本发明涉及畜牧领域，具体地说，涉及一种提高精液低温/冷冻保存品质的精液稀释液及其应用。
背景技术：
精液低温冷冻保存技术能充分利用优良种畜的遗传资源，迅速扩大畜群的良种比例。同时，此技术也是治疗哺乳动物不孕症的有效辅助手段。精液稀释液是精子的保护剂，对精液保存的效果有重要的影响。哺乳动物常用的精液稀释液类型有柠檬酸一糖一卵黄类稀释液，加抗氧化剂的蔗糖类稀释液和奶类稀释液。无论使用哪种类型的精液稀释液，它们一般都应由维持渗透压物质、抑菌物质、防冻保护剂或低温保护剂等组成。其中，防冻保护剂(甘油、二甲基亚砜、卵黄和糖类)是精子在超低温冷冻时起保护作用的，低温保护剂(糖类、奶类)是将精液降温至4℃时对精子起保护作用的。
目前，马的精液保存主要采用低温和超低温冷冻保存。精液低温保存可以在4℃条件下保存72h以上，48小时内输精后的情期受胎率与鲜精无明显差异，48小时以后输精后的情期受胎率由于精子活力下降会明显降低。超低温冷冻保存通常是将精液保存至0.5ml或0.25ml塑料细管中来实现冷冻保存的，解冻后精子的直线前进运动率在45％左右，利用冷冻精液进行人工输精，马科动物的受胎率明显低于鲜精和液态保存精液，原因是冷冻解冻后的精了活力降低，能保持受精能力的有效精子数量明显下降。
近几年，子宫角深部输精和内窥镜输精等低剂量输精技术在生产中应用，进一步对精液的保存效果提出了更高的要求。因此，提高冻精活力，延长精子体外存活时间是畜牧生产和科学研究所必需的。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提高精液低温/冷冻保存品质的精液稀释液及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种提高精液低温/冷冻保存品质的精液稀释液，其含有40～60μm的bapta-am，优选50μm。
本发明经研究发现，bapta-am可有效的提高精液的低温保存质量及冷冻保存并解冻后的精液品质。
进一步地，当用于低温保存时，所述精液稀释液包括：低温保存液、bapta-am和抑菌物质；所述低温保存液以200ml计，含有如下成分：葡萄糖5.00g、乳糖0.300g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060g、柠檬酸钾0.082g、hepes试剂0.238～1.192g、蒸馏水100ml、灭菌脱脂奶100ml；所述抑菌物质为：青霉素10～20万iu、链霉素10～20万iu。
在上述配方下等比例扩大或缩小均属于本发明的保护范围。
作为优选，所述低温保存液以200ml计，含有如下成分：葡萄糖5.00g、乳糖0.300g、棉子糖0.300g、柠檬酸钠0.060g、柠檬酸钾0.082g、hepes试剂0.952g，蒸馏水100ml、灭菌脱脂奶100ml；所述抑菌物质为：青霉素20iu、链霉素20万iu。
进一步地，当用于冷冻保存时，所述精液稀释液包括：冷冻保存液、bapta-am和抑菌物质；所述冷冻保存液以200ml计，含有如下成分：葡萄糖4.5g、乳糖0.27g、棉子糖0.27g、柠檬酸钠0.054g、柠檬酸钾0.0738g、hepes试剂0.2142～1.0728g、90ml蒸馏水、灭菌脱脂奶90ml、无菌甘油5～10ml、卵黄5～10ml；所述抑菌物质为：青霉素10～20万iu、链霉素10～20万iu。
作为优选，所述冷冻保存液以200ml计，含有如下成分：葡萄糖4.5g、乳糖0.27g、棉子糖0.27g、柠檬酸钠0.054g、柠檬酸钾0.0738g、hepes试剂0.8568g、90ml蒸馏水、灭菌脱脂奶90ml、无 菌甘油10ml、卵黄10ml；所述抑菌物质为：青霉素20万iu、链霉素20万iu。
第二方面，本发明提供一种提高精液低温/冷冻保存品质的方法，使用前述精液稀释液对精液进行低温保存或冷冻保存。
所述低温保存具体为：精液采集去除胶状物，检测精液的活率、体积、密度后。低速离心弃上清，根据精液密度及输精要求，利用37℃权利要求3或4所述的精液稀释液稀释精液，马精子密度正常为150-300×106个/ml，1单位体积精液离心弃上清后可使用1-4倍体积的37℃精液稀释液稀释，之后用5cm厚的脱脂棉包裹严密，放置于4度低温保存。
所述冷冻保存具体为：精液采集去除胶状物后，检测精液的活率、体积、密度后。低速离心弃上清，根据精液密度及输精要求，利用37℃权利要求5或6所述的精液稀释液稀释精液，马精子密度正常为150-300×106个/ml。1单位体积精液离心后，可使用1-4倍体积冷冻保存液比例稀释，再进行分装到0.25ml或0.50ml塑料细管中，每管精子密度要不少于50*106/ml，脱脂棉包裹严密，在4℃预平衡2-4小时后，将塑料细管放置在液氮液面上5cm处的铜网架上，液氮蒸汽熏蒸15-20min(降温速率大约为-70℃/min)，直接投入液氮保存。
第三方面，本发明提供了前述精液稀释液在提高精液低温/冷冻保存品质方面的应用。
作为优选，本发明所提供的精液稀释液对马科动物的精液保存格外适宜，因此，所述精液优选来自马科动物。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种可以提高动物精液低温保存品质或冷冻保存品质的精液稀释液，即通过添加bapta-am来提高动物精液保存品质。本发明提供的精液稀释液能够显著提高精液低温保存活性，延长精子体外保存时间；同时，冷冻解冻后精子活力与对照组相比能提高 10％-20％。本发明操作简便，应用成本低廉，效果显著，对动物不产生任何有害影响。可以在马科动物精液保存及相关的胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1精液稀释液(低温保存用)
本实施例用于说明用于精液低温保存的精液稀释液的制备。
1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、hepes试剂，bapta-am，以上药品均为分析纯，蒸馏水，脱脂奶，青霉素，链霉素。
2、制备方法：配制精液稀释液200ml为例，先分别称取葡萄糖5.0g、乳糖0.3g、棉子糖0.3g、柠檬酸钠0.06g、柠檬酸钾0.082g、hepes试剂0.952g，将其放入锥形瓶中，添加100ml的蒸馏水混合，摇动锥形瓶直至固体溶解；将脱脂奶倒入另一干净锥形瓶中；同时放入高压灭菌锅中消毒，115℃消毒20min。室温冷却后将两者混合，加入青霉素与链霉素各20万iu及50μm终浓度的bapta-am放置4度保存。其他体积的液体按相应比例配置。
实施例2精液稀释液(冷冻保存用)
本实施例用于说明用于精液冷冻保存的精液稀释液的制备。
1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、hepes试剂，bapta-am，以上药品均为分析纯，蒸馏水，脱脂奶，青霉素，链霉素，灭菌甘油，卵黄。
2、制备方法：以配制200ml为例，先分别称取葡萄糖4.5g、乳糖0.27g、棉子糖0.27g、柠檬酸钠0.054g、柠檬酸钾0.0738g、hepes试剂0.8568g，将其放入锥形瓶中，添加90ml的蒸馏水混合，摇动锥形瓶直至固体溶解；将90ml脱脂奶倒入另一干净锥形瓶中；同时放入高压灭菌锅中消毒，115℃消毒20min。消毒完取出，室温冷却后将两者混合，灭菌甘油10ml、卵黄10ml、青霉素与链霉素各20万iu及50μm终浓度的bapta-am，配成200ml的精液冷冻保存稀释液。其他体积的液体按相应比例配置。
实施例3提高精液低温保存品质的方法
1、人工采集马精液，采精器为cau-h1型采精器。采精前，向假阴道内加入适量(1000-1500ml)的温水(42-45℃)。公马阴茎勃起后，使用苏打水进行清洗，然后使用清水冲洗干净并擦干。临采精前在一次性里衬内(深度为1/3处)均匀地涂抹润滑剂，根据种公马阴茎的长短，粗细调节采精筒的压力。采精器准备妥当后，采精员站在马右后侧，调教师牵引种公马令其爬跨假台马，并将阴茎导入采精筒内，待公马射精后，将采精器集精杯端向下倾斜，同时打开放气阀放气，然后缓慢取下采精器，拿回处理室。
2、精液采集后，使用4-6层脱脂消毒纱布去除胶状物，用精子全自动分析系统(casa，sperm
实施例4提高精液冷冻保存品质的方法
1、人工采集马精液，采精器为cau-h1型采精器。采精前，向假阴道内加入适量(1000-1500ml)的温水(42-45℃)。公马阴茎勃起后，使用苏打水进行清洗，然后使用清水冲洗干净并擦干。临采精前在一次性里衬内(深度为1/3处)均匀地涂抹润滑剂，根据种公马阴茎的长短，粗细调节采精筒的压力。采精器准备妥当后，采精员站在马右后侧，调教师牵引种公马令其爬跨假台马，并将阴茎导入采精筒内，待公马射精后，将采精器集精杯端向下倾斜，同时打开放气阀放气，然后缓慢取下采精器，拿回处理室。
2、精液采集去除胶状物后，检测精液的活率、体积、密度(马精子密度正常为150-300×106个/ml)。低速离心(400g，10min)弃上清。精液的稀释倍数根据其密度及输精要求来确定，要求冷冻保存液稀释后精子密度不少于50*106/ml，分装到0.25ml或0.50ml塑料细管后，脱脂棉包裹。在4℃预平衡2-4小时，将细管放置在液氮液面上5cm处的铜网架上，液氮蒸汽熏蒸15-20min(降温速率大约为-70℃/min)，直接投入液氮保存。
实验例1
本实验例用于说明精液稀释液中bapta-am的浓度对低温保存的精液品质的影响。
1、精液采集
健康7岁阿拉伯公马，5岁纯血以及10岁蒙古马各一匹，人工采集马精液，采精器为cau-h1型采精器。采精前，向假阴道内加入适量(1000-1500ml)的温水(42-45℃)。公马阴茎勃起后，使用苏打水进行清洗，然后使用清水冲洗干净并擦干。临采精前在一次性里衬内(深度为1/3处)均匀地涂抹润滑剂，根据种公马阴茎的长短，粗细调节采精筒的压力。采精器准备妥当后，采精员站在马右后侧，调 教师牵引种公马令其爬跨假台马，并将阴茎导入采精筒内，待公马射精后，将采精器集精杯端向下倾斜，同时打开放气阀放气，然后缓慢取下采精器，拿回处理室。
2、精液检测
精液采集后，使用4-6层脱脂消毒纱布去除胶状物，记录精液体积；同时，精子全自动分析系统(casa，sperm
3、精液低温保存
根据采集精液中精子总数，用含有不同浓度的bapta-am的精液稀释液(低温保存用)37℃预热后对精液进行稀释。精液的稀释倍数根据其密度及输精要求来确定。正常范围内，马精子密度为150-300×106个/ml，人工授精时要求的活精子数最少为250-500×106个。实际操作中，1单位体积精液离心后可使用1-4倍体积的37℃精液稀释液稀释，之后用5cm厚的脱脂棉包裹严密，放置于4度低温保存。过度的精液稀释会造成精子内的多种离子渗出，使得精子质膜的通透性发生改变影响精子的生存。定时检测不同保存时间(24h，48h，72h，96h，120h)的精子活力。检测使用精子全自动分析系统(casa，sperm
表1不同bapat-am浓度对低温保存不同时间精液活率的影响
注：对同一时间内的6种稀释液的保存效果进行对比；同一保存时间里上标小写
字母不同者表示差异显著(p<0.05)。
结果发现，在精液低温保存24h后，50μm浓度的bapta-am组和对照组在相同保存时间内相比，精液的保存活率有显著提高。且相较其他浓度的bapta-am组，精液的保存活率也有显著的优势。
需要说明的是，本实验例所使用的含有不同浓度的bapta-am的精液稀释液(低温保存用)，为在实施例1的基础上，仅调整bapta-am浓度得到的精液稀释液(低温保存用)。
实验例2
本实验例用于说明精液稀释液中bapta-am的浓度对冷冻保存的精液品质的影响。
本实验例中的精液采集和精液检测同实验例1，不同之处在于，本实验例对精液进行冷冻保存并解冻，以探究精液稀释液中bapta-am的浓度对精液品质的影响。
具体操作如下：
1、根据采集精液中精子总数，用含有不同浓度的bapta-am的精液稀释液(冷冻保存用)37℃预热后对精液进行稀释。精液的稀释倍数根据其密度及输精要求来确定，要求精子冷冻保存液稀释后密度不少于50*106/ml，分装到0.25ml或0.50ml塑料细管后，脱脂棉包裹。在4℃预平衡2-4小时，将细管放置在液氮液面上5cm处的铜网架上液氮蒸汽熏蒸15-20min(降温速率大约为-70℃/min)，直接投入液氮保存。
保存大于1周后，将冷冻的塑料细管从液氮中取出后，投入38℃水浴解冻1min。将塑料细管中的精液取出，用精子全自动分析系统(casa，sperm
表2不同浓度bapta-am对精液活率的影响
注：总活力(tm％)，非直线运动率(lm％)，直线前进运动率(pm％)，平均速度(vapμms-1)，曲线速度(vclμms-1)，直线速度(vslμms-1)，线性指数(lin＝[vsl/vcl]x100％)。同行数据中不同字母上标示显差异显著(p<0.05)。
与对照组相比，精液稀释液中添加5μm，25μm，50μm和100μmbapta-am能明显提高冻精解冻后精子的总活力和直线前进运动精子的百分率(p<0.05)；vcl，vap，vsl，lin在200μm钙离子抑制剂时呈现出下降趋势；在50μm时，效果最佳；随着浓度升高(200μm钙离子抑制剂)效果逐渐减弱，但依然高于对照组(表2)。
2、利用sybr-14/pi荧光染色检测冻精细胞膜变化：
将精液标本用pbs(0.01mol/l，ph7.4)洗涤2次后300g离心5min。pbs悬浮精子，调整精子密度为1×106个/ml。sybr-14贮存液于dmso中稀释50倍，取5μl稀释液加入1ml精子悬浮液中(sybr-14终浓度为100nmol/l)，振荡后在36℃恒温箱中避光孵育10min。之后用pbs洗涤1次除去游离的多余染料，然后用pbs重悬，加入5μlpi(终浓度为12mol/l)，振荡后36℃恒温箱避光孵育10min，上fcm检测。
应用cellquest软件获取和分析数据，前向散射光(fsc)和侧向散射光(ssc)对数放大设门，荧光通道fl1(绿)和fl3(红)对数放大，检测每个精子sybr-14和pi的荧光强度，每份悬液标本获取10000个精子。sybr-14+/pi-表示质膜完整的精子，sybr-14-/pi+表示质膜破损并已坏死的精子，sybr-14+/pi+表示正处于将要死亡的过渡状态的精子。
表3不同精液稀释液对解冻后精子活率及质膜完整性的影响
注：sybr-14+/pi-表示质膜完整的精子，sybr-14-/pi+表示质膜破损并已坏死的精子，sybr-14+/pi+表示正处于将要死亡的过渡状态的精子。
结果发现，精液解冻后，50μm浓度的bapta-am组与对照组相比，精子质膜完整性有明显提高且差异显著(表3)。
3、精子三磷酸腺苷(atp)水平检测：
atp作为最重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用。atp水平的改变，会影响细胞的功能。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，atp水平会下降。通常atp水平的下降表明线粒体的功能受损或下降，在细胞凋亡时atp水平的下降通常和线粒体的膜电位下降同时发生。具体操作步骤参考碧云天atp检测试剂盒。
表4不同精液精液精解冻后atp含量变化
注：上标小写字母不同者表示与对照组相比，差异显著(p<0.05)。
结果发现，精液解冻后，50μm浓度的bapta-am组与冷冻对照相比，精液atp含量显著提高，同时，明显高于其他实验组(表4)。
需要说明的是，本实验例所使用的含有不同浓度的bapta-am的精液稀释液(冷冻保存用)，为在实施例2的基础上，仅调整bapta-am浓度得到的精液稀释液(冷冻保存用)。
实验例3
本实验例用于说明本发明所述的精液稀释液中各组分及其含量的优化。
本实验例提供8个对比例，分别为：
对比例1：将实施例1中的每200ml低温保存液中将乳糖替换为同为二糖的海藻糖，添加含量不变，0.300g。
对比例2-4：将实施例1中的每200ml低温保存液配置中的乳糖含量，由0.300g改变为0.100g，0.200g，0.400g。
对比例5：将实施例1中的冷冻保存液中的卵黄替换为卵黄的类似物大豆卵磷脂。
对比例6-8：将实施例1中的每200ml低温保存液中5％甘油量换为10％，7.5％，2.5％。
将以上8个对比例与实施例1，在同样操作条件下按照实验例1的基本操作进行，所有实验结果6次独立重复，最后用spss软件进行统计分析(见表5，6，7，8)。
表5海藻糖替换乳糖对精液低温保存活率影响
注：精液活率乳糖组和海藻糖组差异不显著(p>0.05)
表5结果表明，在本实验例1中低温保存液质量相同浓度的海藻糖替换乳糖，随着保存时间的延长，两者精子活率并无明显差别。
表6不同浓度乳糖含量对精液低温保存时间活率的影响
注：对同一时间内的4种不同乳糖含量稀释液的保存效果进行对比；同一保存时间里上标小写字母不同者表示差异显著(p<0.05)。
表6结果表明，不同浓度乳糖含量对精液低温保存时间活率有显著影响。在本实验例1中每200ml低温保存液中添加0.300g乳糖，随着保存时间的延长，两者精子活率优于其他添加组。
表7冷冻保存液中卵黄替换物大豆卵磷脂
注：总活力(tm％)，非直线运动率(lm％)，直线前进运动率(pm％)，平均速度(vapμms-1)，曲线速度(vclμms-1)，直线速度(vslμms-1)，线性指数(lin＝[vsl/vcl]x100％)。同行数据中不同字母上标示显差异显著(p<0.05)。
表7结果表明，实施例1中，冷冻保存液的卵黄替换为卵黄类似物大豆卵磷脂。随着保存时间的延长，精子活率及直线前进运动率明显差于卵黄组。
表8冷冻保存液中甘油含量变化对冻精影响
注：总活力(tm％)，非直线运动率(lm％)，直线前进运动率(pm％)，平均速度(vapμms-1)，曲线速度(vclμms-1)，直线速度(vslμms-1)，线性指数(lin＝[vsl/vcl]x100％)。同行数据中不同字母上标示显差异显著(p<0.05)。
表8结果表明甘油浓度对精子解冻后活力有极显著影响。2.5％5.0％，7.5％甘油组解冻后精子活率差异不显著(p>0.05)；5.0％，7.5％甘油浓度添加与2.5％、10％甘油浓度添加组相比，在解冻后直线前进率高于后者且差异显著(p<0.05)，5.0％组出现了最高的直线前进运动率。
综上所述，本发明所提供的精液稀释液通过对所含成分的选择和配比的精确控制，相较对比例实现了更好的精液保存效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。