专利名称：无蛋白非程序细胞冻存液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞冻存液，特别涉及一种无蛋白的细胞冻存液。
背景技术：
细胞，特别是干细胞等高价值的细胞，具有潜在的医用价值等其他价值，细胞保存 技术是实现这些价值的基础。常用的细胞保存方法有培养保存和冻存。培养保存，耗时耗力，程序繁琐，在培养 的过程中，特别是长期继代培养时，细胞容易发生变异，细胞特性丧失，失去保存价值。因 此，培养保存一般应用于易于培养，不易发生变异的细胞中，如部分瘤细胞。细胞冻存即将细胞置于低温环境下保存，以使细胞暂时脱离生长状态，保存其细 胞特性。这样保存的成本较低，可以在需要时将细胞复苏培养。与些同时，也避免了培养保 存中因细胞污染而导致的细胞品种损失。现有的细胞冻存液一般由DMS0、血清、细胞培养液组成，为即用型冻存液，需要现 配现用，由于血清的成分不定，冻存液批次间稳定性差。血清待蛋白质的存在，使得这种细 胞冻存液的保质期也较短，保存条件也较为苛刻。细胞冻存液中蛋白的存在，对细胞特性有一定的影响，如血清中的一些成分会影 响细胞(如神经干细胞NSC)、神经元细胞等特殊细胞的生长与分化。在细胞治疗中，外源蛋白的存在，特别是未知蛋白的存在，会引起不必要的，甚至 是未知的不良反应，严重影响治疗结果。人们希望，至少在细胞治疗用细胞的冻存中不添加 外源蛋白。而不添加外源蛋白的话，又难以保证冻存细胞的复苏率。即使在细胞添加蛋白类保护剂，为保证细胞冻存的成功率，使用这些细胞冻存液 冻存细胞时，还是要使用程序降温的方式，缓慢冰冻细胞。这种程序性降温用时长，需要购 置昂贵的专用仪器，处理能力极其有限，仅能用于实验室的小批量处理，远不能满足大批量 处理的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无蛋白非程序细胞冻存液。本发明所采取的技术方案是无蛋白细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1 23w/v%、渗透性细胞膜内保护剂 1. 0 16w/v%、细胞沉降稳定剂3. 0 28%，余量为pH缓冲液。优选的，冻存液中还添加有抗氧化剂0. 1 0. 4w/v%，细胞营养剂0. 3 2. 0w/v%。细胞膜保护剂包括非还原性双糖、多糖、糖酐。本发明的有益效果是本发明的细胞冻存液中，成分完全清楚，没有添加 白质类物质，所使用的各种用 料，均为生物体可接受的，不会对基体造成损害，至少不会对基体造成未知的损害，特别适用于细胞治疗用细胞的冻存。本发明的细胞冻存液，对细胞的保护作用好，冻存后细胞复苏率高，实验表明，使 用本发明的细胞冻存液冻存的间质干细胞(MSCs)的复苏率超过90%，皮层神经元细胞 (CNCs)的复苏率超过75%，胚胎干细胞(ESCs)的复苏率超过也高达94%。在细胞冻存效 果优异的同时，本发明的细胞冻存液对细胞特性没有影响，不影响细胞正常的生长和分化。使用本发明的细胞冻存液，冻存程序简单，只需将待冻存细胞投入细胞冻存液中， 直接置于-80°C的环境中冻存，无需程序性降温，大大提高的细胞冻存的效率。本发明的细胞冻存液，由纯化学物质组成，成分稳定可控，保质期长，批次间稳定 性好，可直接应用于细胞保存，无需稀释或自行配制，大大方便了操作。
图1是SD大鼠间充质干细胞MSCs复苏后的生长曲线图；图2是未诱导的SD大鼠MSCs细胞图；图3是本发明细胞冻存液冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；图4是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞图；图5是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成骨诱导28d的细胞 图；图6是本发明细胞冻存液冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；图7是常规细胞冻存液程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞图；图8是常规细胞冻存液非程序冻存的SD大鼠MSCs复苏后，成脂诱导20d的细胞 图。
具体实施例方式本发明中使用的细胞膜保护剂、渗透性细胞膜内保护剂、细胞沉降稳定剂，既可以 单独使用，也有可以根据需要混合使用。本发明中使用的渗透性细胞膜内保护剂，包括二甲基亚砜(DMS0)、丙二醇、丙三醇寸。本发明中使用的细胞沉降稳定剂，包括甲基纤维素、羟乙基淀粉、糊精、可溶性淀 粉，用以防止或延缓细胞在冻存过程中的沉降，防止细胞互相挤压，影响细胞冻存效果。本发明细胞冻存液中所使用的pH缓冲液，在于提供一个适合细胞生存的稳定pH， 可以为常规的PBS缓冲液，缓冲液的pH值、Na+、K+含量可以根据具体的冻存细胞类型进行 相应的调节。这种调节是本领域技术人员所熟知的。常用的PH缓冲液的pH为7.2 7. 4， Na+含量为20 30mM，K+含量为110 130mM。本发明细胞冻存液中使用的抗氧化剂，为常规的抗氧化剂，包括维生素C、谷胱甘 肽等，抗氧化剂既可以单独使用，也可以混用。本领域的技术人员可以根据需要选择其他的 抗氧化剂。本发明细胞冻存液中使用的细胞营养剂，为常规的细胞营养剂，包括谷氨酰胺、丙 酮酸钠等，用以补充细胞代谢时消耗的部分能量。细胞营养剂既可以单独使用，也可以混 用。本领域的技术人员可以根据需要选择其他的细胞营养剂。
下面结合实施例，进一步说明本发明。以下实施例中，如无特别说明，百分比均指。实施例1细胞冻存液的组成如下细胞膜保护剂1%，由蔗糖0. 5%、高分子糖酐-500 0. 5%组成，DMSO 8%,细胞沉降稳定剂25%，由甲基纤维素4000 CP 15%、羟乙基淀粉10%组成，抗氧化剂0.2%，由维生素C 0. 1%、谷胱甘肽0. 组成，细胞营养剂1. 0%，由谷氨酰胺0. 4%、丙酮酸钠0. 6%组成，PBS缓冲液，余量。实施例2细胞冻存液的组成如下细胞膜保护剂23%，由海藻糖11%、潘糖5%、中分子糖酐-70 7%组成，渗透性细胞膜内保护剂5%，由丙二醇2%、丙三醇3%组成，细胞沉降稳定剂8%，由可溶性淀粉5%、糊精3%组成，谷胱甘肽0.3%，谷氨酰胺0.3%PBS缓冲液，余量。实施例3细胞冻存液的组成如下细胞膜保护剂5%，由海藻糖2%、木糖3%组成，渗透性细胞膜内保护剂13%，由DMSO 5%、丙二醇8%组成，细胞沉降稳定剂20%，由甲基纤维素1500 CP 5%、羟乙基淀粉15%组成，抗氧化剂0. 1 %，由维生素C组成，细胞营养剂0. 5%，由丙酮酸钠组成，pH缓冲液，余量。实施例4细胞冻存液的组成如下细胞膜保护剂17%，由海藻糖组成，渗透性细胞膜内保护剂16%，由DMSO组成，细胞沉降稳定剂2%，由甲基纤维素4000 CP组成，抗氧化剂0.2%，由维生素C组成，细胞营养剂0.8%，由谷氨酰胺0. 1%、丙酮酸钠0.7%组成，pH缓冲液，余量。实施例5细胞冻存液的组成如下细胞膜保护剂10%，由海藻糖6. 0%、蔗糖4. 0%组成，渗透性细胞膜内保护剂9%，由丙三醇组成，细胞沉降稳定剂23%，由甲基纤维素400CP 18%、可溶性淀粉5%组成，抗氧化剂0.4%，由维生素C 0. 12%、谷胱甘肽0.28%组成，
细胞营养剂2%，由谷氨酰胺、丙酮酸钠各1. 0%组成，pH缓冲液，余量。实施例6细胞冻存液的组成如下细胞膜保护剂14%，由棉子糖4%、木糖3%、潘糖7%组成，渗透性细胞膜内保护剂1 %，由DMSO组成，细胞沉降稳定剂13%，由甲基纤维素1500 CP 8%、羟乙基淀粉5%组成，抗氧化剂0. 1 %，由维生素C组成，细胞营养剂1. 5%，由丙酮酸钠组成，pH缓冲液，余量。实施例7细胞冻存液的组成如下细胞膜保护剂7%，由糖酐-40 1%、棉子糖3%、蔗糖3%组成；渗透性细胞膜内保护剂10%，由DMSO组成，细胞沉降稳定剂17%，由可溶性淀粉组成，抗氧化剂0. 26%，由谷胱甘肽组成，细胞营养剂1. 8%，由谷氨酰胺组成，pH缓冲液，余量。使用不同配比细胞膜保护剂的细胞冻存液，非程序性冻存SD大鼠间充质干细胞 MSCs，检测其复苏率，结果如表1所示。表1、细胞膜保护剂配比_细胞复苏率比较表
权利要求
无蛋白细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1.0～23w/v％、渗透性细胞膜内保护剂1.0～16w/v％、细胞沉降稳定剂2.0～25％，余量为pH缓冲液。
2.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于所述冻存液中还添加有抗 氧化剂0. 1 0. 4w/v%。
3.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于所述冻存液中还添加有细 胞营养剂0.3 2. 0w/v%。
4.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于细胞膜保护剂包括非还原 性双糖、多糖、糖酐。
5.根据权利要求4所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于非还原性双糖包括海藻糖、 蔗糖。
6.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于多糖包括棉子糖、木糖、潘糖。
7.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于糖酐包括低分子糖酐-40、 中分子糖酐-70、高分子糖酐-500。
8.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于渗透性细胞膜内保护剂包 括二甲基亚砜(DMS0)、丙二醇、丙三醇。
9.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于细胞沉降稳定剂包括甲基 纤维素、羟乙基淀粉、糊精、可溶性淀粉。
10.根据权利要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于pH缓冲液的pH为7.2 7. 4。
全文摘要
本发明公开了无蛋白细胞冻存液，含有细胞膜保护剂1～23w/v％、渗透性细胞膜内保护剂1.0～16w/v％、细胞沉降稳定剂3.0～28％，余量为pH缓冲液。本发明的细胞冻存液，由纯化学物质组成，无蛋白，成分稳定可控，保质期长，批次间稳定性好；对细胞的保护作用好，冻存后细胞复苏率高，对细胞特性没有影响，不影响细胞正常的生长和分化；本发明的细胞冻存液，可直接应用于细胞保存，无需稀释或自行配制冻存程序简单，只需将待冻存细胞投入细胞冻存液中，直接置于-80℃的环境中冻存，无需程序性降温，大大提高的细胞冻存的效率，操作方便。
文档编号A01N1/02GK101971796SQ20101018390
公开日2011年2月16日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者罗晴燕, 莫筱萦, 郑敦武, 陈嘉慧, 魏宝丽 申请人:赛业(广州)生物科技有限公司