本发明涉及细胞生物技术领域，涉及用于保藏干细胞的冻存液，特别是指用于保藏脐带间充质干细胞的冻存液。
背景技术：
干细胞是一类具有自我复制能力及多向分化潜能的未分化或低分化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。
间充质干细胞以一种多能干细胞，是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点，具有较高的临床应用价值。
脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中昀一种多能干细胞。从人脐带中分离出的脐带间充质干细胞，其细胞含量和增殖能力均优于骨髓间充质干细胞，并且免疫原性比骨髓间充质干细胞低，此外还具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此在间充质干细胞中具有更高的临床应用价值。
在实际临床应用中，脐带间充质干细胞的足够数量是保证干细胞治疗的必要因素。在体外对脐带间充质干细胞进行扩增是增加脐带间充质干细胞的数量的必要途径。但是，目前脐带间充质干细胞只能在体外传代15-20代，并且传代后3天以上才能达到80%以上的融合度，此外在传代15代以后还会出现丢失分化潜能的现象。因此，现有的培养脐带间充质干细胞的方法存在扩增能力差的缺陷。此外，脐带间充质干细胞在冻存以后，扩增能力会出现下降。
技术实现要素：
本发明的目的是克服脐带间充质干细胞在冻存以后，扩增能力会出现下降的缺陷，提供一种用于保藏干细胞的冻存液。
本发明的发明人发现，通过在基础培养基中添加特定的抗体和atp，能够大幅度地提高脐带间充质干细胞的扩增能力，并且，在冻存液中也添加特定的抗体和atp，能够大幅度地提高冻存后的脐带间充质干细脆的扩增能力，由此得到了本发明。
一方面，本发明提供了一种用于保藏干细胞的冻存液，该冻存液由二甲基亚砜和生长培养基混合得到，二甲基亚砜和所述生长培养基的体积比为(0.05-0.4)：1；所述生长培养基含有基础培养基和添加剂，所述添加剂含有抗人血管内皮生长因子的抗体、抗人类表皮生长因子受体1的抗体、抗人类表皮生长因子受体2的抗体和鸟苷-5-三磷酸三钠盐。
通过上述技术方案，本发明能够大幅度地提升冻存后的脐带间充质干细胞在体外的扩增能力。例如，本发明能够将冻存后的脐带间充质干细胞的体外传代数提高到25-40代，并且传代后40-60小时内能达到80%以上的融合度，此外在传代20代以后也不会出现丢失分化潜能的现象。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。但并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
本发明实施列提供了一种用于保藏干细胞的冻存液，该冻存液由二甲基亚砜和生长培养基混合得到，二甲基亚砜和所述生长培养基的体积比为(0.05-0.4)：1；所述生长培养基含有基础培养基和添加剂，所述添加剂含有抗人血管内皮生长因子的抗体、抗人类表皮生长因子受体1的抗体、抗人类表皮生长因子受体2的抗体和鸟苷-5-三磷酸三钠盐。其中：人血管内皮生长因子(humanvascularendothelialgrowthfactor，hvegf)是指ncbi中基因登记号(ncbigeneid)为7422的基因的翻译产物，其官方全称(officialfullname)为血管内皮生长因子a(vascularendothelialgrowthfactora，vegfa)．其常见的别称还包括vpf、vegf或mvcd1。人类表皮生长因子受体l(humanepidermalgrowthfactorreceptorl，herl)是指ncbi中基因登记号(ncbigene工d)为1956的基因的翻译产物，其官方全称(officialfullname)为表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)，其常见的别称还包括egfr、erbb、mena、erbb1或pig61。人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，her2)是指ncbi中基因登记号(ncbigene工d)为2064的基因的翻译产物，其官方全称(officialfullname)为v-erb-b2鸟成红细胞白血病病毒癌基因同源体2(v-erb-b2avianerythroblasticleukemiaviraloncogenehomolog2)，其常见的别称还包括neu.ngl.tkrl.cd340.her-2.mln19或her-2/neu。
根据本发明实施列提供的冻存液，其中，所述抗人血管内皮生长因子的抗体的含量可以为0.01-0.2ng/ml，所述抗人类表皮生长因子受体1的抗体的含量可以为0.01-0.ing/ml，所述抗人类表皮生长因子受体2的抗体的含量可以为0.05-0.4ng/ml；鸟苷-5-三磷酸三钠盐的含量可以为0.2-4ng/ml。
根据本发明的优选实施方式，抗人血管内皮生长因子的抗体的含量为0.05-0.ing/ml，抗入类表皮生长因子受体1的抗体的含量为0.03-0.08ng/ml，抗人类表皮生长因子受体2的抗体的含量为0.1-0.2ng/ml；鸟苷-5-三磷酸三钠盐的含量为0.5-2ng/ml。在该优选实施方式中，本发明的生长培养基能够进一步增强对脐带间充质干细胞的扩增效果。其中，所述抗人血管内皮生长因子的抗体只要能特异性地与人血管内皮生长因子结合并阻碍其生物学功能的行使即可；所述抗人类表皮生长因子受体1的抗体只要能特异性地与人类表皮生长因子受体1结合并阻碍其生物学功能的行使即可；所述抗人类表皮生长因子受体2的抗体只要能特异性地与人类表皮生长因子受体结合并阻碍其生物学功能的行使即可。上述抗体可通过商购得到。
根据本发明的优选实施方式，所述抗人血管内皮生长因子的抗体为贝伐单抗；所述抗人类表皮生长因子受体1的抗体为西妥昔单抗，所述抗人类表皮生长因子受体2的抗体为曲妥珠单抗。其中，所述贝伐单抗的英文名为bevacizumab，商品名为阿瓦斯汀(avastin)；所述西妥昔单抗的英文名为cetuximab，商品名为爱必妥(erbitux)；所述曲妥珠单抗英文名为trastuzumab，商品名为赫赛汀(herceptin)。
本发明实施列提供的冻存液，其中基础培养基没有特别的要求，可以为常规使用的各种能够培养哺乳动物的培养基，例如，所述基础培养基包括但不限于dmem培养基、mem培养基、imem培养基和rpmi1640培养基中的至少一种。上述基础培养基可以通过商购得到，例如可以从gibco或hyclone公司购买得到。例如，根据gibco的商品目录，dmem培养基的商品号为11965，mem培养基的商品号为11095，imem培养基的商品号为21700，rpmi1640培养基的商品号为11875。
本发明实施列的生长培养基可以为含血清的培养基，也可以为不含血清的培养基。为了加速脐带间充质干细胞的贴壁，优选地，所述生长培养基还含有5-20体积%的血清。其中，所述血清可以包括胎牛血清、新生牛血清和小牛血清中的至少一种，更优选为胎牛血清。
本发明实施列中如上所述的生长培养基能够促进脐带间充质干细胞较快地进行扩增，相应地缩短传代周期，因此优选情况下，培养的传代周期为40-60小时。能够促进脐带间充质干细胞延长传代次数，优选情况下，优选地，培养的传代的代数为25-40代。