抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体3A-scFv及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，具体涉及抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体 3A-scFv，及其应用，在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒药物方面、检测B型肉毒毒素酶方面的 应用，还涉及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体的底物。
【背景技术】
[0002] 肉毒毒素可导致人及动物肉毒中毒，其感染剂量极低，从灵长类动物实验中得出， 最低致死剂量（LD50)为lng/kg，因此，它已被美国疾病控制和预防中心指定为对人类的威 胁类似于炭疽的生物武器。导致肉毒中毒的原因大致分为四个类型，一、成人肉毒中毒。二、 婴儿感染性肉毒中毒。三、伤口感染性肉毒中毒。
[0003] 肉毒毒素是肉毒梭菌在自然状态下或者是在培养基中形成，通过细菌裂解释放到 环境或培养液中，这种形态的毒素被称为前体毒素，其分子量范围在300 kDa到900 kDa。 前体毒素通常以复合体的形式存在，由神经毒素（Bont)，由一个或多个能够包围和保护毒 素的非毒性蛋白组成，包括血凝素（HA)，非毒素非血凝素（NTNH)。临床上所说的肉毒毒素 通常指具有神经毒性作用的神经毒素部分。
[0004] 肉毒毒素根据其抗原性的不同，共存在七种血清型（A、B、C、D、E、F、G、），尽管七种 血清型的肉毒毒素组成成分与它的作用机制略有差别，但是它们有着相近的分子量和相似 结构。成熟肉毒毒素均由约150 kDa的单链多肽组成，蛋白质成熟时通过细菌介导的蛋白 酶将150kDa的单链多肽切割裂解成两个不相等的多肽片段，两个片段由一个二硫键连接， 形成一个分子量为50kDa的轻链片段（LC)和一个分子量为IOOkDa的重链片段（HC)。其中 轻链有一个催化功能域，重链包含分子量均为50kDa的两个功能域，N端部分为跨膜域，C 端部分为神经节苷脂结合域。单独的轻链和重链均无毒性，只有双链才具有生物学毒性。
[0005] 轻链由细胞内毒素蛋白组成，具有锌离子依赖内切酶活性，可抑制神经递质的释 放。肉毒毒素的活性区埋藏（~20 A深)于轻链中，表面负电荷，可通过一个通道获得。梭状 神经毒素的活性位点包括一个单一的锌原子，这个锌原子历来被认为有功能，但是不起结 构性作用。可以通过用金属螯合剂去除锌，但是通过在二级结构上加入游离的锌原子来重 新获得锌，毒素与底物结合的能力几乎不变，但轻链的生物学活性却大大的降低了，只相当 于原来的30%。位于轻链中心有一个高度保守的锌结合模块HExxH (X是任意的氨基酸)序 列。HExxH序列中含有一个由3个组氨酸整合的锌离子，并对突触泡膜蛋白质具有特异性 蛋白水解活性，这个催化位点位于蛋白质表面较深的裂缝中。
[0006] 在人类肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占据最重要的地位，其中A型肉 毒毒素轻链上的His 222，Glu223和His226残基共同组成了锌结合模块HExxH序列的一 部分，并且在协调活性区锌（His 222和His226)和一个水分子（Glu223残基）的作用机制 中起了直接的作用。Glu261是协调锌的第三配体。甚至有人认为A型肉毒毒素的催化机 理与嗜热菌蛋白酶是相似的，这是因为基于结构和序列相似的基础上，他们的活性位点也 是相似的。从Glu223到Asp的突变使得活性几乎全部失去，去除His226使A型肉毒毒素 失去了催化活性。通过对肉毒毒素结构分析表明，A、B型肉毒毒素中与作用机制相关的关 键氨基酸残基是相同的。与突触泡蛋白结合的B型肉毒毒素的晶体结构表明，Arg369和 Tyr372残基位于接近被毒素裂解的肽键。肉毒毒素中中和残基的突变使催化速度常数明显 降低，但是不影响锌结合和底物结合，人们提出，这些残基在过渡态稳定中发挥了作用。
[0007] 另外，在LC活性中心还有一些氨基酸残基，如Phe266、Glu350Arg363和Tyr366。 它们的功能主要是维持和稳定轻链活性中心的结构和/或它与被结合底物的相对位置，以 此保证轻链最佳的酶解能力。
[0008] LC通过二硫键与HC的N端连接。在二硫键存在的状态下，毒素重链HN结构域形 成一条loop结构，将深陷于轻链表面裂缝中的Zn 2+催化部位遮蔽住，从而不表现酶活性。在 双链毒素进入神经细胞后，二硫键被还原，释放出的轻链才能表现锌离子内肽酶活性，催化 部位能够容纳底物16个氨基酸残基。催化部位的锌离子除同4个组氨酸残基的咪唑环、1 个结合于保守谷氨酸的水分子形成配位键外，还与另一分子的谷氨酸羧基形成配位键，1个 色氨酸分子很可能也参与锌离子的配位。毒素轻链的这种独特锌离子配位形式、空间结构 与其他所有已知的金属蛋白酶的三维结构都不同，应当属于一个新型的金属蛋白酶家族。
[0009] 肉毒毒素的致病机理 1、靶细胞的识别与结合 前体毒素进入胃肠道，在消化过程中，非毒素组分对神经毒素起到保护作用，使其不会 受到各种消化酶和胃酸的侵蚀。由于分子量过大，毒素分子不是以扩散的方式，而是以"内 凹"和细胞摄入的方式通过肠粘膜上皮屏障，而不会破坏胃肠道。然后进入小肠中，在小肠 的微碱性环境下，前提毒素中的神经毒素解离出来，进入血液及淋巴循环，在运动神经和交 感神经处发挥其毒性作用。尽管神经毒素可侵入不同的组织和器官，但不能穿透血脑屏 障，其惟一的亲和靶点是外周胆碱能神经末梢。在胆碱能神经末梢，毒素的轻链能够抑制 神经递质乙酰胆碱在神经肌肉接头处的释放，导致肌肉麻痹。在这一毒性作用过程中，神经 毒素的各功能域都有参与，具体的过程可分为三个阶段。
[0010] 靶细胞的结合与内化 在靶细胞的识别与结合这一过程中，肉毒毒素重链的结合域发挥了作用。结合域能够 识别胆碱能神经末梢，并与其发生特异性结合。结合域结合到运动神经元的神经节苷脂和 位于末端神经细胞膜表面小结上的蛋白受体，特别是具有亲和力的GDlb，GTlb和GQlb类 神经节苷脂。然后由含有唾液酸的寡糖组成的神经节苷脂连接到神经酰胺。通过对神经节 苷脂分布及对其亲和结合力的研宄，可以确定，神经节苷脂不是唯一能促进肉毒毒素结合 的分子，而双受体模型的提出表明，在发生内化作用前，肉毒毒素就已经结合到了蛋白受体 上。尽管有一些证据表明，突触结合蛋白可能参与了 A、B和E型的内化作用，但是梭菌属家 族每一个成员的受体，还没有完全确定。每个毒素与其蛋白共受体都是特异性同源的，B型 肉毒毒素与唾液酸乳糖的混合物就与肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神经毒素与神经节苷 脂结合的一个〃锁和钥匙〃原理。这个观察成功说明了一个观点，那就是神经节苷脂结合 使肉毒毒素靠近蛋白受体，促进了毒素的识别和内化。
[0011] 一旦结合到神经元表面，母体分子裂解