专利名称：用于冻存单个核细胞的冻存液的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及用于冻存单个核细胞的冻存液及其制备方法。
背景技术：
正常情况下，液体冻结时会产生规则或不规则的晶体，易造成细胞膜破裂进而对活细胞造成直接损伤。因此，为减少冻存过程中细胞的损伤，往往需要使用含低温保护剂的冻存液。常用的低温保护剂有二甲基亚砜(DMS0)、甘油和葡聚糖等，其中以DMSO最为常用。 使用纯动物血清结合DMSO是常用的冻存液，但动物血清可能含有动物性的病原微生物，有可能与冻存的细胞发生交叉感染，一旦发生感染，后续复苏和洗涤很难清除。培养基和羟乙基淀粉溶液也常作为细胞冻存液的主要成分，用于细胞冻存。单个核细胞(MNC)是由新鲜脐带血或骨髓经过密度梯度离心后获得的包括淋巴细胞、单核细胞等在内的细胞混合群体，其中含有一些干细胞和祖细胞。MNC成分复杂，各种类型的细胞在冻存过程的耐受能力有差异，各种类型的细胞适用的冻存液往往不同。因此，现有的冻存液用于MNC的冻存效果往往不够理想。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于冻存单个核细胞的冻存液， 可适用于单个核细胞中各种类型细胞的冻存，提高了单个核细胞的冻存效果。一个方面，本发明提供一种用于冻存单个核细胞的冻存液，包含血浆和二甲基亚砜。本发明提供的用于冻存单个核细胞的冻存液，包含血浆和二甲基亚砜，但不仅限于血浆和二甲基亚砜，也可以包含动物血清和培养基等成分。脐带血血浆中富含各种矿物质离子和蛋白因子，提供细胞代谢所需物质并维持细胞所需的渗透压，是天然的营养体系和缓冲体系。将自体脐带血血浆用于脐带血来源MNC 的冻存，避免了动物源病原微生物的交叉感染风险，可使MNC的冻存更加安全有效，便于冻存细胞后续的临床应用。作为本发明的进一步改进，所述血浆的体积百分比为909Γ95% ；所述二甲基亚砜的体积百分比为59TlO%。二甲基亚砜(DMSO)是最常用的低温保护剂，但DMSO具有较强的毒副作用。因此， 在保证冻存效果的同时，尽量减少DMSO的使用量，可减少细胞的损伤，使MNC的冻存更加安全。另一方面，本发明提供一种制备用于冻存单个核细胞的冻存液的方法，包括以下步骤
Α)取新鲜脐带血于无菌离心管中，在观00 rpm离心16 min后，收集上清液，即为血浆； B)将所述血浆和所述二甲基亚砜混合均勻，血浆的体积百分比为909Γ95%，二甲基亚砜的体积百分比为59TlO%。
与现有技术相比，本发明的有益效果是将脐带血MNC分离中富余的血浆用于MNC 的冻存，实现了富余血浆的“废物利用”，不用专门购买动物血清、培养基等昂贵试剂，节约了资源和成本；可适用于MNC中各种类型细胞的冻存，提高了 MNC冻存的细胞复苏活率，冻存效果好；避免了动物源病原微生物的交叉感染风险，可使MNC的冻存更加安全有效，便于冻存细胞后续的临床应用。
图1为本发明实施例四中造血干细胞⑶34表达流式检测结果；图1-a 冻存前； 图1-b :DMEM冻存后；图1-c =HES冻存后；图l_d 血浆冻存后。图2为本发明实施例五中细胞集落形态特征图；图1-a:红细胞集落，放大倍数为100倍；图1-b 爆式红细胞集落，放大倍数为100倍；图I-C 巨噬细胞集落，放大倍数为 100倍；图Ι-d 粒-巨噬细胞集落，放大倍数为100倍；图Ι-e 混合大集落，放大倍数为100 倍；图l_f 粒细胞集落，放大倍数为40倍。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。实施例一冻存液的配制。超净工作台中，取新鲜脐带血于无菌离心管中，在观00 rpm离心16 min后，收集上清液，即为血浆。将血浆(Blood plasma)和二甲基亚砜(DMSO)按19:1的体积比混合均勻，得本发明提供的血浆冻存液。为便于冻存效果的比较，配制现有技术的DMEM冻存液DMEM基础培养基与DMSO 以19:1的体积比混合均勻；HES冻存液医用6%羟乙基淀粉溶液(HES)与DMSO以19:1的体积比混合均勻。本文中，DMEM指的是DMEM基础培养基，HES指的是医用6%羟乙基淀粉溶液。实施例二 MNC的冻存。配制如上所述的血浆冻存液、DMEM冻存液和HES冻存液，放4°C冰箱预冷。收集培养的MNC，在200 g离心10 min后，弃上清液，用生理盐水悬浮细胞，取样计数。依据细胞计数情况将细胞均分成三组，分别命名为血浆冻存组、DMEM冻存组和HES冻存组，在200g离心10 min,弃上清液，加入相应的冻存液，轻轻混勻。将混勻后的细胞分装入冻存管，做好标记，将冻存管置于程序降温盒中，再移入-80°C冰箱，隔天转入液氮罐中冻存。MNC细胞经过液氮冻存2天以上，视试验需要即可进行复苏操作。实施例三MNC冻存的细胞复苏活率分析。将恒温水浴箱的温度调节至40°C，分别从液氮罐中取出血浆冻存组、DMEM冻存组和HES冻存组的冻存管，每组取三个平行样，立即投入水浴锅中，快速摇动，细胞冻存液完全融解时，喷75%乙醇；超净工作台中进行操作，酒精灯焰快速灼烧冻存管盖子，打开各冻存管盖子，从各冻存管中将细胞悬液全部转移至标记好的无菌离心管中，往无菌离心管中缓慢加入冻存液5倍体积以上的冷生理盐水，轻轻混勻，在200g离心10 min,弃上清液，用培养液或者PBS重悬细胞，轻轻混勻，取样计算细胞冻存前活率。MNC冻存的细胞复苏活率采用台盼兰染色结合显微镜计数法进行分析。台盼兰染液与细胞悬液均勻混合后1 min内即在显微镜下计数，计四个中方格，每个中方格有4(Γ80 个细胞为宜，四个中方格细胞计数总量不少于100。染成蓝色的细胞计为死细胞。细胞活率的计算公式为I-Nd (死细胞数)/Nt (细胞总数)。 MNC冻存的细胞复苏活率分析结果如表1所示。从表1可以看出，血浆冻存组的细胞复苏活率明显高于DMEM冻存组和HES冻存组，说明本发明提供的冻存液用于冻存MNC， 提高了 MNC冻存的细胞复苏活率。采用SPSS11. 5统计软件对数据进行完全随机设计资料单因素方差分析，*表示血浆冻存组的细胞复苏活率明显高于DMEM冻存组和HES冻存组 (Ρ<0. 05)。
表1不同冻存液冻存MXC的细胞复苏活率
权利要求
1.一种用于冻存单个核细胞的冻存液，其特征在于包含血浆和二甲基亚砜。
2.根据权利要求1所述的用于冻存单个核细胞的冻存液，其特征在于所述血浆的体积百分比为90°/Γ95% ；所述二甲基亚砜的体积百分比为59TlO%。
3.一种制备权利要求1所述的用于冻存单个核细胞的冻存液的方法，其特征在于，包括以下步骤Α)取新鲜脐带血于无菌离心管中，在2800 rpm离心16 min后，收集上清液，即为血浆； B)将所述血浆和所述二甲基亚砜混合均勻，血浆的体积百分比为909Γ95%，二甲基亚砜的体积百分比为59TlO%。
全文摘要
本发明涉及一种用于冻存单个核细胞的冻存液及其制备方法，属于生物技术领域。用于冻存单个核细胞的冻存液，包含血浆和二甲基亚砜。本发明主要应用于单个核细胞的冻存，具有冻存效果好和节约成本的优点。
文档编号A01N1/02GK102301992SQ201110185230
公开日2012年1月4日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年7月4日
发明者刘陈雄, 吴莉芳, 姜舒, 李陶, 胡祥 申请人:深圳市北科生物科技有限公司