供了一种细胞冻存液及其制备方法和应用。该细胞冻存液包括，5～20％(v/v)的细胞培养液、65～80％(v/v)的小牛血清、10％(v/v)的二甲基亚砜、1～3％(v/v)的3％(w/v)谷氨酰胺溶液和2～4％(v/v)的7.5％(w/v)碳酸氢钠溶液。本发明提供的细胞冻存液用于冻存培养细胞，提高了冻存细胞复苏后的存活率，保证了细胞生长的质量并缩短了细胞增殖的时间。
文档编号C12N5/07GK102172237SQ20101062361
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者徐希丽, 林登宇 申请人:北京民海生物科技有限公司