针对间变性淋巴瘤激酶的单克隆抗体1a4及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学领域。具体地，本发明涉及特异性结合间变性淋巴瘤激酶（ALK) 的单克隆抗体1A4,产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述单克隆抗体的使用方法，以及包 含所述单克隆抗体的组合物和试剂盒。 发明背景
[0002] 肺癌是世界上最常见的癌症，每年新诊断出1400万新病例（P. Boyle，World Cancer Report2008 (World Health Organization, 2009))。随着人类分子遗传学的发展， 已经鉴别出若干肺癌的致癌驱动突变，且其中一部分已经用作个体化医疗的生物标志物及 靶点，例如 EGFR 突变（Rosell et al.，Lancet382，p720-731, 2013)。
[0003] 最近的遗传学研究显示大于6%的非小细胞肺癌患者具有间变性淋巴瘤激酶 (ALK)基因易位（Camidge&Doebele,Nat Rev Clin 0此〇19，？268-277,2012)。六1^易位最初 是在白血病中鉴别到，然而随后在若干实体瘤中也检测出ALK易位（Chiarle et al. ,Nat Rev Cancer8, pi 1-23, 2008)。正常时，ALK只在胚胎发生时表达且在成人组织中基本上是沉 默的。然而，致癌性易位导致表达含有C-端自活化的ALK激酶结构域的融合蛋白（Chiarle et al.，NatRev Cancer8，pll-23,2008)。在不同的癌症类型中已经鉴别到多种的5'端ALK 融合配对物，在肺癌中主要是EML4。已经报道了至少8种不同的EML4-ALK融合模式。
[0004] 临床上，被筛查出具有ALK易位的患者可以使用ALK激酶的ATP竞争性抑制剂克 唑替尼进行靶向性治疗（Camidge&Doebele，Nat Rev Clin0ncol9，p268-277,2012)。目前 FDA批准的筛查ALK易位的方法基于原位杂交荧光技术（FISH)。然而，FISH需要对实验过 程的精确标定以及需要高度熟练的技术人员以进行准确的定量。在许多病理学实验室中， FISH并不是常规测试。另一种检测ALK易位的方法是定量PCR。定量PCR是检测EML4-ALK 融合模式的常规方法。然而这样的定量PCR平台是专门化的平台，并不适合于所有的病 理实验室。而且，大部分常见定量PCR检测ALK的方法都限于EML4-ALK融合（Soda et al.，Nature448, p561-566, 2007)，而其它的例如 Klf5B-ALK 和 KLCl-ALK 等则无法检测。
[0005] 免疫组化（IHC)是目前在病理实验室中最广泛使用的检测方法，主要得益于其 低廉的成本和简便的操作。已报道ALK易位导致在肺癌样品中存在功能性融合蛋白的表 达，暗示可以使用针对ALK的抗体通过免疫组化（IHC)来筛查ALK易位（Thunnissen et al.，Virchows Arch461，p245-257, 2012)。然而，ALK易位造成的ALK融合蛋白在肺癌中的 表达远远低于其在白血病中的表达，因此通过IHC检测肺癌中的ALK融合蛋白需要高灵敏 度的抗体（Mino-Kenudson et al·，Clin Cancer Resl6，pl561_1571, 2010)。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种高灵敏度的抗ALK小鼠单克隆抗体1A4,其可用于通过免疫组 化检测癌症如肺癌中的ALK易位。
[0007] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织 培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常 规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0008] 如本文所用，"抗体"指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全 部合成（例如重组）产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免 疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构 域（抗体结合位点）同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段，例 如抗ALK抗体片段。如本文所用，因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性 抗体（例如双特异性抗体）、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体 片段，例如但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab'） 2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFV)、 Fd片段、Fd'片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型（抗Id)抗体、或者 上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型（例如，IgG、 IgM、IgD、IgE、IgA 和 IgY)、任何类别（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亚类 (例如，IgG2a和IgG2b)的成员。
[0009] 如本文所用，抗体的"抗体片段"或"抗原结合片段"指全长抗体的任何部分，其 少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区（例如一个或多个CDR和/或 一个或多个抗体结合位点），并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异 性结合能力；抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的 衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、 ? &13'、？(&13'）2、单链？以8〇?0、？1(18?1双抗体、？(1和？(1'片段以及其他片段，包括修饰的 片段（参见，例如，Methods in Molecular Biology, Vol207:Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2〇〇3); Chapterl ;p3-25，Kipriyanov)。所述片 段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含 至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。
[0010] 如本文所用，抗原结合片段指包含抗原结合部分的抗体片段，其与所述抗体片段 所来源的抗体结合相同的抗原。如本文所用，抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插 入抗体框架（例如通过置换相应区域）时获得免疫特异性地结合（即表现出至少或至少 约IO7-IO8M- 1的Ka)抗原的抗体。抗原结合片段包括抗体片段，例如Fab片段、Fab'片段、 F(ab'）2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd'片段、单链Fv(scFv)、单链 Fab (scFab)，并且还包括其他片段，例如包含⑶R的片段，以及免疫特异性地结合抗原的多 肽或在插入抗体框架时获得免疫特异性地结合抗原的抗体的多肽。
[0011] 如本文所用，"单克隆抗体"指相同抗体的群体，表示单克隆抗体的群体中的每个 单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性是与抗体的多克隆群体的特性相比，所 述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方 法来制备（Smith et al. (2004) J. Clin. Pathol. 57, 912-917;和 Nelson et al·，J Clin Pathol (2000)，53, 111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与 骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还 可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主 细胞的克隆群体制备单克隆抗体。
[0012] 如本文所用，全长抗体或完整抗体是具有两条全长重链（例如VH-CH1-C H2-CH3或 VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链（VCJ和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天 然产生的人抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
[0013] 如本文所用，Fv抗体片段由通过非共价相互作用连接的一个可变重链结构域（Vh) 和一个可变轻链（VJ结构域组成。dsFv指具有稳定V H_'对的工程化分子间二硫键的Fv。 Fd片段是包含抗体重链的可变结构域（Vh)和一个恒定区结构域（ChI)的抗体片段。Fab片 段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的片段，或者例如通过重组方法合成产生的 具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链（包含\和CJ和另一条链，所述另一条链包含 重链的可变结构域（V h)和重链的一个恒定区结构域（ChI)。F(ab'）