A型肉毒毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白与应用的制作方法

专利名称：A型肉毒毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个A型肉毒毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白与其在制备A型肉毒毒素疫苗中的应用。
背景技术：
肉毒毒素(Botulinum Toxin，BoNT)是目前已知毒力最强的蛋白，1.0g肉毒毒素结晶物足以杀死100万人，由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)在厌氧环境中产生的外毒素有7个血清型(A-G)，其中，A、B型肉毒毒素是致人中毒的常见型，E、F型偶尔引起食物中毒流行，C、D型则仅引起动物、禽类中毒，G型引起中毒的报道较少。临床观察表明，A型肉毒毒素相比其它型可引起更严重的中毒症状，并导致更高的死亡率。肉毒毒素中毒在人群中发病机率小，但其毒性大，致死率高，对公共卫生安全危害极大，必须引起人们的高度重视。由于产生肉毒毒素的肉毒梭菌在自然界广泛存在，并且其芽孢对外界环境具有较强的抵抗力，肉毒毒素中毒仍然是一个十分严重的公共卫生问题。近年，我国许多地区均发生数例肉毒中毒的疫情，甚至有群体肉毒毒素中毒事件发生。尤其是A型肉毒毒素还被数十个国家(如前苏联和伊拉克)用于制造生物武器，同时其也可被恐怖组织利用以制造生物恐怖。因此，进行肉毒毒素的防治研究无论是对国家生物安全，公共卫生安全，还是对人们的生命健康安全都具有重要的实际意义。
目前，类毒素疫苗(PBT)由于存在许多缺点，如工艺复杂、有危险性、保护性不好、免疫周期长，无法进行推广应用，且未能获得FDA批准，因此，研制高效、安全、方便的新型疫苗势在必行。肉毒毒素由二硫键连接的两条链组成(轻链50KD、重链100KD)，轻链是BoNT的毒性成分，而重链是结合神经细胞的毒素受体，是保护性结合和进入神经细胞所必需的，但其本身不具神经毒性。重链的50KDa C末端(简称为Hc)参与神经特异性结合，免疫学实验已证明此受体区是保护性抗原。肉毒毒素新型疫苗研究主要集中在重组蛋白Hc亚单位疫苗和核酸疫苗两个方向，此新型疫苗较类毒素疫苗有以下优点费用低，生产过程较安全，多次免疫后可以激发机体产生较强的免疫应答。
在大肠杆菌中有效地表达Hc片段能够保护小鼠抵御高剂量的肉毒毒素攻击，具有良好的免疫原性。但惟一不尽如人意之处是以前无论是原始的，还是优化序列人工合成的A型肉毒毒素Hc基因在大肠杆菌中重组蛋白的表达量较低，常常为包涵体，并且产物不稳定，这在一定程度上限制了它的使用。为了解决重组蛋白Hc的表达问题，研究人员尝试利用酵母系统中高效表达A型肉毒毒素重组蛋白Hc并获得成功，人工合成的A型肉毒毒素Hc基因已经在酵母系统中得到了高效表达(Smith LA.，Toxicon，1998，361539-1548)，此外，用纯化的重组蛋白Hc免疫动物(小鼠和非人类灵长类动物)可诱导产生针对高剂量的肉毒毒素的保护性免疫反应。下一个里程碑是以其为候选Hc亚单位疫苗进行临床试验。最近，有两篇文献报道原始的A型肉毒毒素Hc基因在大肠杆菌中得到了有效地可溶性表达，其纯化的表达水平为10-20mg/L，所用的原核表达载体为pET28，表达条件为在25℃或16℃下培养20小时或过夜(MahmoodTavallaie，et al，FEBS，2004，572299-306；Baldwin MR，et al，Infection andImmunity，2005，73(10)6998-7005)。天然的A型肉毒毒素受体结合区Hc片段基因序列A和T含量高达76％，并且经常出现连续的A和T串，另外，遍布整个基因序列有大量的稀有密码子出现，使得该天然的基因在异种宿主细胞中的表达存在一定困难并且表达产物不稳定，产量极低。本发明的发明人曾尝试直接PCR扩增原始的BoNT/A Hc基因，再将其克隆入原核表达载体并进行表达，结果Hc的表达水平很低并且为包涵体，与前人的实验结果一致(LaPenotiere HF，et al.，Toxicon，1995，331383-1386)。
肉毒毒素的新型疫苗发展的另一个研究方向是研究肉毒毒素核酸疫苗。DNA疫苗优于类毒素疫苗和亚单位疫苗的主要优点是，操作简便灵活、生产周期短、产品易于纯化并方便储藏。生产DNA疫苗不需要培养病原菌，较类毒素疫苗具有更高的生产安全性。抗原蛋白在免疫动物的细胞中产生，不需要进行蛋白纯化，较亚单位疫苗使用更加方便。有两篇文献报道用含有A型肉毒毒素Hc基因的传统DNA载体免疫小鼠后，能够产生对A型肉毒毒素的保护作用(Jennifer Clayton，et al.，Vaccine，2000，181855-1862；Shyu RH，et al.，J Biomed Sci，2000，751-57)。但是，DNA疫苗免疫后产生的抗体水平较低，其相应的保护作用不高。复制型核酸疫苗是一种新型疫苗，它具有诸多优点，如仍具有复制子载体的全部特点，DNA制备简单、成本低，疫苗更加安全，不像重组病毒颗粒疫苗存在病毒污染问题，也不像传统DNA疫苗，可能发生DNA整合到基因组，它是“自杀性”DNA疫苗，具有良好的安全性。到目前为止，利用基于DNA的SFV复制子研制A型肉毒毒素新型核酸疫苗还未见报道。

发明内容
本发明的目的是提供一个可激发机体对A型肉毒毒素产生免疫保护作用的A型肉毒毒素受体结合区Hc基因。
本发明所提供的A型肉毒毒素受体结合区Hc基因，名称为HcA，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激发机体对A型肉毒毒素产生免疫保护作用的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO1由1287个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1287碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的蛋白质。
所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA编码的蛋白(HcA)，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)将序列表中SEQ ID NO2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有激发机体对A型肉毒毒素产生免疫保护作用的蛋白质。
序列表中的SEQ ID NO2由429个氨基酸残基组成。
所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。
含有本发明基因HcA的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
含有本发明基因HcA的表达载体包括原核表达载体、传统真核表达载体及基于DNA的复制子载体等。
所述重组原核表达载体中A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA的上游还可连接有硫氧还蛋白基因Trx(来源于Novagen公司的pET-32a(+)载体中的Trx基因序列，位于该载体的自5’端第366-692碱基处，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO8，编码109个氨基酸残基)。
用于构建含有本发明A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA的重组原核表达载体的出发载体为任意一种原核表达载体，如pET-22b(+)、pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等。
以pET-22b(+)为出发载体，构建的含有A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA和硫氧还蛋白基因Trx的重组原核表达载体为pTIG-Trx-Hc。
用于构建含有本发明A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA的传统真核表达载体的出发载体为任意一种真核表达载体，如pcDNA(pcDNA3.1(+)等)、pCMV5、pSilence1.0-U6(Ambion，Austin，TX，USA)、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo(购于Promega公司)、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5等。
以pcDNA3.1(+)为出发载体，构建的含有A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA的重组真核表达载体为pcDNASHc。
为使HcA分泌到胞外，所述基于DNA的复制子表达载体中A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA的5’端还可连接有分泌信号肽(Murine Ig□-chain V-J2-C signalpeptide，简称S)编码序列(来源于pSecTag，Invitrogen公司)，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO6，编码序列表中SEQ ID NO7的氨基酸序列。
用于构建含有本发明A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA的复制子表达载体的出发载体为任意一种复制子表达载体，如pSCAR(余云舟等，生物化学与生物物理进展，2006，33(1)87-94)。
以pSCAR为出发载体，构建的含有A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA和分泌信号肽S编码序列的复制子表达载体为pSCARSHc。
上述重组表达载体可按照常规方法构建。
扩增HcA中任一片段的引物对也是本发明要保护的。
本发明还提供了一种表达上述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因编码蛋白HcA的方法。
本发明所提供的表达上述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因编码蛋白HcA的方法，是将上述含有A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到A型肉毒毒素受体结合区Hc基因编码蛋白HcA。
所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。
所述大肠杆菌可为E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS或E.coli Top10等。
所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115、KM71(购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(购自美国Invitrogen公司)。
上述重组菌可按照常规方法构建。
培养含有A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度为0.1-1.0mmol/L，优选为0.2mmol/L，诱导温度为16-37℃，优选为30℃，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。
本发明的A型肉毒毒素受体结合区Hc基因可用于制备A型肉毒毒素核酸疫苗，该基因的编码蛋白可用于制备A型肉毒毒素亚单位疫苗。
所述DNA疫苗中的A型肉毒毒素受体结合区Hc基因可存在于基于DNA的复制子表达载体中，其中，以pSCAR为出发载体，构建的含有A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA和分泌信号肽S编码序列的复制子表达载体为pSCARSHc。
需要的时候，以A型肉毒毒素受体结合区Hc基因编码蛋白制备的A型肉毒毒素亚单位疫苗中还可以融入颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一种或多种细胞因子的基因或蛋白质作为分子免疫佐剂。
本发明的疫苗可以制成注射液、干粉针剂或喷雾剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述核酸疫苗和亚单位疫苗的用量可采用药学领域中核酸疫苗和亚单位疫苗的常规剂量，如3-30μg(核酸疫苗)和1-10μg(亚单位疫苗)，并可根据实际情况调整。
本发明提供了一个A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA及其编码蛋白。该基因是根据A型肉毒毒素受体结合区Hc片段的基因序列和氨基酸残基序列优化后得到的，使A和T含量由76％降低至57％，并用大肠杆菌常用的密码子替代稀有密码子，同时兼顾真核细胞常用的密码子，并保证所编码的氨基酸残基序列不变。将上述HcA基因克隆到原核表达载体中构建得到原核表达载体pTIG-Trx-Hc，将其转化大肠杆菌(例如BL21(DE3)等)后培养重组菌，可使A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA在宿主菌中获得了高效可溶性表达，可溶性表达产物占细菌可溶性总量的36％以上，经一步小量纯化可获得30mg/L以上的重组蛋白HcA，用其免疫动物能诱导产生特异性的高滴度ELISA抗体、中和抗体及细胞免疫应答反应，并能对抗A型肉毒毒素的攻击，实验证明，A型肉毒毒素重组蛋白HcA以1μg剂量免疫二次或三次即可保护106LD50A型肉毒毒素的攻击，表明本发明的重组蛋白HcA具有良好的免疫原性，可用于制备A型肉毒毒素亚单位疫苗。此外，针对传统DNA载体免疫后产生的免疫保护力仍不够强的缺点，本发明还将上述基因HcA克隆到基于DNA的SFV复制子载体中构建得到了SFV复制子载体，与所构建的含有HcA的传统真核表达载体pcDNASHc相比，复制子载体可产生更高水平的体液和细胞免疫应答，并且所需免疫剂量更低，该复制子DNA载体能够保护免疫动物免受更高水平的A型肉毒毒素的攻击，可用于制备A型肉毒毒素核酸疫苗。本发明的A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA及其编码蛋白将在制备A型肉毒毒素疫苗中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。


图1为制备抗A型肉毒毒素的亚单位疫苗和核酸疫苗的技术路线2为HcA大肠杆菌BL21(DE3)表达产物的SDS-PAGE检测结果图3为经亲和层析纯化的重组HcA的SDS-PAGE检测结果图4为含HcA的基于DNA的SFV复制子载体pSCARSHc和传统的真核表达载体pcDNASHc的部分结构示意图。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海英俊生物技术有限公司合成。
实施例1、A型肉毒毒素受体结合区Hc基因HcA的获得根据A型肉毒毒素受体结合区Hc片段的基因序列和氨基酸残基序列(BoNT/A，A62，国际标准株，序列号M30196)优化Hc基因，使A和T含量由76％降低至57％，并用大肠杆菌常用的密码子替代稀有密码子，同时兼顾真核细胞常用的密码子，并保证所编码的氨基酸残基序列不变，再根据优化后基因序列设计23对(46条)引物人工合成该基因片段，引物序列如下23条正向引物序列如下(5’-3’端)F1 CGGAATTCACCATGGCTGAATACATCAAGF2 AACATCATCAATACCTCCATCCTGAACCTGCGTTACGAATCCAATCACCTGATCGACCTF3 GTCTCGTTACGCTTCCAAAATCAACATCGGTTCTAAAGTTAACTTCGATCCAATCGACAF4 AGAATCAGATCCAGCTGTTCAATCTGGAATCTTCCAAAATCGAAGTTATCCTGAAGAATF5 GCTATCGTATACAACTCTATGTACGAAAACTTCTCCACCTCCTTCTGGATTCGTATCCCF6 AAAATACTTCAACTCCATCTCTCTGAACAATGAATACACCATCATCAACTGCATGGAAAF7 ACAATTCTGGTTGGAAAGTATCTCTGAACTACGGTGAAATCATCTGGACTCTGCAGGACF8 ACTCAGGAAATCAAACAGCGTGTTGTATTCAAATACTCTCAGATGATCAACATCTCTGAF9 CTACATCAATCGTTGGATCTTCGTTACCATCACCAACAATCGTCTGAATAACTCCAAAAF10 TCTACATCAACGGCCGTCTGATCGACCAGAAACCAATCTCCAATCTGGGTAACATCCACF11 GCTTCTAATAACATCATGTTCAAACTGGACGGTTGCCGTGACACTCACCGTTACATCTGF12 GATCAAATACTTCAATCTGTTCGACAAAGAACTGAACGAAAAAGAAATCAAAGATCTGTF13 ACGACAACCAGTCCAATTCTGGTATCCTGAAAGACTTCTGGGGTGACTACCTGCAGTAC
F14 GACAAACCATACTACATGCTGAATCTGTACGATCCAAACAAATACGTTGACGTCAACAAF15 TGTAGGTATCCGTGGTTACATGTACCTGAAAGGTCCACGTGGTTCTGTTATGACTACCAF16 ACATCTACCTGAACTCTTCCCTGTACCGTGGTACCAAATTCATCATCAAGAAATACGCGF17 TCTGGTAACAAGGACAATATCGTTCGTAACAATGATCGTGTATACATCAATGTTGTAGTF18 TAAGAACAAAGAATACCGTCTGGCTACCAATGCTTCTCAGGCTGGTGTAGAAAAAATCTF19 TGTCTGCTCTGGAAATCCCAGACGTTGGTAATCTGTCTCAGGTAGTTGTAATGAAATCCF20 AAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAATGCAAAATGAATCTGCAGGACAACAATGGTAAF21 CGATATCGGTTTCATCGGTTTCCACCAGTTCAACAATATCGCTAAACTGGTTGCTTCCAF22 ACTGGTACAATCGTCAGATCGAACGTTCCTCTCGTACTCTGGGTTGCTCTTGGGAGTTCF23 ATCCCAGTTGATGACGGTTGGGGTGAACGTCCACTGCATCATCATCATCATCATTAAGCGGCCGCAAGCTTGGG与上述23条正向引物对应的23条反向引物如下(5’-3’端)B1CCCAAGCTTGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCAGTGGB2ACGTTCACCCCAACCGTCATCAACTGGGATGAACTCCCAAGAGCAACCCAGAGTACGAGB3AGGAACGTTCGATCTGACGATTGTACCAGTTGGAAGCAACCAGTTTAGCGATATTGTTGB4AACTGGTGGAAACCGATGAAACCGATATCGTTACCATTGTTGTCCTGCAGATTCATTTTB5GCATTTGTTAGTGATACCCTGGTCGTTCTTGGATTTCATTACAACTACCTGAGACAGATB6TACCAACGTCTGGGATTTCCAGAGCAGACAAGATTTTTTCTACACCAGCCTGAGAAGCAB7TTGGTAGCCAGACGGTATTCTTTGTTCTTAACTACAACATTGATGTATACACGATCATTB8GTTACGAACGATATTGTCCTTGTTACCAGACGCGTATTTCTTGATGATGAATTTGGTACB9CACGGTACAGGGAAGAGTTCAGGTAGATGTTGGTAGTCATAACAGAACCACGTGGACCTB10TTCAGGTACATGTAACCACGGATACCTACATTGTTGACGTCAACGTATTTGTTTGGATCB11GTACAGATTCAGCATGTAGTATGGTTTGTCGTACTGCAGGTAGTCACCCCAGAAGTCTTB12TCAGGATACCAGAATTGGACTGGTTGTCGTACAGATCTTTGATTTCTTTTTCGTTCAGTB13TCTTTGTCGAACAGATTGAAGTATTTGATCCAGATGTAACGGTGAGTGTCACGGCAACCB14GTCCAGTTTGAACATGATGTTATTAGAAGCGTGGATGTTACCCAGATTGGAGATTGGTTB15TCTGGTCGATCAGACGGCCGTTGATGTAGATTTTGGAGTTATTCAGACGATTGTTGGTGB16ATGGTAACGAAGATCCAACGATTGATGTAGTCAGAGATGTTGATCATCTGAGAGTATTTB17GAATACAACACGCTGTTTGATTTCCTGAGTGTCCTGCAGAGTCCAGATGATTTCACCGTB18AGTTCAGAGATACTTTCCAACCAGAATTGTTTTCCATGCAGTTGATGATGGTGTATTCAB19TTGTTCAGAGAGATGGAGTTGAAGTATTTTGGGATACGAATCCAGAAGGAGGTGGAGAAB20GTTTTCGTACATAGAGTTGTATACGATAGCATTCTTCAGGATAACTTCGATTTTGGAAGB21ATTCCAGATTGAACAGCTGGATCTGATTCTTGTCGATTGGATCGAAGTTAACTTTAGAAB22CCGATGTTGATTTTGGAAGCGTAACGAGACAGGTCGATCAGGTGATTGGATTCGTAACGB23CAGGTTCAGGATGGAGGTATTGATGATGTTCTTGATGTATTCAGCCATGGTGAATTCCG。
如图1中的步骤A-C所示，首先，通过人工拼接的方法(重叠延伸PCR)，利用23对引物相互互补将全长序列拼接为三段，分别命名为A、B和C，反应结束后，对A、B和C三种PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回收长度分别约为500bp、400bp和400bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段连接入到T-A载体pGEM-T(Promega公司)中，再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(TIANGEN)，筛选阳性克隆，提质粒，得到分别含有回收片段A、B、C的重组质粒，分别命名为pGEM-T-A、pGEM-T-B、pGEM-T-C，对其进行测序，测序结果表明扩增片段A具有序列表中的SEQ ID NO3的核苷酸序列，由484个碱基组成，编码序列表中SEQ ID NO1中自氨基端第1-161位氨基酸残基；扩增片段B具有序列表中的SEQ ID NO4的核苷酸序列，由413个碱基组成，编码序列表中SEQ ID NO1中自氨基端第162-299位氨基酸残基；扩增片段C具有序列表中的SEQ ID NO5的核苷酸序列，由390个碱基组成，编码序列表中SEQ ID NO1中自氨基端第300-429位氨基酸残基，再将B和C拼接，50μl PCR反应体系为作为模板DNA的片段B和C各0.5μl，pfu Taq 0.5μl，10×PCR缓冲液(含Mg2+)5μl，dNTPs(各25mM)4μl，引物F10和B23各0.5μl，用ddH2O补充反应体系至50μl，PCR反应条件为先95℃3min；然后94℃50s，62℃50s，72℃60s，共25个循环；最后72℃10min，得到片段BC，最后将片段A和片段BC拼接，除模板外，PCR反应体系和反应条件与上述相同，对拼接后获得的目的片段进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度分别为1287bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段连接入到载体pGEM-T中，再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，命名为pGEM-Hc，对其进行测序，测序结果表明目的片段具有序列表中的SEQ ID NO1的核苷酸序列，由1287个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1287位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的蛋白质，位于A型肉毒毒素的868aa-1296aa间，蛋白分子量约为50KD。测序结果表明获得了序列正确的经优化的全长Hc基因，将该基因命名为HcA，其编码蛋白命名为HcA。
实施例2、原核表达载体pTIG-Trx-Hc的构建及重组蛋白HcA在大肠杆菌中的表达与纯化如图1中的步骤D和E所示，用下述方法使HcA在大肠杆菌中获得表达及纯化，得到重组HcA一、原核表达载体pTIG-Trx-Hc的构建硫氧还蛋白(Trx)是参与新生蛋白肽链折叠的辅助蛋白，当重组蛋白HcA与之共表达时，它可促进下游正在折叠的目的蛋白通过异构反应获得正确的折叠，另外，也能够增强胞内蛋白质的二硫键的形成，使表达产物不易形成包涵体，能够以可溶性形式表达，因此用下述方法构建含有Trx基因的HcA基因的原核表达载体1、重组载体pTIG-Trx的构建首先，通过普通PCR方法克隆(以载体pET-32a(+)为模板)硫氧还蛋白基因序列(来源于Novagen公司的pET-32a(+)载体中的Trx基因序列，位于该载体的自5’端第366-692位碱基处，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO8，编码109个氨基酸残基)，然后将获得的Trx基因序列连接入质粒载体pET-22b(+)(Novagen公司)的NdeI和EcoR I酶切位点之间，得到含有Trx基因的重组载体，命名为pTIG-Trx，其多克隆位点的后面具有编码6个组氨酸的标签序列(pET-22b(+)自带)，多克隆位点的结构如下5’-Nde I-Trx-GCGGGATCCGG AATTCGA…-Sac I-Sal I-Hind III-Not I-XhoI-6His-TAG-3’RBS EcoR I。
2、原核表达载体pTIG-Trx-Hc的获得以实施例1获得的质粒pGEM-Hc为模板，在引物F-HcE5’-GCCGGAATTC GAATACATCAAGAACATCATC-3’(带单下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点，方框内碱基为终止密码子，带双下划线碱基为起始密码子)和引物R-HcX5’-CTAGCTCGAGAGTGGACGTTCACCCCAAC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点)的引导下，PCR扩增全长HcA基因序列，并在序列两端分别添加EcoR I和Xho I识别位点，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收长度约1300bp的目的片段并对其进行纯化，将回收片段用EcoR I和Xho I进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pTIG-Trx连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的HcA的原核表达载体，命名为pTIG-Trx-Hc。
二、HcA在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化1、HcA在大肠杆菌中的表达及表达产物的SDS-PAGE检测将步骤一构建的HcA的原核表达载体pTIG-Trx-Hc转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN公司)，筛选阳性重组子，以转化有pTIG-Trx空载体的重组菌为阴性对照，然后按1∶100的比例将阳性重组菌接种至含100mg/mL氨苄青霉素的1000mL LB液体培养基中，在37℃、250rpm下进行大量培养，培养至对数生长期(OD600约为0.4-0.6)时加入化学诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L，在30℃下继续诱导培养5小时，分别于诱导前、诱导3小时和5小时后取样。培养结束后，超声打碎细胞，离心收集上清进行12％SDS-PAGE检测，结果如图2所示(泳道1为诱导5小时的表达产物，泳道2为诱导3小时的表达产物，泳道3为蛋白标准分子量，泳道4为未诱导对照，泳道5为空载体对照)，结果显示经诱导表达的重组蛋白以可溶性方式表达，分子量约为50KD，与预期的分子量一致，而未诱导的菌株和诱导的空载体对照未出现该目的蛋白带，说明所表达的蛋白可能就是目的蛋白HcA，且由图2可以看出，在30℃下诱导表达3小时后蛋白的表达量可达到较高水平，经分析，表达产物约占细菌可溶性总蛋白的36％，5小时后可达53％。
2、表达产物的纯化、Western blot和ELISA鉴定及稳定性检测1)目的蛋白的纯化步骤1所表达的重组蛋白HcA的C端含有六个组氨酸标签，因此用Ni-NTA亲和层析柱(购自法玛西亚公司)并参照说明书对可溶性表达产物进行纯化，纯化方法为先将超声上清与平衡后的Ni-NTA亲和层析树脂结合，然后用含10-100mM咪唑(10T和100mM的浓度均进行洗涤)的结合缓冲液洗涤，再用含500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱，得到纯化蛋白，然后对经纯化的蛋白进行12％SDS-PAGE检测，检测结果如图3所示(泳道1为低分子量蛋白Marker，分子量范围14.4-116KD，泳道2为经含500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱后得到的纯化产物，泳道3为PBS透析脱盐后的产物)，检测结果表明得到了高纯度的目的蛋白，经薄层扫描分析，纯化到的蛋白质纯度达95％，产量可达30mg/L以上。
2)表达产物的Western blot和ELISA鉴定分别以鼠抗His-tag mAb(购自MERCK)和马源抗BONT/A多抗(购自中国药品生物制品检定所)为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)或HRP标记兔抗马IgG(购自北京中杉金桥生物有限公司)为二抗对空载体对照、诱导表达的超声上清及纯化的重组蛋白进行Western blot分析，结果诱导表达或经纯化的重组蛋白与鼠抗His-tag mAb和马源抗BoNT/A多抗均能特异性结合，大小位置与电泳位置一致，分子量约为50KD，表明诱导表达或经纯化的重组蛋白即为目的蛋白HcA。另外，还用A型肉毒抗毒素对空载体对照、诱导表达的超声上清及纯化的重组蛋白进行了ELISA检测，结果A型肉毒抗毒素与表达并经纯化的BoN/A HcA蛋白具有特异结合活性，而与空载体诱导表达产物不结合，表明重组表达蛋白具有天然蛋白的分子构象，可以被特异性抗毒素所识别。
3)重组蛋白HcA的稳定性检测从上述表达及纯化过程中可见，表达的重组蛋白HcA比较稳定，在表达及纯化过程中没有发生降解。为了进一步鉴定纯化的重组蛋白HcA在保存条件下的稳定性，对在不同温度下保存一定时期(4℃(1个月)，-20℃和-80℃(3个月和6个月))的重组蛋白HcA进行12％SDS-PAGE检测，结果纯化的重组蛋白HcA在4℃(1个月)，-20℃和-80℃(3个月和6个月)均保持稳定，即使是经反复冻融也没有发生降解，表明本发明用上述方法表达获得的重组HcA具有较高的稳定性。
实施例3、重组HcA蛋白亚单位疫苗免疫小鼠后体液和细胞免疫水平检测及体内中和活性测定以实施例2中表达并经纯化的重组蛋白HcA作为亚单位疫苗免疫小鼠，以检测其免疫原性，具体方法为将Balb/c小(6-8周龄，雌性，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为4组，每组6只，免疫组I、II和III分别免疫10μg、5μg和1μg重组蛋白HcA，而对照组免疫不含重组蛋白HcA的PBS。免疫前，将重组蛋白HcA溶于200μlPBS，再与相同剂量的福氏完全佐剂(Sigma公司)按1∶1比例混合完全，然后皮下多点注射进行初次免疫，2周后将相同剂量的重组蛋白HcA溶于200μl PBS后与相同剂量的福氏不完全佐剂(Sigma公司)按1∶1比例混合完全皮下多点注射进行加强免疫，2周后再以相同剂量进行加强免疫一次，皮下多点及腹腔注射免疫一次。每次免疫前，以及最后一次免疫后第2和第4周，小鼠尾部或眼球采血，分离血清，用ELISA法(用酶联免疫板包被HcA抗原，浓度为2μg/mL，用分离的免疫小鼠血清为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)为二抗)测定血清抗体。淋巴细胞的增殖能力是细胞免疫应答的一个重要指标，用MTS法测定淋巴细胞的增殖能力，方法为最后一次免疫后第4周取脾细胞，制备浓度为106个/mL的脾细胞悬液，在体外用抗原HcA，浓度为10μg/mL进行刺激，4天后用MTS法检测T细胞增殖能力。
ELISA检测结果免疫一次后，免疫组I(10μg高剂量组)、II(5μg中剂量组)和III(1μg低剂量组)血清抗体滴度分别达到12800、6400和3200，随着免疫次数的增加，抗体滴度也得到相应提高，免疫4次后即可产生高水平的抗体滴度，分别达409600、409600和204800，并且对照免疫组血清与免疫前相比始终为阴性，上述检测结果表明重组蛋白HcA免疫小鼠后可使其体内产生较高滴度的特异性抗体。
淋巴细胞的增殖能力的MTS法测定结果表明免疫组小鼠体内诱导产生了特异的T细胞免疫反应，其SI值分别为1.9、2.5和2.4，而对照免疫组小鼠的SI值为1.1(P＜0.05，差异显著)。
上述检测结果表明各剂量免疫组均能够诱导动物产生特异性的高滴度抗体并可引起细胞免疫应答。
此外，还用经典的体内中和实验测定了免疫小鼠血清抗体的体内中和活性及中和抗体效价，方法为将免疫组I、II和III血清抗体按1∶10稀释后能够保护10LD50和100LD50A型肉毒毒素的攻击；然后，进一步将免疫组I血清抗体分别按1∶10、1∶100、1∶1000和1∶10000比例进行稀释后，用10LD50和100LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，国际标准株，购自兰州生物制品研究所)进行攻击，结果血清抗体按1∶1000稀释时能够完全保护10LD50A型肉毒毒素的攻击，血清抗体按1∶10000比例稀释时，也能部分保护10LD50A型肉毒毒素的攻击，上述结果表明免疫小鼠血清中含有较高水平的A型肉毒毒素中和抗体，免疫血清也可中和体内A型肉毒毒素，预防中毒，因此，本发明的HcA可用于制备高滴度免疫血清，用于体内中和A型肉毒毒素(抗毒素)或用于制备A型肉毒毒素亚单位疫苗。
实施例4、检测重组HcA蛋白亚单位疫苗免疫小鼠后对A型肉毒毒素的保护作用实施例3的实验结果表明1μg重组蛋白HcA免疫小鼠3次后即可产生高滴度的抗体水平和中和抗体，用下述方法进一步评价重组蛋白HcA免疫小鼠后对A型肉毒毒素保护作用用1μg重组蛋白HcA按实施例3的方法免疫二或三次的Balb/c小鼠(6-8周龄，雌性，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心)进行攻毒试验，以PBS免疫的小鼠为对照，统计存活率及时间，首先对1μg重组蛋白HcA免疫二次的小鼠用104LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，国际标准株，购自兰州生物制品研究所)进行攻毒，结果如表1所示，表明其能保护A型肉毒毒素攻击，随后加大剂量，用105或106LD50A型肉毒毒素对二次免疫的其它组小鼠以及用105和106LD50A型肉毒毒素对经三次免疫的小鼠进行攻毒，结果如表1所示，表明这些免疫组小鼠均可保护A型肉毒毒素攻击，并且免疫组小鼠无异常症状，但对照组小鼠用102LD50A型肉毒毒素进行攻毒，小鼠均发生肉毒毒素中毒症状，在5小时内死亡。以上试验结果表明，HcA具有良好的免疫原性，以1μg剂量免疫二次即可保护106LD50A型肉毒毒素的攻击，故可用于制备A型肉毒毒素亚单位疫苗，以预防A型肉毒毒素中毒。
表1 重组蛋白HcA免疫小鼠保护A型肉毒毒素攻毒的试验结果

实施例5、HcA的SFV复制子载体和传统真核表达载体的构建用下述方法构建含有本发明基因HcA的SFV复制子载体和传统的真核表达载体一、HcA的SFV复制子载体的构建pSFV1为Invitrogen公司的基于RNA的复制子表达载体，本发明的发明人以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1为骨架，通过在5′UTR上游克隆入CMV启动子，在3′UTR下游插入BGH转录终止子序列和自我剪切核酶HDVr序列，将其改造成基于DNA的复制子载体系统，命名为pSCAR，该载体的部分结构示意图见图4中的图A，该复制子载体可在体内外高水平表达外源基因，其详细构建方法见文献(余云舟等，生物化学与生物物理进展，2006，33(1)87-94)。首先，以质粒pGEM-Hc为模板，在引物F-HcN5’-GCCGCATATGGGAATACATCAAGAACATCATCAATACCTCC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nde I识别位点)和序列R-HcC5’-TGACATCGATTTACAGTGGACGTTCACCCCAAC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Cla I识别位点)的引导下，PCR扩增长度约为1.3kb基因HcA的全长序列，回收并纯化该目的片段后，将其用限制性内切酶Nde I和Cla I进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pSCARS(在pSCAR的引入一个分泌信号肽编码序列(即Ig□-chain leader sequence，命名为S(来源于pSecTag，Invitrogen公司)，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO6，编码序列表中SEQ ID NO7的氨基酸序列)后得到的重组载体，该序列位于pSCAR的BamH I和Nde I酶切位点之间)连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的HcA的SFV复制子载体，命名为pSCARSHc，其部分结构示意图见图4中的图A。
二、HcA的传统的真核表达载体的构建将步骤一构建的含HcA的SFV复制子载体pSCARSHc用限制性内切酶BamH I和SpeI进行双酶切后，回收并纯化约2.0Kb的含有基因HcA的DNA片段，将其与经相同酶双酶切的载体的pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的HcA的传统真核表达载体，命名为pcDNASHc，其部分结构示意图见图4中的图B。
实施例6、HcA的SFV复制子载体和传统真核表达载体体外表达A型肉毒毒素受体结合区Hc的检测首先，将pSCARSHc转染BHK21细胞和CHO细胞(均购自ATCC公司)，以pSCAR空载体为对照，分别以实施例3获得的重组蛋白HcA免疫小鼠后获得的多抗血清和A型肉毒毒素抗毒素多抗(购自卫生部北京生物制品研究所)为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)和HRP标记兔抗马IgG(购自北京中杉金桥生物有限公司)为二抗，用免疫荧光法(IFA)检测经pSCARSHc转染的BHK21细胞和CHO细胞，结果均呈阳性，而pSCAR空载体转染细胞无荧光，检测结果表明HcA在转染细胞中得到了表达。
然后，提取经pSCARSHc转染的BHK21细胞和CHO细胞，以及pSCAR空载体转染细胞的总蛋白，再对上述总蛋白及上述转染细胞的培养上清液，分别以重组蛋白HcA免疫小鼠后获得的多抗血清和A型肉毒毒素抗毒素多抗为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)和HRP标记兔抗马IgG(购自北京中杉金桥生物有限公司)为二抗进行Western blot检测，结果经pSCARSHc转染的BHK21细胞和CHO细胞，及其培养上清在50kDa位置有特异条带产生，与HcA重组蛋白大小一致，而对照细胞中则无此条带，表明HcA在pSCARSHc转染细胞中获得表达，pSCARSHc转染细胞的培养上清中也含有BoNT/A Hc抗原，上述结果表明含分泌信号肽序列及HcA的SFV复制子载体能够有效地分泌表达BoNT/A Hc抗原，即HcA。
另外，还用ELISA法检测了分别经pSCARSHc、pcDNASHc转染的BHK21细胞和CHO细胞的裂解液与培养上清与A型肉毒抗毒素多抗和重组蛋白HcA免疫小鼠后获得的多抗血清的特异结合活性，以pSCAR空载体转染细胞为对照，结果pSCARSHc和pcDNASHc转染细胞的细胞裂解液与培养上清均能与A型肉毒抗毒素多抗和重组蛋白HcA免疫小鼠后获得的多抗血清特异结合，而与空载体对照不结合，表明重组表达蛋白HcA具有天然蛋白的分子构象，可以特异性被A型肉毒抗毒素多抗识别。
实施例7、HcA的SFV复制子载体和传统真核表达载体疫苗的免疫原性比较经研究发现，复制型DNA载体在低剂量时就可诱导产生良好的免疫反应，其用量远远低于传统DNA载体(Leitner WW，et al.，Cancer research，2000，60(1)51-55)。本实施例对不同剂量的HcA的SFV复制子载体(3-100μg)免疫小鼠后的免疫应答反应进行了评价，同时以HcA的传统DNA真核表达载体为对照。具体方法为分别用3μg、30μg和100μg的SFV复制子载体pSCARSHe和传统DNA载体pcDNASHc分别免疫Balb/c小鼠(6-8周龄，雌性，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心)，每个剂量组6只小鼠，免疫途径为腿部肌肉注射，共免疫4次，间隔2周，以pSCAR空载体免疫组为对照。免疫结束后28天，用ELISA法检测小鼠的体液免疫水平，用免疫后小鼠血清为一抗，用以HRP标记羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)为二抗测定血清抗体。淋巴细胞的增殖能力是细胞免疫应答的一个重要指标，还用MTS法测定淋巴细胞的增殖能力，方法为最后一次免疫后第4周取脾细胞，制备浓度为106个/mL的脾细胞悬液，在体外用抗原HcA进行刺激，4天后用MTS法检测T细胞增殖能力。
ELISA法检测结果为3μg和30μg SFV复制子载体pSCARSHc免疫小鼠的体液抗体水平高于100μg免疫组的抗体水平(P＜0.05，说明差异显著)，是后者的6-7倍，达到12800-25600，表明DNA复制子疫苗在较低剂量时能够诱导产生更强的免疫反应，而在较高的剂量(100μg)时反而不能产生良好的免疫反应，这种表现正是复制子疫苗的特点，也与大多数已报道的试验结果一致。而与传统DNA载体相比，复制子载体在低剂量时产生更高的抗体水平(P＜0.01，说明差异极显著)，在3μg时提高了近50倍，30μg提高了13倍以上，体现了DNA复制子疫苗用量少，效果好的优点。
MTS测定结果表明HcA的SFV复制子载体pSCARSHc和传统DNA载体pcDNASHc疫苗的各免疫组均诱导产生了特异的T细胞免疫反应(P＜0.05，与空载体对照相比)，与100μg免疫组相比，复制子疫苗在3μg和30μg时可诱导较高T细胞增殖反应(P＜0.01)，复制子疫苗各免疫组显著地高于传统DNA疫苗免疫组(P＜0.05)，尤其是在低剂量时前者极显著地高于后者(P＜0.01)。
上述检测结果表明，HcA的SFV复制子载体pSCARSHc和传统DNA载体pcDNASHc免疫小鼠后都能诱导产生特异性的体液免疫应答，经多次加强免疫后可达到一个相当高的水平，高于国外Hc核酸疫苗的同剂量报道水平，并且与传统DNA载体相比，SFV复制子载体在低剂量时可诱导体内产生更高的抗体水平和细胞免疫水平，说明SFV复制子疫苗具有更好的免疫效果。
实施例8、检测HcA的SFV复制子载体疫苗免疫小鼠后对A型肉毒毒素保护作用将30μg的HcA的SFV复制子载体pSCARSHc免疫Balb/c小鼠(6-8周龄，雌性，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心)，共免疫3次，间隔两周，免疫结束后用ELISA法检测体液免疫水平。结果攻毒试验前免疫组抗体滴度为1600-3200。然后进行攻毒试验，方法为以pSCAR空载体免疫的小鼠为对照，统计抗体滴度及存活率，首先对上述经30μg的HcA的SFV复制子载体pSCARSHc免疫3次的Balb/c小鼠用102LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，国际标准株，购自兰州生物制品研究所)进行攻毒，结果如表2所示，表明SFV复制子载体pSCARSHc免疫小鼠3次即可完全保护102LD50A型肉毒毒素的攻击，但对照组小鼠用102LB50A型肉毒毒素进行攻毒，小鼠均发生肉毒毒素中毒症状，在5小时内死亡；随后加大剂量，分别用103、106LD50A型肉毒毒素对3次免疫的小鼠进行攻毒，结果如表2所示，免疫组小鼠可保护103LD50A型肉毒毒素攻击，并且免疫组小鼠无异常症状，但106LD50A型肉毒毒素攻击组小鼠发生肉毒毒素中毒症状(与对照组相比，其中毒较轻，死亡时间延后)。以上试验结果表明，本发明的HcA的SFV复制子载体疫苗具有良好的免疫原性，以30μg剂量免疫3次即可保护103LD50A型肉毒毒素的攻击，故可用于制备A型肉毒毒素核酸疫苗，以预防A型肉毒毒素中毒。
表2 HcA的SFV复制子核酸疫苗免疫小鼠对保护A型肉毒毒素攻毒试验结果

实施例9检测HcA的SFV复制子核酸疫苗和HcA亚单位疫苗联合应用免疫小鼠后的体液和细胞免疫水平及对A型肉毒毒素的保护作用实施例7和实施例8的实验结果表明HcA的SFV复制子核酸疫苗经多次免疫后诱导体内产生了较高的抗体水平，但与重组蛋白HcA免疫组相比，还是有很大的差距，故其可能产生的保护作用不够高，为了进一步提高HcA的SFV复制子核酸疫苗的免疫原性，将HcA复制子核酸疫苗和HcA亚单位疫苗联合应用免疫小鼠检测体液和细胞免疫水平及对A型肉毒毒素的保护作用，具体方法为将Balb/c小(6-8周龄，雌性，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为4组，每组6或8只，组1、组2和组3先用30μg的HcA的SFV复制子载体pSCARSHc免疫2次，间隔两周，再将重组蛋白HcA溶于200μl PBS，然后与相同剂量的福氏完全佐剂(Sigma公司)按1∶1比例混合完全，皮下多点注射免疫1次，同时组4为对照组，用相同剂量的pSCARSHc免疫3次。免疫结束后2周，小鼠尾部或眼球采血，分离血清，用ELISA法检测体液免疫水平。ELISA检测结果表明，HcA亚单位疫苗加强免疫后能够大幅度地提高体内抗体水平，联合应用组产生的抗体水平与亚单位疫苗免疫组的水平相当，并且远远高于SFV复制子核酸疫苗组(P＜0.01)，显著提高了SFV复制子核酸疫苗的抗体水平，另外细胞免疫水平也得到了增强。然后进行攻毒试验，方法为统计抗体滴度及存活率，首先对上述经3次免疫的4组Balb/c小鼠用102、104、105和106LD50A型肉毒毒素(BoNT/A，A62，国际标准株，购自兰州生物制品研究所)进行攻毒，结果如表3所示，表明HcA亚单位疫苗加强免疫后能够大幅度地提高免疫小鼠对A型肉毒毒素的保护作用，联合免疫组小鼠可保护104LD50A型肉毒毒素攻击，但对照组组4的小鼠用102LD50A型肉毒毒素进行攻毒，小鼠即发生肉毒毒素中毒症状，在5小时内死亡；随后加大剂量，分别用105、106LD50A型肉毒毒素对3次免疫的联合免疫组小鼠进行攻毒，结果如表3所示，免疫组小鼠对105、106LD50A型肉毒毒素攻击均可保护，并且免疫小鼠无异常症状。上述实验结果表明，HcA的SFV复制子核酸疫苗初次免疫和HcA亚单位疫苗加强免疫策略(DNA-primeprotein-booster)能够大幅度提高核酸疫苗的特异性体液免疫水平和细胞免疫水平，并能提高核酸疫苗的保护能力，故在提高A型肉毒毒素保护效果和减少核酸疫苗的免疫次数，以及丰富免疫应答途经等方面是一种良好的免疫策略，可用于研制A型肉毒毒素疫苗。
表3 HcA的SFV复制子核酸疫苗和HcA亚单位疫苗联合应用免疫小鼠后保护A型肉毒毒素攻毒试验结果

序列表<160>8<210>1<211>1287<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gaatacatca agaacatcat caatacctcc atcctgaacc tgcgttacga atccaatcac60ctgatcgacc tgtctcgtta cgcttccaaa atcaacatcg gttctaaagt taacttcgat120ccaatcgaca agaatcagat ccagctgttc aatctggaat cttccaaaat cgaagttatc180ctgaagaatg ctatcgtata caactctatg tacgaaaact tctccacctc cttctggatt240cgtatcccaa aatacttcaa ctccatctct ctgaacaatg aatacaccat catcaactgc300atggaaaaca attctggttg gaaagtatct ctgaactacg gtgaaatcat ctggactctg360caggacactc aggaaatcaa acagcgtgtt gtattcaaat actctcagat gatcaacatc420tctgactaca tcaatcgttg gatcttcgtt accatcacca acaatcgtct gaataactcc480aaaatctaca tcaacggccg tctgatcgac cagaaaccaa tctccaatct gggtaacatc540cacgcttcta ataacatcat gttcaaactg gacggttgcc gtgacactca ccgttacatc600tggatcaaat acttcaatct gttcgacaaa gaactgaacg aaaaagaaat caaagatctg660tacgacaacc agtccaattc tggtatcctg aaagacttct ggggtgacta cctgcagtac720gacaaaccat actacatgct gaatctgtac gatccaaaca aatacgttga cgtcaacaat780gtaggtatcc gtggttacat gtacctgaaa ggtccacgtg gttctgttat gactaccaac840atctacctga actcttccct gtaccgtggt accaaattca tcatcaagaa atacgcgtct900ggtaacaagg acaatatcgt tcgtaacaat gatcgtgtat acatcaatgt tgtagttaag960aacaaagaat accgtctggc taccaatgct tctcaggctg gtgtagaaaa aatcttgtct1020gctctggaaa tcccagacgt tggtaatctg tctcaggtag ttgtaatgaa atccaagaac1080gaccagggta tcactaacaa atgcaaaatg aatctgcagg acaacaatgg taacgatatc1140ggtttcatcg gtttccacca gttcaacaat atcgctaaac tggttgcttc caactggtac1200aatcgtcaga tcgaacgttc ctctcgtact ctgggttgct cttgggagtt catcccagtt1260gatgacggtt ggggtgaacg tccactg1287
<210>2<211>429<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400> 2Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr1 5 10 15Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn20 25 30Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln35 40 45Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala50 55 60Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile65 70 75 80Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr85 90 95Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn100 105 110Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln115 120 125Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile130 135 140Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser145150 155 160Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn165 170 175Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly180 185 190
Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe195 200 205Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln210 215 220Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr225 230 235 240Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val245 250 255Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro260 265 270Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr275 280 285Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp290 295 300Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys305 310 315 320Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu325 330 335Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser Gln340 345 350Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys Cys355 360 365Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile Gly370 375 380Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp Tyr385 390 395 400Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp Glu405 410 415Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu420 425<210>3<211>484<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gaatacatca agaacatcat caatacctcc atcctgaacc tgcgttacga atccaatcac60ctgatcgacc tgtctcgtta cgcttccaaa atcaacatcg gttctaaagt taacttcgat120ccaatcgaca agaatcagat ccagctgttc aatctggaat cttccaaaat cgaagttatc180ctgaagaatg ctatcgtata caactctatg tacgaaaact tctccacctc cttctggatt240cgtatcccaa aatacttcaa ctccatctct ctgaacaatg aatacaccat catcaactgc300atggaaaaca attctggttg gaaagtatct ctgaactacg gtgaaatcat ctggactctg360caggacactc aggaaatcaa acagcgtgtt gtattcaaat actctcagat gatcaacatc420tctgactaca tcaatcgttg gatcttcgtt accatcacca acaatcgtct gaataactcc480aaaa 484<210>4<211>413<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4tctacatcaa cggccgtctg atcgaccaga aaccaatctc caatctgggt aacatccacg60cttctaataa catcatgttc aaactggacg gttgccgtga cactcaccgt tacatctgga120tcaaatactt caatctgttc gacaaagaac tgaacgaaaa agaaatcaaa gatctgtacg180acaaccagtc caattctggt atcctgaaag acttctgggg tgactacctg cagtacgaca240aaccatacta catgctgaat ctgtacgatc caaacaaata cgttgacgtc aacaatgtag300gtatccgtgg ttacatgtac ctgaaaggtc cacgtggttc tgttatgact accaacatct360acctgaactc ttccctgtac cgtggtacca aattcatcat caagaaatac gcg 413<210>5
<211>390<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5tctggtaaca aggacaatat cgttcgtaac aatgatcgtg tatacatcaa tgttgtagtt60aagaacaaag aataccgtct ggctaccaat gcttctcagg ctggtgtaga aaaaatcttg120tctgctctgg aaatcccaga cgttggtaat ctgtctcagg tagttgtaat gaaatccaag180aacgaccagg gtatcactaa caaatgcaaa atgaatctgc aggacaacaa tggtaacgat240atcggtttca tcggtttcca ccagttcaac aatatcgcta aactggttgc ttccaactgg300tacaatcgtc agatcgaacg ttcctctcgt actctgggtt gctcttggga gttcatccca360gttgatgacg gttggggtga acgtccactg 390<210>6<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6atggagacag acacactcct gctctgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt60gac 63<210>7<211>21<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp20<210>8<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8agcgataaaa ttattcacct gactgacgac agttttgaca cggatgtact caaagcggac60ggggcgatcc tcgtcgattt ctgggcagag tggtgcggtc cgtgcaaaat gatcgccccg120attctggatg aaatcgctga cgaatatcag ggcaaactgg ccgttgcaaa actgaacatc180gatcaaaacc ctggcactgc gccgaaatat ggcatccgtg gtatcccgac tctgctgctg240ttcaaaaacg gtgaagtggc ggcaaccaaa gtgggtgcac tgtctaaagg tcagttgaaa300gagttcctcg acgctaatct ggcggga32权利要求
1.A型肉毒毒素受体结合区Hc基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激发机体对A型肉毒毒素产生免疫保护作用的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白。
3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)将序列表中SEQ ID NO2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有激发机体对A型肉毒毒素产生免疫保护作用的蛋白质。
4.含有权利要求1所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述含有权利要求1所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组原核表达载体中所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的上游还连接有硫氧还蛋白Trx基因；用于构建所述含有A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组原核表达载体的出发载体为pET-22b(+)、pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a；以pET-22b(+)为出发载体，构建的含有所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因和硫氧还蛋白基因的重组原核表达载体为pTIG-Trx-Hc。
6.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于用于构建含有权利要求1所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的传统真核表达载体的出发载体为pcDNA、pCMV5、pSilence1.0-U6、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5；以pcDNA3.1(+)为出发载体，构建的含有所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组真核表达载体为pcDNASHc。
7.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述含有权利要求1所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组原核表达载体中所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的5’端还连接有分泌信号肽S编码序列，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO6，编码序列表中SEQ ID NO7的氨基酸序列；用于构建含有所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的复制子表达载体的出发载体为pSCAR；以pSCAR为出发载体，构建的含有A型肉毒毒素受体结合区Hc基因和分泌信号肽S编码序列的复制子表达载体为pSCARSHc。
8.一种表达权利要求2或3所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因编码蛋白的方法，是将含有权利要求1所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到A型肉毒毒素受体结合区Hc基因编码蛋白。
9.权利要求1所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因在制备A型肉毒毒素核酸疫苗中的应用。
10.权利要求2或3所述A型肉毒毒素受体结合区Hc基因编码蛋白在制备A型肉毒毒素亚单位疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个A型肉毒毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一个A型肉毒毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白与其在制备A型肉毒毒素疫苗中的应用。该基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激发机体对A型肉毒毒素产生免疫保护作用的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的A型肉毒毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白将在制备A型肉毒毒素疫苗中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/66GK101054582SQ200710089588
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月3日 优先权日2006年10月23日
发明者俞炜源, 余云舟, 孙志伟, 刘志刚, 王双 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所